Nghiên cứu thu nhận lectin từ cây tỏi ta (allium sativum) và khảo sát khả năng ứng dụng làm thuốc bảo vệ cho rau cải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỖ NGỌC BẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ CÂY TỎI TA (Allium sativum) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LÀM THUỐC BẢO VỆ CHO RAU CẢI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỖ NGỌC BẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ CÂY TỎI TA (Allium sativum) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LÀM THUỐC BẢO VỆ CHO RAU CẢI LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 60540101 Quyết định giao đề tài: 138/QĐ-ĐHNT ngày 13/02/2015 Quyết định thành lập HĐ: 1037/QĐ-ĐHNT ngày 06/11/2015 Ngày bảo vệ: 14/12/2015 Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ ĐÌNH HÙNG TS NGUYỄN VĂN MINH Chủ tịch Hội đồng: Khoa sau đại học: KHÁNH HỊA – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới bảo thầy cô hƣớng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang - Trƣờng Đại học Nha Trang Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Khánh Hòa, ngày 18 tháng 12 năm 2015 Chữ ký Học viên Đỗ Ngọc Bảo iii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng (Trƣởng phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang) TS Nguyễn Văn Minh - Khoa Công nghệ thực phẩm - Trƣờng Đại học Nha Trang, anh chị phịng Cơng nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang, ngƣời tận tình dìu dắt hƣớng dẫn tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Nha Trang, Viện nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cán công tác Trƣờng Đại học Nha Trang, Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 18 tháng 12 năm 2015 Học viên Đỗ Ngọc Bảo iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH VẼ x TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU Chƣơng - T NG QUAN 1.1 T ng quan tỏi (Allium sativum ) 1.1.1 Tên gọi lịch s 1.1.2 Phân loại thành phần tỏi 1.1.3 Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh trƣởng tỏi (Allium sativum) 1.1.4 Một số công dụng tỏi 1.1.5 Tình hình sản xuất tỏi 1.2 T ng quan lectin 1.2.1 Lịch s nghiên cứu lectin 1.2.2 Sự phân bố lectin sinh giới 10 1.2.3 Cấu tạo lectin 11 1.2.4 Một số t nh chất lý h a sinh học lectin 12 1.2.5 Ứng dụng lectin 17 1.3 T ng quan sâu 18 1.3.1 Sâu xanh (Helicoverpa armigera) 18 1.3.2 Sâu tơ (Plutella xylostella) 19 1.3.3 Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) 19 1.3.4 Sâu (Cnaphalocrosis medinalis G) 20 1.4 Cây cải (Brassica juncea L.) 20 1.5 Tình hình nghiên cứu lectin từ tỏi 20 1.5.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ tỏi giới 20 1.5.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ tỏi Việt Nam 21 1.6 Tính chất hóa sinh lectin từ tỏi 21 1.7 Hoạt tính kháng côn trùng lectin từ tỏi khả ứng dụng 23 v 1.8 Phƣơng pháp thu nhận lectin 25 1.8.1 Các kĩ thuật chiết xuất lectin 25 1.8.