L ỜI MỞ ĐẦU
2.5.7Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sinh khối vi tảo
4. Những đóng góp của đề tài
2.5.7Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sinh khối vi tảo
tảo sau khi thu hoạch bằng chitosan
Mục đích thí nghiệm: Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến việc bảo quản sinh
khối vi tảo thu hoạch bằng chitosan
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất
lượng sinh khối vi tảo thu bằng chitosan
Sinh khối vi tảo sau thu hoạch bằng chitosan được bảo quản ở khoảng thời gian
thích hợp tại các nhiệt độ khác nhau: -20, 4°C và nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời
gian bảo quản, mẫu sinh khối vi tảo được xác định chất lượng dựa trên khả năng phục
hồi của tế bào, hàm lượng một số chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy
hóa có trong sinh khối vi tảo.
Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo
Xử lý
Sinh khối vi tảo
-20C 4C t○ phòng
Hàm lượng chlorophyl, carotenoid, polyphenol; khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo và khả năng phục
hồi của tế bào.
2.5.8. So sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng chitosan với phương pháp ly
tâm và một số muối kim loại nặng
Để so sánh chất lượng vi tảo thu bằng chitosan với phương pháp ly tâm, sinh
khối vi tảo được thu bằng chitosan ở điều kiện thích hợp; đối với phương pháp ly tâm,
hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo (45 ml) được cho vào ống ly tâm và thực
hiện ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút, trong khoảng thời gian 10 phút, ở 10°C. Sinh khối thu được bằng hai phương pháp trên được đánh giá chất lượng dựa vào hàm
lượng một số chất có hoạt tính sinh học, cấu trúc tế bào và khả năng phục hồi của vi
tảo.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng
chitosan với phương pháp ly tâm
So sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo của chitosan và muối kim loại nặng
(FeCl3, Al2(SO4)3 và PAC) được thực hiện như sau: Trước hết, tìm điều kiện pH thích
hợp cho các muối kim loại nặng; sau đó nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kim loại
nặng đến hiệu suất thu hồi để tìm nồng độ thu thích hợp. Dựa vào nồng độ sử dụng và hiệu suất thu sinh khối để so sánh hiệu quả thu của chitosan với các muối kim loại
nặng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo
Thu bằng chitosan Thu bằng ly tâm
Xác định hàm lượng chlorophyll, carotenoid,
polyphenol; khả năng chống oxy hóa của sinh khối vi tảo và khả năng phục hồi của tế bào
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả thu sinh khối vi tảo bằng
chitosan với muối kim loại và PAC
2.6. Phương pháp phân tích
2.6.1. Xác định hàm lượng ẩm
Hàm lượng ẩm của vi tảo được xác định bằng phương pháp sấy ở 105oC đến
khối lượng không đổi theo TCVN 4329 – 2007.
2.6.2. Xác định điều kiện thu sinh khối vi tảo
Hiệu quả thu sinh khối vi tảo được xác định thông qua các chỉ số: hiệu suất lắng
tế bào vi tảo (flocculation efficiency, FE), hệ số lắng (concentration factor, CF), tỉ lệ
thể tích phần chất rắn lắng được (Settleable solid volume fraction, SSVF) (Sirin, 2013)
(Hình 2.1) và hiệu suất thu sinh khối vi tảo.
Hiệu suất thu sinh khối vi tảo được xác định bằng cách đo mật độ quang học tế
bào tảo trước khi keo tụ và mật độ quang học của môi trường nuôi sau khi keo tụ. Mật độ quang học (OD) được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 450 nm (Lee và cộng sự,
1998).
Hiệu suất lắng được tính bằng công thức:
Hiệu suất lắng (%) = (ODđ – ODs)/ODđ x100
ODđ: mật độ quang học của dung dịch tảo trước khi keo tụ
ODs : mật độ quang học của môi trường nuôi sau khi keo tụ
Hệ số lắng(CF) được tính bằng công thức:
Hỗn hợp môi trường nuôi và sinh khối vi tảo
Thu bằng chitosan Thu bằng FeCl3, Al2(SO4)3 và PAC
So sánh nồng độ sử dụng và hiệu suất thu hồi
Hệ số lắng (CF) = (h0/hf) x hiệu suất lắng (Lee và cộng sự, 2009).
