theo Farndale và cộng sự
* Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Dựa trên sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ của DMMB (1,9- Dimethylmethylene blue) khi tác dụng với glycosaminoglycan sulfate, dùng đồ thị đường chuẩn của CS4 để thấy mối quan hệ giữa tuyến tính hấp thụ ở bước sóng 525nm của phức chất DMMB và CS. Phương pháp DMMB rất nhạy có thể định tính và định lượng CS với khối lượng rất nhỏ (µg).
* Vật liệu và hóa chất
- Các dung dịch CS4 chuẩn với các nồng độ khác nhau (1, 2, 4, 6 và 8µg/ml). - Dung dịch thuốc thử DMMB pha sẵn.
* Xây dựng đồ thị chuẩn CS4
Bảng 2.2. Xác định đường cong chuẩn CS4
STT CS4 (µl) H2O (µl) Lượng CS4 (µg) Dung dịch DMMB (ml) 1 0 100 0 0,9 2 1 99 1 0,9 3 2 98 2 0,9 4 4 96 4 0,9 5 6 94 6 0,9 6 8 92 8 0,9
Chuẩn bị dung dịch CS4 chuẩn với nồng độ 1mg/ml. Xây dựng đường cong biểu diễn sự thay đổi của các giá trị OD đo được ở bước sóng 525 nm theo sự thay đổi của nồng độ CS4 (µg CS4/ml) (bảng 2.2). Dựa trên số đọc (OD) thu được đối chiếu với đồ thị chuẩn CS4 (phần phụ lục) để tính ra lượng CS dịch nghiên cứụ
2.2.4. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry
* Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Phương pháp Lowry dựa trên nguyên tắc sau: Sự tạo thành phức hợp của đồng và protein trong dung dịch kiềm, phức hợp của đồng và protein khử phosphomolybdic – phosphotungstate tạo dung dịch màu xanh đậm.
Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định từ 20-200µg protein/ml.
* Vật liệu và hóa chất
- Dung dịch BSA (bovine serum albumin) có nồng độ khác nhau (0,4; 0,8; 1,2; 1,6 và 2,0mg/ml)
- Thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần.
- Thuốc thử A: 1,56g CuSO4.5H2O/100ml nước cất. - Thuốc thử B: 2,37g sodium tartarte/100ml nước cất. - Thuốc thử C: 2g NaOH + 10g Na2CO3/500ml nước cất. - Thuốc thử D: 100ml C+1ml A+1ml B.
* Xây dựng đồ thị chuẩn Protein
Bảng 2.3. Xác định đường cong chuẩn protein
STT Protein (µl) H2O (µl) Lượng Protein (mg) Dung dịch D (ml) Thuốc thử Folin (µl) 1 0 100 0,00 1 100 2 20 80 0,04 1 100 3 40 60 0,08 1 100 4 60 40 0,12 1 100 5 80 20 0,16 1 100 6 100 0 0,20 1 100
Chuẩn bị dung dịch BSA 2mg/ml. Xây dựng đường cong biểu diễn sự thay đổi của các giá trị OD đo được ở bước sóng 660 nm theo sự thay đổi của nồng độ protein BSA (mg BSA/ml) (bảng 2.3). Dựa trên số đọc (OD) thu được đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (phần phụ lục) để tính ra lượng protein trong dịch nghiên cứụ
2.2.5. Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate
- Chuẩn bị mẫu: Xương sụn cá nghiền nhỏ, 10g xương sụn thêm vào 40 ml nước khử ion, 1ml azid natri (0,02%).
- Sử dụng phương pháp thủy phân xương sụn cá đuối, cá nhám bằng enzym papain từ nhựa đu đủ [47], bằng enzym protease ngoại bào B26 và enzym ETM.
- Sử dụng ethanol thu tủa CS và phân tách các tạp chất khác [55].
- Sử dụng các muối như cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) hoặc cetylpyridium chloride (CPC), tạo tủa và tinh chế thu CS. Các glycosaminoglycan khác, các collagen và hyaluronic acid phần lớn sẽ bị loại bỏ [23].