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 26 Chƣơng - ĐỐI TƢ NG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU 28 2.1 Vật liệu, h a chất thiết bị nghiên cứu 28 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.2 Phƣơng pháp thu mẫu x lý mẫu 28 2.1.3 H a chất 28 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 29 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Quy trình t ng quát dự kiến để chiết lectin tỏi 30 2.2.2 Xác định điều kiện chiết lectin 32 2.2.2.1 Ảnh hƣởng dung môi nồng độ dung môi đến hoạt độ t ng số (HĐTS) hoạt độ riêng (HĐR) dịch chiết 32 2.2.2.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết 34 2.2.2.3 Ảnh hƣởng thời gian ngâm chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết 35 2.2.2.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết 36 2.2.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối (NH4)2SO4 trình kết tủa dịch chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng lectin 37 2.2.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ, pH cation h a trị đến hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu khả kháng khuẩn lectin tỏi 38 2.2.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 38 2.2.4.2 Ảnh hƣởng pH tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 39 2.2.4.3 Ảnh hƣởng cation h a trị tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 40 2.2.5 Ảnh hƣởng chế phẩm lectin tỏi đến khả hoạt động sâu xanh, sâu tơ, sâu xanh da láng, sâu hại rau cải 41 2.3 Phƣơng pháp phân t ch 43 2.3.1 Xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Lowry 43 2.3.2 Xác định hoạt độ t ng số hoạt độ riêng lectin phƣơng pháp Hori 43 vi 2.3.3 Tinh dịch chiết lectin phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 43 2.3.4 Khảo sát khả kháng khuẩn lectin tỏi 44 2.3.5 Xác định khả liên kết carbohydrate lectin tỏi 45 2.4 Phƣơng pháp x lý số liệu 46 Chƣơng - KẾT QUẢ NGHI N CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Ảnh hƣởng điều kiện chiết đến hoạt độ lectin từ củ tỏi 47 3.1.1 Ảnh hƣởng loại dung môi nồng độ dung môi 47 3.1.2 Ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết 49 3.1.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết 50 3.1.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết 52 3.1.5 Ảnh hƣởng nồng độ muối (NH4)2SO4 đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng lectin kết tủa từ dịch chiết 53 3.1.6 Quy trình cơng nghệ thu nhận lectin tỏi 55 3.2 Kết phân t ch lectin từ tỏi thu nhận quy trình đề xuất 56 3.3 Tinh dịch chiết lectin từ tỏi sau thẩm tách sắc ký lọc gel Sephadex G-75 57 3.4 Đặc t nh h a lý sinh học lectin tỏi 58 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu (NKHC) lectin tỏi 58 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 60 3.4.3 Ảnh hƣởng cation h a trị đến hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 61 3.4.4 Khả ngƣng kết loại hồng cầu khác lectin tỏi 62 3.4.5 Khả kháng khuẩn lectin từ tỏi 64 3.4.6 Khả liên kết carbohydrate lectin tỏi 65 3.5 Đánh giá hiệu lực chế phẩm lectin từ tỏi diệt sâu xanh (Helicoverpa armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) sâu (Cnaphalocrosis medinalis G) phòng th nghiệm 68 3.5.1 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu xanh nồng độ khác 68 3.5.2 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu tơ nồng độ khác 69 3.5.3 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu xanh da láng nồng độ khác 70 3.5.4 Đánh giá hoạt t