nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ tim sen

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHAN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ TIM SEN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Nha Trang, tháng năm 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHAN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ TIM SEN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm GVHD: TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Nha Trang, tháng năm 2012 -i- LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp nỗ lực thân em nhận nhiều giúp đỡ Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa công nghệ thực phẩm niềm kính trọng, tự hào học tập Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc em xin gửi đến thầy TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo tận tình hướng dẫn động viên em suốt trình thực đồ án tốt nghiệp Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ thầy cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm Viện Công nghệ Sinh học Mơi trường giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian em thực đồ án Cuối em xin cám ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện, động viên khích lệ để em vượt qua khó khăn q trình học tập vừa qua Nha Trang, ngày 20 tháng năm 2012 Sinh viên Phan Thị Kim Ngân - ii - MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH .vi LỜI NÓI ĐẦU viii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tìm hiểu sen 1.1.1 Giới thiệu sen 1.1.2 Nguồn gốc sen 1.1.3 Đặc tính thực vật sen 1.1.4 Phân bố sinh thái 1.1.5 Giới thiệu tim sen .3 1.1.6 Giá trị sen 1.1.6.1 Thành phần hóa học phận sen 1.1.6.2 Công dụng phận sen y học 1.1.6.3 Sự hữu dụng phận sen đời sống 12 1.1.6.4 Hiệu kinh tế sen 12 1.1.6.5 Thị trường sen 14 1.2 Tìm hiểu chung chất chống oxy hóa 15 1.2.1 Q trình oxy hóa gốc tự 15 1.2.1.1 Quá trình oxy hóa 15 1.2.1.2 Gốc tự 15 1.2.1.3 Nguồn gốc hình thành gốc tự 16 1.2.1.4 Ảnh hưởng gốc tự thể 16 1.2.2 Chất chống oxy hóa 18 1.2.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa 18 1.2.2.2 Sự chống oxy hóa 18 - iii - 1.2.2.3 Tác dụng chất chống oxy hóa 18 1.2.2.4 Các chất chống oxy hóa có tự nhiên 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất 26 2.1.1 Nguyên liệu 26 2.1.2 Hóa chất 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 27 2.2.1.1 Thí nghiệm ảnh hưởng loại dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 27 2.2.1.2 Thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến hoạt chất chống oxy hóa dịch chiết tim sen 29 2.2.1.3 Thí nghiệm ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 31 2.2.1.4 Thí nghiệm ảnh hưởng thời gian đến đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 33 2.2.1.5 Thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 34 2.2.2 Các phương pháp phân tích 36 2.2.2.1 Phương pháp xác đinh độ ẩm 36 2.2.2.2 Phương pháp phân tích khả khử gốc tự DPPH 36 2.2.2.3 Phương pháp phân tích tổng lượng khử 36 2.3 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Ảnh hưởng loại dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 37 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 39 - iv - 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 41 3.4 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 43 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 46 3.6 Đề xuất quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen 48 3.6.1 Sơ đồ quy trình 48 3.6.2 Thuyết minh quy trình 48 3.6.3 Hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng alkaloid dịch