2.2.6. Xác định một số tính chất và chất lượng của chế phẩm Chondroitin sulfate 2.2.6.1. Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm Chondroitin sulfate 2.2.6.1. Xác định độ bền nhiệt của chế phẩm Chondroitin sulfate
Tiến hành xử lý nhiệt chế phẩm CS tinh sạch ở 3 mức nhiệt độ khác nhau: 50oC, 70oC và 90oC trong 6giờ bằng phương pháp sấy thông thường trong tủ ổn nhiệt và so sánh với mẫu CS được đông khô. Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lạị
2.2.6.2. Xác định độ bền acid của chế phẩm Chondroitin sulfate
Tiến hành xử lý chế phẩm trong HCl 0,01M có pH=2 trong 1giờ. Kết thúc quá trình, kiểm tra mẫu bằng phản ứng màu DMMB để xác định hàm lượng CS còn lạị
2.2.6.3. Phương pháp xác định hàm ẩm
Áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi ở nhiệt độ 105oC. Độ ẩm của chế phẩm CS được tính theo công thức:
Trong đó:
mo: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng không đổi m1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy
m2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổị
2.2.6.4.Xác định vết kim loại nặng: gửi mẫu kiểm tại Viện Hóa Học
2.2.7. Bố trí thí nghiệm
2.2.7.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu nhận và tinh sạch Chondroitin sulfate
Nồng độ: 0,1-0,9ml/10g sụn T0: 300C– 700C
pH: 4,5 – 8,5
Thời gian: 4 - 60giờ Sụn cá B26 ETM Thủy phân bằng enzym Tủa dịch bằng ethanol Chế phẩm CS tinh sạch Dịch thủy phân chứa CS Tủa dịch bằng ethanol Ly tâm thu tủa
chứa CS
Thu tủa GAGS+ CPC/CTAB
Rửa tủa bằng NaCl
CPC/ CTAB
Thuyết minh quy trình:
1. Sụn cá
Sụn cá được thu thập từ vùng biển Hải Phòng, do phòng Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải Sản cung cấp.
2. Thuỷ phân
Sụn cá sau khi được nghiền nhỏ sử dụng enzym protease để thuỷ phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một proteoglycan.
3. Ly tâm, thu dịch chứa CS
Dịch sau khi được thuỷ phân đem ly tâm 1200v/phút để thu dịch chứa CS. Sử dụng ethanol ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủạ Sau đó tiếp tục ly tâm để thu tủa chứa CS. Hoà tủa trong nước khử ion bổ sung muối của ammonium (CPC- CTAB) để tạo tủa và tinh chế thu CS.
4. Rửa tủa
Dùng NaCl 0,4M để hoà tan các GAG gốc sulfate thấp trong phức hợp tủa CTAB-GAG và CPC-GAG. Sau khi loại bỏ các GAG gốc sulfate thấp như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC-GAG và CTAB-GAG chứa các GAG gốc sulfate cao, chủ yếu là CS. CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong các muối nồng độ cao 2,1M NaCl và tiếp tục đượctinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng ethanol để thu CS tinh khiết.
5. Chế phẩm CS tinh sạch
Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS tinh khiết đem đi sấy khô để bảo quản. Từ sơ đồ tổng quát trên sẽ tiến hành nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho từng quá trình nghiên cứu cụ thể.
2.2.7.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối thích cho hoạt động của protease ngoại bào B26 . protease ngoại bào B26 .
2.2.7.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích.
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) trong phản ứng thủy phân. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (B26) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 2,5ml enzym ở 400 C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch
trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình
bày trong phần 2.2.2.
Chế phẩm enzym B26
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 8,5 7,5 6,5 , 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 5 - Nhiệt độ: 400C - Thời gian: 2 giờ
2.2.7.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích của chế phẩm B-26
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân và pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym B26 cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2) và cùng 1 nồng độ enzym (2,5ml enzym B26 thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (4h, 8h, … ,
Chế phẩm enzym B26 700C 600C 500C 300C Sụn cá Thủy phân 400C - pH: Tối thích - Thời gian: 2giờ
- Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym B26 48h 44h ... 4h Sụn cá Thủy phân 8h - pH: Tối thích - Nhiệt độ: Tối thích - Nồng độ: 2,5mlenzym/10g sụn
44h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.1.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
2.2.7.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (pH tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.1, nhiệt độ tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.2, thời gian tối ưu được xác định ở mục 2.2.7.2.3 và tiến hành phản ứng ở các nồng độ enzym khác nhau (4 ml, 6ml, 8ml, 10ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp ). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.2.1, và xác định CS tương tự như đã mô tả ở mục
2.2.7.2.3.
Dịch thủy phân chứa CS
4ml/10g 6ml/10g 8ml/10g 10ml/10g Chế phẩm enzym B26 Sụn cá Thủy phân - pH: tối thích - Nhiệt độ: tối thích - Thời gian: tối thích
2.2.7.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm ETM phẩm ETM
2.2.7.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH tối thích
Với cùng một điều kiện thủy phân giống nhau, chỉ thay pH. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym ETM cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám.
Lấy 10g sụn cắt nhỏ, bổ sung 4ml H2O khử ion và cuối cùng cho 0,5ml enzym. Thay đổi pH của dung dịch đệm (Na-acetat (0,01M) ở pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate (0,01M) ở pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5) ở nhiệt độ 550C trong 6h, sau đó thu dịch sau thủy phân và tủa protein bằng TCA 7% với tỷ lệ 1/2, để qua đêm ở nhiệt độ 40C.
Các mẫu tủa bằng TCA được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên và xác định hàm lượng tyrosine bằng phương pháp Anson cải tiến như đã trình bày trong phần 2.2.2.
Dịch sau thủy phân được tủa bằng ethanol 96% và để qua đêm ở nhiệt độ -40C. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 20 phút để thu tủạ Hàm lượng CS trong tủa được xác định bằng phương pháp DMMB.
Dịch thủy phân chứa CS
9,5 Chế phẩm enzym ETM 8,5 7,5 6,5 4,5 Sụn cá Thủy phân 5,5 - Nhiệt độ: 550C - Thời gian: 6giờ
2.2.7.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ tối thích
Với cùng một điều kiện giống nhau, chỉ thay đổi nhiệt độ của phản ứng thủy phân 400C, 450C, 500C, 550C, 600C, 650C, 700C và cùng 1 nồng độ enzym (0,5ml enzym Etm thủy phân/10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân thời gian 6giờ. Dựa vào phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym protease (ETM) cho quá trình thủy phân xương sụn cá đuối và cá nhám. Tiến hành thí nghiệm và các bước xác định nồng độ tyrosine và CS trong các mẫu sau thủy phân tương tự như đã mô tả ở mục 2.2.7.3.1.
2.2.7.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích
400C ... 650C Chế phẩm enzym ETM 700C Sụn cá Thủy phân 450C - pH: Tối thích
- Thời gian: 6giờ
- Nồng độ:0,5ml enzym/10g sụn
Dịch thủy phân chứa CS
Chế phẩm enzym ETM 66h 60h ... 6h Sụn cá Thủy phân 12h - Nhiệt độ: tối thích - pH: tối thích - Nồng độ: 0,5ml enzym/10g sụn
Với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu) và cùng 1 nồng độ enzym enzym (0,5ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp và tiến hành thủy phân ở các thời gian khác nhau (6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 36h, 42h, 48h). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở trên.
2.2.7.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ tối thích
Với các điều kiện thủy phân tối ưu (nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu, thời gian tối ưu) đã được xác định ở trên, tiến hành thủy phân ở các nồng độ enzym khác nhau 0,1 ; 0,2; … ; 0,9ml enzym ETM thủy phân 10g xương sụn cá đuối, bổ sung 4ml dung dịch đệm thích hợp). Các bước tiếp theo xác định nồng độ tyrosine và CS tương tự như đã mô tả ở mục trên.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng student test ở mức ý nghĩa α= 0,05 - Vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excell. Chế phẩm enzym ETM 0,9ml/10g 0,8ml/10g ... 0,1ml/10g Thủy phân 0,2ml/10g
Dịch thủy phân chứa CS
- Nhiệt độ: tối thích - pH: tối thích
- Thời gian: tối thích
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH HÀM LƯỢNG CHONDROITIN
SULFATE CỦA M ẪU GỬI PHÂN TÍCH
Kết quả phân tích phổ NMR của Viện Hóa Học cho thấy sản phẩm là CS
Kết quả mẫu thô đem đi kiểm tại trung tâm phân tích cho hàm lượng CS là 50,1% và hàm lượng CS trong mẫu tinh sạch là 88,1%.
Sử dụng phương pháp DMMB kiểm tra hàm lượng CS trong mẫu thô và tinh song song cho kết quả 53,6% và 88,8%. Cho thấy:
Qui trình tách chiết và tinh chế của luận văn cho ra sản phẩm là CS.
Phương pháp DMMB trong trường hợp này (sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch của luận văn) dùng để phân tích hàm lượng CS là đáng tin cậy (cho kết quả gần đúng với trung tâm kiểm nghiệm).
Nhận xét: dùng phương pháp DMMB để khảo sát hàm lượng CS trong tất cả các thí nghiệm của luận văn. Các kết quả nghiên cứu của đề tài dựa trên phân tích định lượng CS bằng DMMB như sau:
3.1. Xác định hàm lượng Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) ở Việt Nam và cá nhám (Carcharhinus sorrah) ở Việt Nam
Sử dụng phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS trong mẫu sụn. Phương pháp dựa trên sự thay đổi phổ hấp thụ của 1,9 – dimethylmethylene blue khi gắn với các GAGs (glycosaminoglycans) [19]. Sử dụng CS4 và CS6 làm chất chuẩn đã
chỉ ra sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ CS và phổ hấp thụ ở bước sóng 525nm
theo phương trình hồi quy sau: y = 0,025x + 0,0825 với R2 = 0,943 và y= 0,0294x +
0,1092 với R2 = 0,992 có độ chính xác cao được chỉ ra ở hình 3 (phụ lục). Phương
pháp DMMB có độ nhạy cao có thể xác định CS với hàm lượng rất nhỏ (µg). Sự khác
nhau ở vị trí sulfate của CS4 và CS6 có thể ảnh hưởng đến phổ hấp phụ 525 nm. Các
nghiên cứu của các nhà khoa học nước ngoài cho thấy tỷ lệ CS4 ở phần lớn các mẫu
sụn của các loài động vật như bò, gà, cá sấu, cá đuối là cao hơn tỷ lệ CS6 [21], trừ sụn