nh diệt sâu nồng độ khác 71 Chƣơng - KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ASAL : Lectin từ tỏi BSA : Huyết bò (Bovine serium albumin) DC : Dịch chiết EDTA : Axit Ethylenediaminetetraacetic HA : Hoạt độ ngƣng kết hồng cầu (Hemaggllutinin assay) HĐR : Hoạt độ riêng HĐTS : Hoạt độ t ng số MAC : Lƣợng protein nhỏ c khả gây ngƣng kết hồng cầu thỏ đƣợc x lý Trypsin (minimum agglutination concentration) NKHC : Ngƣng kết hồng cầu OD : Mật độ quang (Optical density) PBS : Đệm phosphate chứa NaCl (Phosphate buffered saline) SDS-PAGE : Kỹ thuật điện di gel polyacrylamide c diện SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) TN : Th nghiệm viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khoa học Bảng 1.2 Giá trị dinh dƣỡng 100 g tỏi tƣơi Bảng 1.3 Độc tính số lectin từ thực vật đến trùng có hại 14 Bảng 2.1 Các thiết bị ch nh đƣợc s dụng th nghiệm 29 Bảng 2.2 Các vi khuẩn đƣợc s dụng th nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn lectin tỏi 45 Bảng 2.3 Một số loại đƣờng glycoprotein 46 Bảng 3.1 Kết tinh lectin từ tỏi 56 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 61 Bảng 3.3 Khả gây ngƣng kết loại hồng cầu khác lectin tỏi 62 Bảng 3.4 Kết th nghiệm khả kháng lại số vi khuẩn gây bệnh lectin từ tỏi 64 Bảng 3.5 Nồng độ đƣờng glycoprotein nhỏ c khả ức chế hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin từ tỏi 66 ix DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Củ, tỏi (Allium sativum) Hình 1.2 Tác dụng lectin hệ đƣờng ruột côn trùng 16 Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể lectin từ tỏi 22 Hình 1.4 Cấu trúc Man9GlcNAc2Asn 22 Hình 1.5 Lectin liên kết với chuỗi carbohydrate 23 Hình 1.6 (A) Vùng hóa mơ trùng bình thƣờng (B) vùng hóa mơ trùng cho ăn lectin từ tỏi bị sƣng lên 24 Hình 1.7 Màng bao chất dinh dƣỡng côn trùng trƣớc sau ăn chế phẩm lectin tỏi 24 Hình 2.1 Quy trình dự kiến thu nhận lectin tỏi 30 Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi nồng độ dung môi đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi 33 Hình 2.3 Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi 34 Hình 2.4 Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian ngâm chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi 35 Hình 2.5 Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi 36 Hình 2.6 Quy trình nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ muối (NH 4)2SO4 đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch lectin 37 Hình 2.7 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 39 Hình 2.8 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng pH tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 39 Hình 2.9 Sơ đồ bố tr th nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng cation h a trị tới hoạt t nh ngƣng kết hồng cầu lectin tỏi 40 Hình 2.10 Sơ đồ th nghiệm ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm lectin từ tỏi đến số lƣợng sâu sống 42 Hình 2.11 Quy trình khảo sát khả kháng khuẩn lectin tỏi 44 Hình 3.1A Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết 47 x Phụ lục 1: XÁC ĐỊNH HÀM LƯ NG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951) Xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Lowry