chiết 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 54 -v- DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DM : Dung môi NL/DM : Nguyên liệu/ dung môi h : Giờ CTV : Cộng tác viên HCM : Hồ Chí Minh TNLK : Tổng lực khử - vi - DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đặc tính thực vật sen Hình 1.2 Tim sen khô .4 Hình 1.3 Hạt sen Hình 1.4 Gương sen Hình 1.5 Tua nhị sen Hình 1.6 Hạt gạo Hình 1.7 Lá sen Hình 1.8 Ngó sen Hình 1.9 Nguồn gốc hình thành gốc tự 16 Hình 1.10 Cơ chế tác động gốc tự tế bào 17 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng loại dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 27 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 29 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 31 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 33 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ đến khả chiết rút chất chống oxy hóa 35 Hình 3.1 Ảnh hưởng dung mơi chiết đến khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ tim sen 37 Hình 3.2 Ảnh hưởng dung môi chiết đến tổng lực khử dịch chiết từ tim sen 38 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi chiết đến khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ tim sen 39 - vii - Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến tổng lực khử dịch chiết từ tim sen 40 Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ tim sen 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến tổng lực khử dịch chiết từ tim sen 42 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ tim sen 44 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian chiết đến tổng lực khử dịch chiết từ tim sen 44 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả khử gốc tự DPPH dịch chiết từ tim sen 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tổng lực khử dịch chiết từ tim sen 47 Hình 3.11 Quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen 48 DANH MỤC BẢNG Bảng Các polyphenol chính, nguồn gốc tính chất chúng 20 - viii - LỜI NÓI ĐẦU Từ xưa, sen tơn thờ lồi hoa đẹp, khuyết, gắn liền với giới tâm linh người Việt Sen vừa làm cảnh, vừa làm thực phẩm lại cho nhiều vị thuốc quý Các phận sen từ rễ đến hầu hết có ích Trong sống thường nhật sen ln gắn bó với sinh hoạt người Lá sen gói cốm làng Vịng, hoa sen khơng thể thiếu buổi lễ hội Hạt gạo nhị sen nguyên liệu ướp chè hảo hạng, ngó sen làm nộm, hạt sen làm mức, nấu chè… ăn khó quên người Việt Cây sen vơ hữu ích Với y học cổ truyền, sen cho nhiều vị thuốc quý có giá trị Kết nghiên cứu đại cho thấy, tim sen có tác dụng hạ huyết áp thông qua chế làm giãn trơn thành mạch máu giảm trở lực huyết quản, phòng chống rối loạn nhịp tim, ức chế trình ngưng tập tiểu cầu, chống oxy hóa Nó cải thiện tình trạng thiếu máu tim nhờ khả làm giãn thành mạch máu, giảm lượng tiêu thụ oxy tim cải thiện lưu lượng tuần hoàn động mạch vành Ngày nay, khoa học chứng minh gốc tự do, sinh q trình stress oxy hóa, khơng nguyên nhân gây nên lão hóa mà cịn đồng phạm gây bệnh thường gặp bệnh tim mạch, xương khớp, sa sút trí tuệ, đái tháo đường, ung thư Các chất có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ quan (não, tim, mạch máu, gan, thận) khỏi tác động xấu stress oxy hóa Từ phân tích đó, kết hợp kiến thức học bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu ứng dụng Được hướng dẫn TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, em thực đề tài “ Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tim sen” - 48 - 3.6 Đề xuất quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen 3.6.1 Sơ đồ quy trình Tim