Tỉ lệ phần chất rắn lắng được (SSVF) được tính bằng công thức:
Tỉ lệ phần chất rắn lắng được (SSVF) = (hf/h0)
Vận tốc lắng được xác định tại mốc thời gian 2 phút 30s. Vận tốc lắng được xác (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
định theo phương pháp của Sirin (2013) bằng công thức: Vận tốc lắng = (h0 - hf )/ thời gian lắng
Hình 2.7. Cách xác định chiều cao cột lắng
2.6.3. Xác định hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học
2.6.3.1. Chuẩn bị dịch chiết
Cân chính xác 2 g sinh khối vi tảo tươi được chiết bằng 30 ml dung dịch
ethanol 95% trong thời gian 3 phút bằng thiết bị đồng hóa mẫu. Dịch chiết được thu bằng cách ly tâm lạnh ở tốc độ 10.000 vòng trong khoảng thời gian 10 phút ở 4oC. Dịch chiết sau đó được sử dụng để đánh giá khả năng chống oxy hóa và hàm lượng
một số chất có hoạt tính sinh học bao gồm: polyphenol tổng số, carotenoid tổng số và chlorophyll a, b.
2.6.3.2. Xác định hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll
Hàm lượng carotenoid tổng số và chlorophyll trong sinh khối vi tảo thu bằng chitosan, được xác định theo phương pháp của Sumanta và cộng sự (2014) với một vài
thay đổi nhỏ (tỷ lệ dung môi chiết/sinh khối). Phần trong của dịch chiết thu được sau
quang phổ kế. Hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid tổng số lần lượt được xác định theo các công thức sau:
Cha = 13,36A664 – 5,19 A649 (µg/ml) Chb = 27,43A649 – 8,12 A664 (µg/ml)
Cx+c = (1.000A470 – 2,13Cha – 97,63Chb)/209 (µg/ml)
Trong đó: A là độ hấp thụ quang ở các bước sóng 470, 649 và 664 nm; Cha là
hàm lượng chlorophyll a; Chb là hàm lượngchlorophyll b và Cx+c là hàm lượng
carotenoid tổng số. Kết quả cuối cùng được tính toán theo đơn vị µg/g sinh khối vi tảo
khô.
2.6.3.3. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài thay đổi nhỏ (thể tích của các chất trong hỗn hợp phản ứng). Lấy
chính xác 0,1 ml dịch và 0,9 ml nước cất vào ống nghiệm. Sau đó cho thêm 1 ml dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% và 2,5 ml dung dịch Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được
lắc đều bằng máy Vortex trong khoảng thời gian 30 s. Hỗn hợp sau đó được ủ trong điều kiện tối và nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 30 phút trước khi đo độ hấp thụ
quang học ở bước sóng 760 nm trên máy quang phổ kế. Kết quả cuối cùng được báo cáo dưới dạng mg acid gallic tương đương/g sinh khối khô.
2.6.4. Xác định khả năng chống oxy hóa
2.6.4.1. Xác định khả năng khử gốc tự do DDPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cho vào ống nghiệm 0,1 ml dịch chiết ở các
nồng độ khác nhau và 2,9 ml nước. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 M trong ethanol 99,7%, lắc đều bằng máy Vortex trong khoảng thời gian 30s và ủ trong bóng
tối trong khoảng thời gian 30 phút. Độ hấp thụ quang học của hỗn hợp sau khi ủ được đo ở bước sóng 517 nm. Mẫu đối chứng (control) được chuẩn bị tương tự nhưng 0,1
ml của dịch chiết được thay bằng 0,1 ml của ethanol 95%. Đối với mẫu trắng (blank),
1 ml của dung dịch DPPH được thay bằng 1 ml ethanol 99,7%.
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: Khả năng bắt gốc tự do DPPH (%) = [(ACT – ASP)/ACT]x100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó: ACT là độ hấp thụ quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết và ASP là độ hấp thụ quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào phản ứng oxi hóa khử. Năng lực khử cũng được sử dụng để xác định khả năng chống
oxy hóa của một chất. Chất khử (chất có hoạt tính oxi hóa) sẽ khử potassium
ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid theo sơ đồ sau:
X + K3[Fe(CN)6]→ K4[Fe(CN)6] X + [Fe(CN)6] 3+→ [Fe(CN)6]2+
Ion Fe2+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức hợp ferric
ferrocyanid màu xanh dương có công thức Fe4[Fe(CN)6]3. Phức hợp này có độ hấp thu
cực đại ở bước sóng 700nm. Cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu
thử càng cao.