cộng [55], dùng huyết bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn  Nguyên tắc Nguyên tắc dựa sở protein c khả phản ứng với thuốc th Folin tạo phức chất c màu xanh da trời Cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Đo cƣờng độ màu máy đo quang Microplate Elx 808 bƣớc s ng 750nm Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) để xác định đƣợc hàm lƣợng protein nồng độ vài chục micro gram (µg)  Hóa chất Dung dịch A: 4g NaOH (0,1 M) 20g Na2CO3 (2%) pha 1000ml nƣớc cất Dung dịch B: 0,5g CuSO4.5H2O (0,5%) pha dung dịch Natri Xitrat (1%) dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1% Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A B theo tỉ lệ 49:1 (pha trƣớc s dụng) Thuốc th Folin, pha loãng lần với nƣớc cất trƣớc s dụng Dung dịch gốc: Albumin huyết bò (BSA) 1mg/ml  C c bước tiến hành Cân 10mg BSA hòa tan 10ml nƣớc cất, đƣợc dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml Sau đ , pha loãng dung dịch gốc nƣớc cất thành nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 120µg/ml để xây dựng đồ thị chuẩn Lấy xác 0,5ml dịch chứa protein với nồng độ khác cho vào ống nghiệm, thêm vào đ 2,5ml dung dịch C, lắc để yên 20 phút Sau đ , thêm vào hỗn hợp ống nghiệm 0,25ml thuốc th Folin pha loãng lần, lắc để yên 60 phút Đem so màu hỗn hợp máy so màu quang điện bƣớc sóng 750nm Thực thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đƣờng hồi quy theo bảng (phụ lục 1) Kết đƣợc x lý theo phƣơng pháp thống kê thông thƣờng III 0.14 y = 0.0011x - 0.0049 R² = 0.9934 0.12 OD 750 0.1 0.08 OD750 Linear (OD750) 0.06 0.04 0.02 -0.02 20 40 60 80 100 120 140 Nồng độ protein µg/ml) H nh Đường chuẩn protein theo phư ng ph p Lowry Mẫu thí nghiệm đƣợc chuẩn bị tiến hành b sung hóa chất nhƣ nêu Sau đ , đem so màu bƣớc s ng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính giá trị protein Làm thí nghiệm với mẫu kép lấy giá trị trung bình Bảng giá trị mật độ quang OD tư ng ứng với nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ BSA (µg/ml) OD1 OD2 OD3 OD 0,007 0,007 0,007 0,007 20 0,024 0,022 0,02 0,022 40 0,044 0,04 0,039 0,041 60 0,067 0,063 0,068 0,066 80 0,08 0,082 0,084 0,082 100 0,111 0,113 0,112 0,112 120 0,133 0,135 0,128 0,132 OD750 IV Phụ lục 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LECTIN 2.1 X c định hoạt độ lectin phư ng ph p ngưng kết hồng cầu cuả Hori [38] Hồng cầu đƣợc s dụng thí nghiệm xác định hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin hồng cầu thỏ 2% x lý trypsin  Tiến hành: - Cho 25µL NaCl 0,85% vào giếng đĩa 96 giếng đáy chữ V - Thêm 25µL mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngƣng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang giếng với tỉ lệ pha 1/2n (n: số lần pha loãng) - Tiếp tục cho 25 µL hồng cầu thỏ 2% x lý trypsin vào tất giếng - Lắc nhẹ, giữ nhiệt độ phòng Sau giờ, đọc kết  Đọc kết quả: - Kết âm tính: tất hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ - Kết dƣơng t nh: hồng cầu giếng bị ngƣng kết  Đ n vị hoạt độ đơn vị hoạt độ lectin hay đơn vị hoạt độ ngƣng kết hồng cầu ml (HU/ml) giá trị nghịch đảo độ pha lỗng lớn mà dịch lectin cịn có khả làm ngƣng kết 50% lƣợng