sen khô Xay nhỏ Dung môi: acetone 90% Tỷ lệ NL/DM: 1/10 Nhiệt độ chiết: 600C Thời gian chiết: 15h Chiết Lọc Bã Dịch chiết tim sen có hoạt tính chống oxy hóa Hình 3.11 Quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen 3.6.2 Thuyết minh quy trình - Ngun liệu: Lựa chọ loại tim sen có tạp chất,có nguồn gốc thu mẫu cách Tim sen cần bảo quản điều kiện thích hợp, tránh hút ẩm, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sang mặt trời Vì số thành phần tim sen bị phân hủy gây hao hụt làm biến tính giá trị chúng Do tim sen đựng bì kín để bong tối - 49 - - Xay nhỏ: Tim sen sau chọn lựa kỹ mang xay nhỏ máy xay sinh tố Qúa trình xay nhỏ ngun liệu nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào, tạo điều kiện cho dung môi dễ thấm ước vào dược liệu, chất tan dễ khuếch tán vào dung mơi Từ giúp cho q trình chiết diễn nhanh triệt để - Chiết: Tim sen xay nhỏ cho vào lọ thủy tinh có nắp đậy kín tránh tượng dung mơi bay trình ngâm chiết Ta tiến hành chiết điều kiện: dung môi chiết acetone 90% (tỷ lệ acetone/nước 9:1), tỷ lệ NL/DM 1/10, thời gian chiết 15 nhiệt độ chiết 600C Thực công đoạn chiết theo phương pháp ngâm Khi gia nhiệt cho trình chiết sử dụng bể điều nhiệt - Lọc: Lọc nhằm mục đích loại bỏ hợp chất không tan khỏi hỗn hợp chiết thu hồi dịch chiết Tiến hành lọc điều kiện phòng sử dụng giấy lọc Whatman 01 - Dịch chiết: Sau lọc thu dịch chiết từ tim sen 3.6.3 Hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng alkaloid dịch chiết Theo tài liệu tham khảo tâm sen chứa hàm lượng alkaloid toàn phần 0.89- 1.06% Nhưng theo kết nghiên cứu hàm lượng alkaloid dịch chiết từ tim sen chiết dung môi acetone 90%, tỷ lệ NL/DM 1/10, chiết 15 600C 0.6mg/ml Vậy hàm lượng alkaloid tim sen mà ta chiết 0.6% Giải thích: - Tùy vào điều kiện nguyên liệu mà ta tách chiết hàm lượng alkaloid khác - 50 - - Phương pháp chiết tách sử dụng phương pháp ngâm đơn giản, hiệu xuất chiết thấp nên hàm lượng chất chống oxy hóa chiết không triệt để - Nguyên liệu dùng nghiên cứu thu mua chợ Xóm Mới dạng phơi khô ánh nắng mặt trời nên phần chất nguyên liệu bị phân hủy có alkaloid Vì hàm lượng alkaloid tim sen theo nghiên cứu thấp so với thực tế Dịch chiết tim sen chiết theo quy trình có khả khử gốc tự DPPH 6,21 mM/ml, tổng lực khử 1ml mẫu 1,78 hàm lượng alkaloid 0,6% - 51 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua tháng thực thực đồ án em rút số kết luận sau: - Đã xây dựng quy trình tách chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen - Xác định chế độ chiết là:  Dung môi chiết: acetone 90%  Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi: 1:10  Thời gian chiết: 15  Nhiệt độ chiết: 600C - Hàm lượng chất chống oxy hóa dịch chiết tim sen chủ yếu alkaloid chiếm 0,6% Kiến nghị Mặc dù cố gắng trình làm đề tài, song thời gian điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài cịn nhiều hạn chế thiếu sót Do em xin đề xuất số ý kiến sau: - Cần nghiên cứu thêm phương pháp thu hoạch bảo quản tim sen nguyên liệu từ lúc tươi để hạn chế tổn thất thành phần quý tim sen, đồng thời có nguyên liệu chiết thời gian trái vụ - Tiếp tục nghiên cứu quy trình đặc biệt cơng đoạn chiết (thực chiết mơi trường có pH khác nhau, thực chiết nhiều loại dung mơi khác,…) Vì vấn đề nghiên cứu nước Ngồi ta nên nghiên cứu thêm quy trình cho sản phẩm chất chiết khơ - Nghiên cứu quy trình chiết chất chống oxy hóa từ phận khác sen - Cần nghiên cứu khả ứng dụng rộng rãi chế phẩm vào lĩnh vực: thực phẩm, dược phẩm, y học, mỹ phẩm… TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Xuân Cường (2009), Nghiên cứu thu nhận dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ rong nâu Dictyota Dichotoma Việt Nam, Luận văn thạc sỹ, Đại học Nha Trang Vũ Thị Kim Dung (2010), Nghiên cứu quy trình chiết Phlorotannin từ rong Sargassum Cristaefolium – Khánh Hòa, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang Nguyễn Quốc Huy (2005), tổng kết theo dõi mô hình trồng sen xã Định Thành huyện Thoại Sơn tỉnh An Giang mùa lũ 2004, đồ án tốt nghiệp, Đại học An Giang Từ Minh Kóong, Kỹ thuật sản xuất dược phẩm tập I, nhà xuất y học Hà Nội – 2007 Đỗ Minh Phụng, Đặng Văn Hợp (1997), Phân tích kiểm nghiệm sản phẩm thủy sản,Trường Đại học Thủy Sản Nha Trang Lê Ngọc Thụy, Các q trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm, nhà xuất Bách Khoa Hà Nội TS Phan Xuân Vận, TS Nguyễn Tiến Qúy giáo trình hố keo, hà nỘi – 2006 Nguyễn Đắc Vinh, Nghiên cứu tách chiết xác định hoạt tính chống oxy hóa polyphenol từ vỏ khoai tây khoai lang, ứng dụng bảo quản thực phẩm, Đề tài nghiên cứu khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên, 2009 Dongmei Yang ME1, Qiushuang Wang ME1, Leqin Ke BE1,2, Jianmei Jiang BE1 and Tiejin Ying PhD1, antioxidant activities of various extracts of lotus (Nelumbo nuficera Gaertn) rhizome (2007);16 (Suppl 1):158-163 10 Kai Marxen, Klaus Heinrich Vanselow, Sebastian Lippemeier, Ralf Hintze, Andreas Ruser and Ulf-Peter Hansen Determination of DPPH radical oxidation caused by methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis of spectrophotometric measurements 11 Lan Zhang1*, Ying Shan2, Keji Tang3 and Ramesh Putheti4, Ultrasound-assisted extraction flavonoids from Lotus (Nelumbo nuficera Gaertn) leaf and evaluation of its anti-fatigue activity (2009), Vol (8), pp 418-422 12 Lisu Wang1, Jui-Hung Yen1,2, Hsiao-Ling Liang3 and Ming-Jiuan Wu1,3*, Antioxidant effect of methanol extracts from lotus plumule and blossom (nelumbo nucifera gertn.), Journal of Food and Drug Analysis, Vol 11, No 1, 2003, Pages 60-66 13 Mohammad Arfan1,4, Hazrat Amin1, Magdalena Karamac´2, Agnieszka Kosin´Ska2, Fereidoon Shahidi3, Wiesław Wiczkowski2 And Ryszard Amarowicz2 (2006), Antioxidant activity of extracts of mallotus philippinensis fruit and bark, Journal of Food Lipids 14 (2007) 280–297 14 Saengkhae C, Arunnopparat, Sungkhajorn P, Antioxidative Activity of the leaf of Nelumbo nucifera Gaertn On Oxidative Stress- Induced Erythrocyte Hemolysis in Hypertensive and Normotensive rát, vol 20 No Sep 2007-Feb 2008 15 Sridhar, K.R and Bhat, R (2007) Lotus A potential nutraceutical s ource Journal of Agricultural Technology 3(1): 143-155 16 Vikrant Arya* and Vivek Kumar Gupta, Chemistry And Pharmacology Of Plant Cardioprotectives: A Review ( , Vol 2(5): 1156-1167 17 Wang Xi-Xi，Zheng Tie-song*，LI Qi-hong, Optimization of Ethanol Extraction Conditions of Antioxidant Compounds from Lotus Seeds Using Response Surface Methodology (2009), Vol 30 18 Yan-Bin Wu 1#, Li-Jun Zheng 1#, Jun Yi 2, Jian-Guo Wu1, Chun-Jiang Tan1, Ti-Qiang Chen 3, Jin-Zhong Wu 1* and Ka-Hing Wong4*, A comparative study on antioxidant activity of ten different parts of Nelumbo nucifera Gaertn (2011), Vol 5(22), pp 2454-2461 19 Yong-Seo Park,1 Korsak Towantakavanit,2 Teresa Kowalska,3 Soon-Teck Jung,2 Kyung-Sik Ham,2 Buk-Gu Heo,4 Ja-Yong Cho,5 Jae-Gill Yun,6 Hyun-Ju Kim,7 and Shela Gorinstein8, Bioactive Compounds and Antioxidant and Antiproliferative Activities of Korean White Lotus Cultivars (2009), 1057–1064 20 Zaixiang Lou, Hongxin Wang*, Jing Li, Song Zhu, Wenping Lu and Chaoyang Ma, Effect of simultaneous ultrasonic/microwave assisted extraction on the antioxidant and antibacterial activities of burdock leaves (2011), Vol 5(22), pp 5370-5377 21 http://baigiang.violet.vn 22 Google.