Sau khi thuỷ phân sụn cá trong 48 giờ, ở 55oC, với 70ml ETM/1kg sụn, dịch sau thủy phân được ly tâm 10.000v/phút trong 15phút. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủạ Tuy nhiên phụ thuộc vào nồng độ ethanol mà có thể thu được hàm lượng CS cao nhất. Từ dịch chứa CS sau thủy phân, sử dụng các nồng độ ethanol khác nhau để khảo sát sự thu hồi CS hiệu quả nhất. Sau
24 giờ tại 4ºC, các polysacharid kết tủa được thu hồi bằng cách ly tâm ở tốc độ 12.000 v/phút tại 4ºC trong 30 phút. Kết quả bảng 3.3 cho thấy với tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 3 thể tích ethanol (nồng độ ethanol khoảng 75%) cho hiệu quả kinh tế nhất khi thu nhận CS. Hàm lượng CS gần tương đương và hàm lượng protein ít hơn so với sử dụng tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích ethanol.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi CS
Tỷ lệ (V mẫu/V
ethanol)
Hàm lượng CS (mg) trong tủa thu được/5ml dịch CS sau thủy
phân
Hàm lượng protein (mg) trong tủa thu được/5ml dịch CS sau thủy
phân 1:0,5 9,85 6,15 1:1 19,15 7,40 1:2 240,50 18,10 1:3 261,50 18,70 1:4 269,50 20,50
Chế phẩm CS tinh sạch sơ bộ (thô) được xác định hàm lượng CS bằng phương pháp DMMB. Kết quả bảng 3.3 cho thấy khối lượng chế phẩm CS thô sấy khô đạt khoảng 28,2% (± 3,06) trên khối lượng xương sụn cá khô. Hàm lượng CS trong chế phẩm thô khô (hàm ẩm < 2%) đạt 53,6% (± 4,51) khối lượng chế phẩm CS thu được. Chế phẩm CS sơ bộ tinh sạch bằng protease và tủa ethanol 75% đã loại bỏ được phần lớn các protein liên kết với CS trong sụn cá và các hợp chất màu trong dịch sau thủy phân.
Bảng 3.4. Hàm lượng CS trong chế phẩm tinh sạch sơ bộ
Chế phẩm CS thô (Hàm ẩm < 2%) Enzym % khối lượng chế phẩm CS/
khối lượng sụn khô % CS/ khối lượng chế phẩm
ETM 28,2 ± 3,06 53,6 ± 4,51
Chế phẩm CS thô đồng thời được đưa đi phân tích, đánh giá chất lượng tại Trung tâm Phân tích và Giám định Thực phẩm Quốc gia, Viện Công nghệ Thực phẩm. Kết quả đánh giá của Trung tâm cho thấy chế phẩm CS thô có hàm lượng CS đạt khoảng 50,1%, kết quả phân tích này gần tương tự như kết quả phân tích bằng phương pháp DMMB (53,6%) (xem kết quả đánh giá ở phần phụ lục).