hồng cầu cho vào phản ứng  Hoạt độ lectin đư c - Hoạt độ t ng (Ut c định theo số: ng): t ng số đơn vị hoạt tính có thể tích định Đơn vị: HU Ut ng = V 2n (1) Trong đ : V: t ng thể tích (ml) 2n: Hệ số lần pha lỗng - Hoạt độ riêng (Uriêng): số đơn vị hoạt độ lectin có 1mg protein Đơn vị: HU/mg Uriêng Ut ng (2) = Proteint ng Trong đ : Ut ng: t ng số đơn vị hoạt tính Proteint ng: t ng hàm lƣợng protein - MAC (minimum agglutination concentration) lƣợng protein nhỏ có khả gây NKHC thỏ đƣợc x lý Trypsin Đơn vị (µg) V Lƣợng Protein 1ml MAC = (3) HA Trong đ : HA: Hoạt độ ngƣng kết hồng cầu 2.2 X c định khả liên kết carbohydrate lectin phư ng ph p ngưng kết hồng cầu Hori Phƣơng pháp khảo sát khả liên kết carbohydrate lectin từ tỏi đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp Hori cộng (1990) [37] Một số loại đƣờng glycoprotein s dụng đƣợc liệt kê bảng 2.4: Nguyên lý: Nếu không c c mặt gốc đƣờng tự do, lectin kết hợp với hồng cầu gây nên tƣợng ngƣng kết hồng cầu, ngƣợc lại nhƣ c mặt gốc đƣờng tự do, gốc đƣờng kết hợp với lectin, ngăn không cho lectin kết hợp làm ngƣng kết hồng cầu Tiến hành: Pha loãng dịch lectin ban đầu thành dịch lectin có hoạt độ ngƣng kết hồng cầu khoảng 23 S dụng đĩa 96 giếng, đáy chữ V: - Cho 25µl dung dịch đệm vào giếng giếng thứ hàng - Cho 25µl dung dịch đƣờng glycoprotein vào giếng số số pha loãng lần theo hàng giếng số 2, làm mẫu kép mẫu - Cho 25 µl dịch lectin vào giếng, lắc nhẹ, giữ nhiệt độ phòng - Sau giờ, cho 25 µl hồng cầu thỏ x lý trypsin vào giếng Lắc nhẹ, giữ nhiệt độ phòng Sau giờ, đọc kết  Đọc kết Nếu hoạt độ ngƣng kết hồng cầu lectin khơng thay đ i: Lectin khơng có khả liên kết với đƣờng glycoprotein đƣợc kiểm tra Nếu hoạt độ ngƣng kết hồng cầu dịch lectin giảm: lectin liên kết với đƣờng glycoprotein đƣợc kiểm tra Nồng độ nhỏ đƣờng (mM) glycoprotein (µg/ml) mà đ tƣợng ngƣng kết hồng cầu lectin gây bị ức chế hoàn toàn (nghĩa lectin liên kết hoàn toàn với đƣờng glycoprotein đƣợc kiểm tra) đƣợc tính theo cơng thức: Cmin = (4) Cmin: nồng độ phản ứng nhỏ đƣờng (mM) glycoprotein (µg/ml) mà đ tƣợng ngƣng kết hồng cầu lectin gây bị ức chế hoàn toàn VI C: nồng độ đƣờng glycoprotein (Nồng độ đƣờng: 100 mM, nồng độ glycoprotein: 2000 µg/ml) HI: giá trị nồng độ pha lỗng mà đ hoạt độ NKHC bị ức chế sau lectin liên kết với đƣờng glycoprotein VII Phụ lục 3: KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT VÀ KẾT TỦA LECTIN TỪ TỎI Bảng 3.1A Ảnh hưởng nồng độ Ethanol đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi Protein t ng số Dung mơi Th tích HĐTS (%) (ml) (HU) 119,47 477,867 0,189 337,975 1,421 0,158 10 119,30 954,400 0,653 447,421 2,136 0,159 20 119,17 1906,667 0,754 735,800 2,594 0,167 30 119,27 1908,267 1,508 875,200 2,182 0,109 40 119,33 1909,333 0,754 979,841 1,950 0,089 50 119,43 955,467 0,377 1054,489 0,906 0,019 60 119,23 953,867 0,377 1109,087 0,860 0,011 SD HĐTS (mg) HĐR (HU/mg) SD HĐR Bảng 3.1B Ảnh hưởng nồng độ PBS đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi Protein Nồng độ PBS (M) Th tích (ml) HĐTS (HU) SD HĐTS t ng số (mg) HĐR (HU/mg) SD HĐR 119,63 478,533 0,499 321,068 1,515 0,375 0,01 119,60 956,800 1,306 407,971 2,367 0,412 0,02 119,63 