Tổng năng lực khử của sinh khối vi tảo được xác định theo phương pháp của
Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Cho chính xác 0,3 ml dịch chiết ở các nồng độ khác nhau và 1,2 ml nước cất vào ống nghiệm. Tiếp theo, 0,5 ml dung dịch
K3(Fe[CN]6) 1% được thêm vào. Hỗn hợp được ủ ở 50C trong 20 phút trong bể ổn
nhiệt. Sau đó thêm 0,5 ml dung dịch TCA 10% và 2 ml nước cất, cuối cùng cho thêm 0,4 ml dung dịch FeCl3 0,1%. Độ hấp thụ quang học của hỗn hợp được xác định tại bước sóng 700 nm bằng máy quang phổ. Độ hấp thụ quang học càng cao thì năng lực
khử càng mạnh. Kết quả được báo cáo bởi giá trị EC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp
thụ quang học lên 0,5.
2.6.5. Phương pháp xác định khả năng phục hồi của sinh khối vi tảo
Khả năng phục hồi của vi tảo được xác định bằng cách cấy sinh khối vi tảo đã
thu được vào môi trường nuôi F2 đã được hấp tiệt trùng và nuôi trong điều kiện độ
mặn 20 - 25‰. Sục khí liên tục trong quá trình nuôi, nhiệt độ duy trì ở 20 - 25oC,
cường độ chiếu sáng khoảng 5000 lux, pH được khống chế trong khoảng 8,0 và mật độ
tế bào được xácđịnh thông qua việc đếm số lượng tế bào.
2.7. Phương pháp xử lí số liệu
Mỗi thí nghiệm được tiến hành ít nhất 3 lần độc lập. Kết quả được được thể
hiện: giá trị trung bình độ lệch chuẩn (TB ± SD). Tính toán số liệu và vẽ đồ thị được
thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2010. So sánh giá trị trung bình
được thực hiện bằng phần mềm SPSS phiên bản 16.0. So sánh trung bình giữa nghiệm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định điều kiện thích hợp thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana
3.1.1. Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo
Độ deacetyl, khối lượng phân tử, độ nhớt… là những tính chất quan trọng của (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chitosan. Những tính chất này ảnh hưởng không những đến hoạt tính sinh học mà còn
ảnh hưởng đến hiệu quả kết lắng của nó. Trong nghiên cứu này, 2 loại chitosan có độ
deacetyl khác nhau là 70 và 85 (DD70 và DD85) đã được sử dụng. Thí nghiệm được
tiến hành ở pH môi trường nuôi (pH 7), nồng độ chitosan 10 mg/L (theo thể tích hỗn
hợp tảo và môi trường nuôi). Kết quả ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất thu
hồi sinh khối được thể hiện ở Hình 3.1 và Hình 3.2. Kết quả thực nghiệm cho thấy khi
sử dụng 2 loại chitosan đều cho hiệu suất lắng trên 90%, cấu trúc bông tảo tốt được thể
hiện qua 2 chỉ số CF và SSVF. Tuy nhiên hiệu suất thu hồi khi sử dụng 2 loại chitosan
DD70 và DD85 lại không có sự khác biệt đáng kể. Cụ thể, hiệu suất kết bông vi tảo khi
dùng DD85 là 94,72%, DD70 là 93,79%; chỉ số CF khi dùng DD85 là 0,31, DD70 là 0,30; chỉ số SSVF khi dùng DD85 và DD70 lần lượt là 3,00 và 3,11.
Chitosan có độ deacetyl càng cao thì càng có nhiều nhóm NH3+ tích điện dương,
khả năng tương tác tĩnh điện với các tế bào vi tảo tích điện âm sẽ càng cao, hiệu suất
kết bông sẽ càng cao, hiệu suất thu hồi càng lớn. Tuy nhiên,ngoài ảnh hưởng của độ
deacetyl thì khối lượng phân tử và độ nhớt của chitosan cũng ảnh hưởng đến hiệu quả
kết lắng. Trong nghiên cứu này, chitosan DD85 có độ nhớt thấp hơn của chitosan DD70,
độ nhớt của hai loại chitosan này lần lượt là 520 và 750 cps. Như vậy, khi độ nhớt của
chitosan cao có thể đã cản trở quá trình liên kết giữa chitosan và vi tảo. Theo Morales
và cộng sự (1985), hiệu suất thu hồi sinh khối của 5 loài vi tảo khác nhau tăng theo sự
giảm của độ nhớt. Tuy nhiên, cơ chế ảnh hưởng của độ nhớt và độ deacetyl của
chitosan tới hiệu quả kết lắng sinh khối vi tảo vẫn chưa được hiểu rõ ràng và cần tiếp
tục được nghiên cứu sâu hơn.Từ kết quả của nghiên cứu này, xét về khía cạnh kinh tế
loại chitosan có độ deacetyl 85 được sử dụng để thu sinh khối tảo Thalassiosira pseudonana.
