Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 4/2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT NẤM RƠM STUDIES ON EXTRACTION AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EXTRACTS FROM STRAW MUSHROOM Lê Thanh Hải1, Nguyễn Minh Trí2, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo3 Ngày nhận bài: 28/12/2012; Ngày phản biện thông qua: 09/9/2013; Ngày duyệt đăng: 10/12/2013 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm xác định điều kiện thích hợp để chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm Kết nghiên cứu cho thấy dịch nấm rơm thu có hoạt tính chống oxy hóa cao chiết tách 95OC 60 phút với tỷ lệ phần nấm với 10 phần nước Kết nghiên cứu cho thấy dịch chiết nấm rơm thu có chứa 5,013 ± 0,176 mg/ml ergothioniene có khả ức chế enzyme polyphenoloxydase nên áp dụng để ngăn chặn biến đen tơm q trình bảo quản Từ khóa: nấm rơm (Volvariella volvacea), chống oxy hóa, chất ức chế enzyme polyphenoloxidase ABSTRACT This study was to optimize the extraction conditions for the extraction of antioxidants from straw mushroom The result showed that the highest antioxidant activity of mushroom extract was obtained at 95OC with for 60 using a ratio of part mushrooms to 10 parts water The result was found that the mushroom extract contained ergothioneine at a level of 5,013 ± 0,176 mg/l and acted as an inhibitor of enzyme polyphenoloxydase Therefore, the mushroom extract can be used for preventing black spots in shrimp during storage Keywords: Straw mushroom (Volvariella volvacea), antioxidant, enzyme polyphenoloxidase inhibitor I ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm rơm (Volvariella volvacea) loài nấm ăn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới trồng Trung Quốc vào đầu năm 1822 Khoảng từ năm 1932-1935, nấm rơm đưa vào Việt Nam, Malaysia nước Đông Nam Á khác Nhiệt độ để nấm rơm phát triển từ 25-40°C, điều kiện phát triển tốt 37°C, pH = 6,0 độ ẩm 57-60% Chính vậy, nấm rơm trồng phổ biến Việt Nam cho sản lượng cao Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều lồi nấm có chứa hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe có khả chữa số bệnh Các peptide, β-glucan fibrolytic enzyme dịch chiết từ loài nấm nấm linh chi, nấm mỡ, nấm kim châm, nấm vân chi, nấm thượng hồng có khả phịng chống ung thư bệnh tim mạch (Chen, 2007) Nghiên cứu Fu cộng (2002) cho thấy loài nấm nấm mỡ (Agaricus bisporus), nấm rơm (Volvariella volvacea), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes), nấm đùi gà (Pleurotus eryngii), nấm sò (Pleurotus ostreatus) chứa hợp chất phenol có khả chống oxy hóa hoạt tính chống oxy hóa xếp theo thứ tự: Agaricus bisporus > Hypsizigus marmoreus > Volvariella volvacea > Flammulina velutipes > Pleurotus eryngii > Pleurotus ostreatus Bao cộng (2010) xác định hoạt tính thành phần chất chống oxy hóa dịch chiết 10 loài nấm ăn khác bao gồm: Flammulina Lê Thanh Hải: Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang TS Nguyễn Minh Trí, TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 95 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản velutipes, Flammulina populicola, Grifola frondosa, Grifola frondosa, Hypsizigus tessellates, Hypsizigus tessulatus, Lentinula edodes, Pleurotus cornucopiae, Pleurotus eryngii Pholiota nameko Kết nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ nấm kim châm (Flammulina velutipes) có hoạt tính chống oxy hóa cao 1ml dịch chiết có chứa 2,98 ± 0,02 mg ergothioneine, 2,91 ± 0,04 mg hợp chất phenol Do có hoạt tính chống oxy hóa nên dịch chiết từ loại nấm ăn ứng dụng để sản xuất thực phẩm chức chống lão hóa, chống oxy hóa lipid biến màu thịt cá trình bảo quản lạnh (Bao cộng sự, 2009), hạn chế biến đen tôm (Encarnacion cộng sự, 2009),… Nấm rơm loài trồng phổ biến Việt Nam có hoạt tính chống oxy hóa cao (Fu cộng sự, 2002) Tuy nhiên, nghiên cứu chiết tách đánh giá hoạt tính chất chống oxy hóa từ nấm rơm cịn hạn chế Chính vậy, nghiên cứu tiến hành chiết tách đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm để tìm hướng ứng dụng nhằm góp phần nâng cao giá trị sử dụng nấm rơm mang lại hiệu kinh tế cho người trồng nấm Việt Nam Số 4/2013 nghiên cứu loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích, thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu 2.1 Bố trí thí nghiệm Các nghiên cứu trước cho thấy thành phần hóa học nấm rơm nấm kim châm tương tự (Anthony Joyce, 2007; Akata cộng sự, 2012) Vì vậy, nghiên cứu dựa vào quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm kim châm Bao cộng (2009) xác định lại thông số quy trình cho thích hợp chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm Qua thử nghiệm chiết lần 2, dịch chiết nấm rơm khơng có hoạt tính chống oxy hóa Điều có nghĩa chiết lần chiết kiệt, nên quy trình bố trí thí nghiệm cho chiết lần Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm sau: II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu hóa chất Nấm rơm (Volvariella volvacea) mua trang trại nấm ơng Hồng Văn Thuận, xã Cam Hiệp, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hịa Hình Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm chiết tách chất chống oxy hóa từ nấm rơm Hình Nấm rơm Nấm chọn để dùng cho thí nghiệm nấm vừa thu hoạch, tươi nguyên, khơng bị dập nát, tổn thương, đồng đều, có đường kính trung bình 2-3 cm Nấm cho vào túi PE bảo quản thùng xốp để vận chuyển phịng thí nghiệm Gốc tự 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) mua từ cơng ty hóa chất Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ Các hóa chất khác dùng 96 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Cách tiến hành: - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2 kg) sau vận chuyển đến phịng thí nghiệm rửa để loại bỏ tạp chất Sau đó, lấy mẫu 100g nấm xay nhỏ cho vào 1000 ml nước cố định thời gian chiết 60 phút Theo nghiên cứu Bao cộng (2009) nhiệt độ chiết tối ưu nấm kim châm 950C Do đó, nghiên cứu chọn khảo sát nhiệt độ chiết từ 90-1000C Dịch chiết nấm rơm thu đem điều chỉnh thể tích 1000 ml Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản phân tích hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử để chọn nhiệt độ chiết thích hợp - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2kg) sau vận chuyển đến phịng thí nghiệm rửa để loại bỏ tạp chất Sau đó, lấy mẫu 100g nấm cắt nhỏ cho vào 1000 ml nước cố định nhiệt độ chiết thích hợp chọn từ thí nghiệm trước Theo nghiên cứu Bao cộng (2009) thời gian chiết tối ưu nấm kim châm 60 phút Do đó, nghiên cứu chọn khảo sát thời gian chiết từ 30-90 phút Dịch chiết nấm rơm thu đem điều chỉnh thể tích 1000 ml phân tích hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử để chọn thời gian chiết thích hợp - Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nấm/nước đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Nấm rơm (2kg) sau vận chuyển đến phịng thí nghiệm rửa để loại bỏ tạp chất Sau đó, lấy mẫu cố định nhiệt độ thời gian chiết thích hợp chọn từ thí nghiệm trước Theo nghiên cứu Bao cộng (2009) tỷ lệ nấm/nước tối ưu nấm kim châm 1/10 Do đó, nghiên cứu chọn khảo sát tỷ lệ chiết nấm/ nước (w/v) từ 1/8-1/12 Dịch chiết nấm rơm thu đem điều chỉnh thể tích 1000 ml Số 4/2013 phân tích hoạt tính chống oxy hóa thơng qua khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử để chọn tỷ lệ nấm/nước thích hợp 2.2 Các phương pháp phân tích - Khả khử gốc tự DPPH xác định theo phương pháp Fu cộng (2002) - Tổng lực khử xác định theo phương pháp Oyaizu (1986) - Hàm lượng ergothioniene phân tích thep phương pháp Bao cộng (2010) - Hoạt tính ức chế enzyme polyphenoloxydase (PPO) xác định theo phương pháp Jang cộng (2003) Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày báo giá trị trung bình lần thí nghiệm Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003 để tính giá trị trung bình vẽ đồ thị Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) giá trị trung bình phân tích phần mềm thống kê R phiên 2.13.1 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm trình bày đồ thị hình Hình Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả khử gốc tự DPPH (A) tổng lực khử (B) dịch chiết nấm rơm Từ kết đồ thị hình cho thấy khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết nấm rơm tăng lên tăng nhiệt độ chiết từ 90oC đến 95oC (P < 0,05) Khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch nấm rơm chiết 95oC 100oC khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) Do vậy, chọn nhiệt độ chiết thích hợp 950C Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm trình bày đồ thị hình TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 97 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 4/2013 Hình Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả khử gốc tự DPPH (A) tổng lực khử (B) dịch chiết nấm rơm Từ kết hình cho thấy khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết nấm rơm tăng lên tăng thời gian chiết từ 30 phút đến 60 phút (P < 0,05) Khi tiếp tục tăng thời gian chiết từ 60 phút lên 90 phút, kết phân tích cho thấy khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch nấm rơm không tăng thêm (P > 0,05) Do vậy, chọn thời gian chiết thích hợp 60 phút Ảnh hưởng tỷ lệ nấm/nước chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm trình bày đồ thị hình Hình Ảnh hưởng tỷ lệ nấm/nước chiết đến khả khử gốc tự DPPH (A) tổng lực khử (B) dịch chiết nấm rơm Từ kết hình cho thấy khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết nấm rơm tăng lên tăng tỷ lệ nấm/nước chiết từ 1/8 đến 1/10 (P < 0,05) Cả khả khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch nấm rơm không tăng thêm (P > 0,05) tăng tỷ lệ nấm/nước chiết từ 1/12 đến 1/10 Do vậy, chọn tỷ lệ nấm/nước chiết thích hợp 1/10 Hàm lượng ESH hoạt tính ức chế enzyme PPO dịch chiết nấm rơm Kết phân tích dịch nấm rơm chiết tách điều kiện 95oC 60 phút với tỷ lệ 100g nấm lít nước có chứa 5,013 ± 0,176 mg ESH sắc ký đồ trình bày hình Hình Sắc ký đồ ESH chuẩn (A) ESH dịch chiết nấm rơm (B) 98 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Kết hình cho thấy ESH nội chuẩn (IS) methimazone hấp thụ cực đại bước sóng 254 nm với thời gian lưu tương ứng 7,6 25,8 phút Khối phổ phân tử ES IS tương ứng 230m/z 115m/z Nghiên cứu Ancanion cộng (2010) cho thấy ESH dịch chiết nấm kim châm có khả ức chế hoạt động enzyme polyphenoloxydase (PPO) ngăn chặn biến đen tôm Trong nghiên cứu này, hoạt tính ức chế enzyme PPO dịch chiết nấm rơm trình bày đồ thị hình Hình Khả ức chế enzyme PPO dịch chiết nấm rơm Từ kết hình cho thấy dịch chiết nấm rơm có khả ức chế enzyme PPO Hoạt tính ức chế emzyme PPO dịch chiết nấm rơm Số 4/2013 hệ phản ứng sau 10 phút 48% Theo nghiên cứu Ancanacion cộng (2010) cho thấy hoạt tính ức chế enzyme PPO dịch chiết nấm kim châm phân tích điều kiện tương tự 53% Kết cho thấy khả ức chế enzyme PPO dịch chiết nấm rơm dịch chiết nấm kim châm xấp xỉ nên sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn biến đen tơm q trình bảo quản IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp để chuẩn bị dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa từ nấm rơm là: - Nhiệt độ chiết: 95OC - Thời gian chiết: 60 phút - Tỷ lệ nấm/nước: 1/10 Dịch chiết nấm rơm thu có chứa 5,013 ± 0,176 mg ESH /l có khả ức chế 48% enzyme PPO hệ phản ứng sau 10 phút Kiến nghị Dịch chiết nấm rơm có hoạt tính chống oxy hóa ức chế enzyme PPO nên nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn oxy hóa lipid biến đen tơm q trình bảo quản TÀI LIỆU THAM KHẢO Akata I., Ergonul B., Kalyoncu F., 2012 Chemical Compositions and Antioxidant Activities of 16 Wild Edible Mushroom Species Grown in Anatolia International Journal of Pharmacology, 8: 134-138 Anthony M M., Joyce C., 2007 Proximate and nutrient composition of three types of indigenous edible wild mushrooms grown in Tanzania and their utilization prospects African Journal of Food Agriculture Nutrition and Development, 7(6): 1-16 Bao H N D., Shinimiya Y., Ikeda H., Ohshima T., 2009 Preventing discoloration and lipid oxidation in dark muscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom (Flammulina velutipes) cultured medium Aquaculture, 295: 243-249 Bao H N D., Osako K., Ohshima T., 2010 Value-added use of mushroom ergothioneine as a colour stabilizer in processed fish meats Journal of the Science of Food and Agriculture, 90 (10): 1634-1641 Chen S N., 2007 Application of Mushroom Immunomodulatory Peptides, β-Glucans and Fibrolytic Enzymes on Cancer and Cardiovascular Disease Department of Life Science National Taiwan University Chairman, Taiwan Beta-Glucan Association Encarnacion A B., Fagutao F., Hirono I., Ushio H., and Ohshima T., 2009 Effects of ergothioneine from mushrooms (Flammulina velutipes) on melanosis and lipid oxidation of Kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus) Food Chemistry, 105: 727–735 Fu H., Shieh D., Ho C., 2002 Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms Journal of Food Lipids, 9: 35–46 Jang M S., Sanada A., Ushio H., Tanaka M., Ohshima T., 2003 Inhibitory effect of enokitake extract on melanosis of shrimp Fisheries Science, 69 (2): 379–384 Oyaizu, M., 1986 Studies on products of browning reaction antioxidative activity of products of browning reaction prepared from glucosamine Japan Journal of Nutrition, 44: 307–315 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 99 ... hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết nấm rơm trình bày đồ thị hình Hình Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến... cộng sự, 2009),… Nấm rơm loài trồng phổ biến Việt Nam có hoạt tính chống oxy hóa cao (Fu cộng sự, 2002) Tuy nhiên, nghiên cứu chiết tách đánh giá hoạt tính chất chống oxy hóa từ nấm rơm cịn hạn chế... Kiến nghị Dịch chiết nấm rơm có hoạt tính chống oxy hóa ức chế enzyme PPO nên nghiên cứu sử dụng dịch chiết nấm rơm để ngăn chặn oxy hóa lipid biến đen tơm trình bảo quản TÀI LIỆU THAM KHẢO Akata