1914,133 1,996 689,380 2,778 0,130 0,04 119,37 1909,867 2,719 803,609 2,381 0,090 0,06 119,57 1913,067 1,996 862,926 2,219 0,084 0,08 119,37 1909,867 1,996 945,396 2,021 0,079 0,10 119,53 1912,533 2,719 1035,082 1,848 0,044 VIII Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi Protein Th tích HĐTS (ml) (HU) 1:5 99,47 1591,47 2,00 638,274 2,494 0,094 1:6 119,53 1912,53 2,00 688,805 2,778 0,046 1:7 139,60 2233,60 2,61 733,365 3,046 0,079 1:8 159,50 1276,00 1,31 795,371 1,605 0,048 1:9 179,53 718,13 0,50 849,569 0,846 0,033 Tỉ lệ chiết SD HĐTS t ng số (mg) HĐR (HU/mg) SD HĐR Bảng 3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi SD HĐTS Protein t ng số (mg) HĐR (HU/mg) SD HĐR 558,133 0,499 374,471 1,52 0,203 139,43 1115,467 0,998 583,756 1,91 0,057 139,50 2232,000 1,306 710,863 3,14 0,040 139,63 2234,133 1,996 863,869 2,59 0,057 10 139,57 2233,067 2,444 907,446 2,46 0,079 12 139,60 2233,600 2,263 983,799 2,27 0,087 18 139,60 1116,800 0,653 1034,571 1,08 0,030 24 139,47 1115,733 0,998 1084,278 1,03 0,040 Thời gian giờ) Th tích (ml) HĐTS (HU) 139,53 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi Nhiệt độ (C) Th tích (ml) HĐTS (HU) SD HĐTS 139,53 2232,533 1,996 10 139,47 2231,467 20 139,53 30 40 Protein t ng số HĐR (HU/mg) SD HĐR 675,505 3,306 0,043 1,508 693,783 3,217 0,059 2232,533 0,754 714,412 3,126 0,036 139,53 2232,533 1,508 795,584 2,822 0,207 139,63 2234,133 0,754 885,862 2,523 0,053 (mg) IX Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ muối NH4)2SO4 đến hoạt độ t ng số hoạt độ riêng dịch chiết lectin tỏi Protein Nồng độ % Th tích HĐTS SD (NH4)2SO4 (ml) (HU) HĐTS 40% 8,66 555,093 1,680 230,64 2,415 0,131 50% 8,66 1107,200 2,765 279,33 3,971 0,133 60% 8,75 2240,000 2,090 335,58 6,680 0,188 70% 8,73 2238,293 3,193 372,42 6,013 0,130 80% 8,74 2239,147 1,207 412,84 5,427 0,122 90% 8,75 2239,147 3,193 453,13 4,943 0,075 X t ng số (mg) HĐR (HU/mg) SD HĐR Phụ lục 4: KẾT QUẢ SẮC K LỌC GEL SEPHADEX G-75) Kết đo OD 280nm hoạt độ NKHC c c ph n đoạn sau sắc lọc gel cột nhựa Sephade -75 STT A 280 nm Hoạt độ Hoạt độ STT A 280 nm 16 0,209 32 0,003 17 0,378 128 0,003 18 0,532 256 0,026 19 0,368 128 0,081 20 0,219 32 0,252 21 0,106 0,061 22 0,038 0,015 23 0,046 0,014 24 0,158 10 0,041 25 0,321 11 0,156 26 0,161 12 0,045 27 0,049 13 0,023 28 0,006 14 0,025 29 0,004 15 0,098 30 NKHC XI NKHC Phụ lục 5: KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH L HÓA VÀ SINH HỌC CỦA LECTIN Bảng 5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu lectin tỏi Nhiệt độ (C) Hoạt độ NKHC lectin tỏi HU) HU % 30 256 100 40 256 100 50 256 100 60 256 100 70 128 50 80 64 25 90 32 12,5 100 3,125 Bảng 5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ ngưng kết hồng cầu lectin tỏi pH Hoạt độ ngưng kết hồng cầu HU) HU % 27 50 27 50 27 50 28 100 28 100 28 100 28 100 10 27 50 XII Phụ lục 6: KHẢ NĂNG DIỆT SÂU CỦA CÁC DỊCH CHIẾT Bảng 6.1 Kết th nghiệm s u anh hại rau cải Ngày Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 SD 0 0 0 0 DC 0,1 mg/ml 100,0 100,0 100,0 100,0 93,3 86,7 80,0 76,7 SD 0 0 4,444 4,444 6,67 4,444 DC 0,2 mg/ml 100,0 100,0 96,7 93,3 86,7 80,0 66,7 50,0 SD 0 4,44 4,44 4,444 6,667 4,44 6,667 