Hình 3.1. Sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana thu bằng chitosan DD70 và
DD85
Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại chitosan đến hiệu suất lắng, hệ số lắng (A) và tỉ lệ phần thể tích lắng (B)
3.1.2. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi sinh khối vi tảo
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình thu sinh khối vi
tảo. Sự ảnh hưởng này được giải thích là do pH ảnh hưởng đến thế zeta (zeta potential)
của các hạt mang điện tích, qua đó có thể tác động tới quá trình kết lắng sinh khối vi
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 DD 70 DD 85 C F Hiệu su ất lắn g (% ) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu suất lắng CF (A)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 DD 70 DD 85 SSVF (B) DD 85 DD 70 DD 85 DD 70
tảo của chất keo tụ như chitosan. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của pH (4 - 9) đến hiệu
quả thu sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana được đánh giá. Để đánh giá tổng
thể hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo bằng chitosan ở các pH khác nhau, hiệu suất lắng
(FE), hệ số lắng (CF) và tỉ lệ phần thể tích lắng (SSVF) được xác định.
Kết quả cho thấy pH có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất thu nhận sinh khối vi
tảo (Hình 3.3 và 3.4). Nhìn chung, pH từ 4 - 6 thì hiệu quả thu hồi sinh khối vi tảo tăng lên, nhưng hiệu quả thu có xu hướng giảm khi pH từ 6 - 9. Ở pH 4 hiệu suất lắng FE là 89,99%, hệ số tập trung nồng độ CF là 2,00 và tỉ lệ phần thể tích lắng SSVF là 0,45;
trong khi đó những giá trị này ở pH 6 lần lượt là 94,72%; 3,12 và SSVF 0,30. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng pH lên pH > 6 thì hiệu suất thu hồi lại có xu hướng giảm
nhanh. Cụ thể ở pH 9, hiệu quả kết bông giảm gần 3 lần so với ở pH 6, với hiệu suất
kết bông ở pH 9 chỉ còn 34,07%, hệ số CF 1,30 và SSVF 0,26 (p<0,05). Hiệu suất
lắng ở các pH từ 4 - 7 không khác nhau nhiều, nhưng cấu trúc bông tảo lại có sự khác
biệt rõ rệt. Ví dụ, ở pH 5 và 7 cho hiệu suất kết lắng khoảng 91% nhưng bông không
tạo thành khối lớn, liên kết giữa các tế bào tảo kém; trong khi đó ở pH 6 khối bông tạo
thành lớn và ổn định. Kết quả này được thể hiện thông qua hệ số SSVF ở pH 5 và 7 là
0,36; trong khi đó giá trị này ở pH 6 là 0,30. Như vậy, thông qua các chỉ số đánh giá
hiệu quả thu nhận sinh khối, có thể kết luận pH 6 là tốt nhất trong dải pH nghiên cứu.
Sự ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu sinh khối là do sự thay đổi cấu trúc của chitosan và điện tích trên bề mặt tế bào vi tảo ở các pH khác nhau. Sự thay đổi cấu trúc
của chitosan là do ở các pH khác nhau ảnh hưởng đến mức độ proton hóa của nhóm
amin trong phân tử chitosan và sự thay đổi cấu trạng của chuỗi phân tử polymer của
chitosan (Renault và cộng sự, 2009). Sự ảnh hưởng của pH phụ thuộc vào môi trường
nuôi sinh khối, điều kiện nuôi cấy, hình thái và điện tích trên bề mặt tế bào vi tảo. Giả
thuyết thứ nhất về sự ảnh hưởng của pH cho rằng ở pH kiềm, điện tích dương dần dần
mất đi tạo điều kiện cho chitosan có thể tạo bông có kích thước lớn và dày với sinh
khối vi tảo. Ở pH trung tính, tế bào vi tảo có điện tích âm lớn nhất, khi đó hiệu quả kết
lắng của chitosan sẽ cao do sự tương tác tĩnh điện giữa chitosan và tế bào vi tảo. Trong khi đó, ở pH acid hiệu quả thu sinh khối vi tảo thường không cao do sự mở rộng ra của
chuỗi phân tử chitosan dẫn tới khối kết lắng nhỏ (Huang và cộng sự, 2000). Ngược lại,
giả thuyết thứ hai cho rằng ở môi trường pH gần trung tính sẽ làm giảm độ nhớt của