DC 0,4 mg/ml 100,0 96,7 93,3 76,7 70,0 56,7 40,0 16,7 SD 4,444 4,44 4,44 6,667 4,444 6,67 11,11 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 96,7 93,3 SD 0 0 4,44 4,44 DC 0,1 mg/ml 70,0 66,7 50,0 36,7 23,3 6,7 SD 6,667 4,44 6,67 4,444 4,44 4,44 DC 0,2 mg/ml 30,0 20,0 3,3 SD 6,667 6,67 4,44 DC 0,4 mg/ml SD XIII Bảng 6.2 Kết th nghiệm s u t hại rau cải Ngày Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 SD 0 0 0 0 DC 0,1 mg/ml 100,0 100,0 100,0 100,0 90,0 90,0 86,7 76,7 SD 0 0 0 4,44 4,44 DC 0,2 mg/ml 100,0 100,0 100,0 90,0 83,3 80,0 73,3 63,3 SD 0 0 4,44 6,67 4,44 4,44 DC 0,4 mg/ml 100,0 93,3 90,0 80,0 73,3 63,3 50,0 40,0 SD 4,44 0 4,44 4,44 6,67 6,67 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 93,3 90,0 SD 0 0 4,44 DC 0,1 mg/ml 70,0 66,7 60,0 46,7 33,3 20,0 SD 6,67 3,7 4,444 1,481 10,4 6,67 DC 0,2 mg/ml 56,7 50,0 33,3 10,0 SD 4,44 6,67 8,889 6,667 DC 0,4 mg/ml 16,7 SD 11,1 XIV Bảng 6.3 Kết th nghiệm s u anh da l ng hại rau cải Ngày Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 SD 0 0 0 0 DC 0,1 mg/ml 100,0 100,0 100,0 100,0 93,3 86,7 80,0 80,0 SD 0 0 4,44 4,444 6,67 6,67 DC 0,2 mg/ml 100,0 100,0 100,0 96,7 93,3 83,3 76,7 70,0 SD 0 4,44 4,44 4,444 4,44 6,67 DC 0,4 mg/ml 100,0 100,0 93,3 86,7 80,0 70,0 50,0 40,0 SD 0 4,44 4,44 6,67 6,667 6,67 6,67 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 96,7 93,3 SD 0 0 4,444 4,44 DC 0,1 mg/ml 76,7 63,3 50,0 30,0 10,0 SD 4,44 4,44 6,67 6,67 6.667 DC 0,2 mg/ml 56,7 43,3 20,0 3,3 SD 11.1 4.44 6.67 4.44 DC 0,4 mg/ml 10,0 SD 6,67 XV Bảng 6.4 Kết th nghiệm s u l hại rau cải Ngày Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 SD 0 0 0 0 DC 0,1 mg/ml 100,0 100,0 100,0 100,0 93,3 86,7 76,7 76,7 SD 0 0 4,444 4,444 4,444 4,444 DC 0,2 mg/ml 100,0 100,0 96,7 96,7 86,7 83,3 66,7 60,0 SD 0 4,44 4,44 4,444 4,444 4,444 6,67 DC 0,4 mg/ml 100,0 100,0 93,3 86,7 73,3 70,0 60,0 46,7 SD 0 4,44 4,44 4,444 6,6667 6,667 4,44 Ngày 10 11 12 13 14 15 16 Dịch chiết % Số sâu lại PBS 0,02 M 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 93,3 93,3 SD 0 0 4,444 4,444 DC 0,1 mg/ml 66,7 63,3 50,0 43,3 40,0 10 SD 4,44 4,44 6,67 4,444 6,667 6,667 DC 0,2 mg/ml 50,0 30,0 13,3 SD 6,67 6,67 8,89 DC 0,4 mg/ml 20,0 SD 6,67 XVI Phụ lục 7: MỘT SỐ HÌNH ẢNH Hình 7.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính NKHC lectin tỏi Hình 7.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính NKHC lectin l tỏi Hình 7.3 Ảnh hưởng cation 2+ đến hoạt độ NKHC lectin tỏi HÌnh Hình 7.4 Khả kh ng khuẩn lectin từ tỏi XVII ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐỖ NGỌC BẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN LECTIN TỪ CÂY TỎI TA (Allium sativum) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG LÀM THU? ??C BẢO VỆ CHO RAU CẢI LUẬN VĂN THẠC... liệu tỏi (Allium sativum) bỏ sau thu hoạch gây ô nhiễm môi trƣờng nên tác giả nghiên cứu tách chiết, thu nhận lectin từ tỏi ta khảo sát khả ứng dụng làm thu? ??c bảo vệ cho rau cải Mục đ ch việc nghiên. .. chiết lectin từ tỏi sâu hại rau cải  Nội dung nghiên cứu đề tài: - Nghiên cứu ảnh hƣởng thông số công nghệ đến trình thu nhận lectin từ tỏi - Nghiên cứu tinh lectin thu nhận từ tỏi - Đánh giá