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: Xác định hàm lượng ẩm phương pháp xấy [1] a) Nguyên lý: Dùng nhiệt độ cao để làm bay mẫu thử, sau dựa vào hiệu số khối lượng mẫu thử trước sau sấy khơ từ tính hàm lượng nước thực phẩm (%) b) Dụng cụ hóa chất: - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ - Cân phân tích độ xác 10-4g - Đũa thủy tinh - Bình hút ẩm c) Tiến hành: Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc rửa sạch, úp khô, sấy nhiệt độ 100 C ÷ 1050C khoảng sau lấy làm nguội bình hút ẩm mang cân sấy tiếp nhiệt độ trên, làm nguội bình hút ẩm cân đến hai lần cân lien tiếp sai khác khối lượng không 5.10-4g (sấy đến khối lượng khơng đổi) Cân xác lượng tim sen say nhỏ (khoảng 10g) vào cốc sấy khô đến khối lượng không đổi Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu dàn mẫu đáy cốc Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 600C ÷ 800C Sau nâng nhiệt độ lên 1000C ÷ 1050C, sấy liên tục Chú ý, trình sấy sau đảo mẫu lần Lấy mẫu để nguội bình hút ẩm, sau mang cân cân phân tích sấy tiếp nhiệt độ 1000C ÷ 1050C đến khối lượng khơng đổi d) Tính kết quả: Độ ẩm tim sen tính theo cơng thức: Trong đó: X: Độ ẩm (hàm lượng nước) tim sen (%) G1: Khối lượng cốc sấy mẫu thử trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc sấy mẫu thử sau sấy (g) G: Khối lượng cốc sấy (g) Phụ lục 2: phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa a) Phương pháp xác định khả khử gốc tự [7,9] - Nguyên tắc: chất nguyên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cở chế dập tắt gốc tự làm giảm màu dd DPPH - Xác định khả cách đo độ hấp thụ bước sóng có hấp thụ cực đại 517 nm - Mô tả: Dùng 0,1-0,2 ml mẫu cần đo cho vào 1,8-1,9 ml nước cất cho vào ml cồn cuối thêm ml dd DPPH (nồng độ 0,1nM pha etanol) Hỗn hợp lắc để nhiệt độ phịng 30 phút bóng tối Mỗi lần đo mẫu lấy giá trị trung bình Mẫu trắng tiến hành điều kiện thay mẫu nước cất Sau đem mẫu đo máy UV-Vis bước sóng 517 nm - Tính kết S (%)= Acontrol - Asample Acontrol x100 Trong đó: S: Khả khử gốc tự (%) Acontrol: độ hấp thụ dịch chiết tim sen Asample: độ hấp thụ mẫu trắng ( không chứa dịch chiết nguyên liệu) - Xác định khả bắt gốc tự DPPH dung dịch phương pháp dựa vào đường chuẩn - Xây dựng đường chuẩn: Pha 50 ml DPPH 0,1 nm cách cân 0,00197 g DPPH pha vào 50 ml etanol  ml DPPH + ml nước cất + ml etanol  0,8 ml DPPH + 2,2 ml nước cất + ml etanol  0,6 ml DPPH + 2,4 ml nước cất + ml etanol  0,4 ml DPPH + 2,6 ml nước cất + ml etanol  0,2 ml DPPH + 2,8 ml nước cất + ml etanol Hốn hợp đo bước sóng 517 nM máy đo quang phổ UVis ta kêt : 0.35 y = 2.444x - 0.005 0.30 Asb 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Nồng độ DPPH (mM) b.Xác định tổng lực khử Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0,1-0,2 ml mẫu cần đo tiếp cho 0,5 ml K 3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,8- 0,9 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml Hỗn hợp đem ủ 500C 20 phút Sau ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5 ml CCl3COOH 10% Tiếp tục bổ sung từ từ ml nước cất 0,4 ml FeCl3 0,1% Tương tự đo khử gốc tự DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng không cho mẫu đo mà thay dung dịch đệm Khả khử hỗn hợp đo bước sóng 700nm sử dụng máy đo quang phổ UVis Phụ lục 3: Phương pháp xác định hàm lượng alkaloid Cô đặc dịch chiết thiết bị cô quay chân không Sau thu cao dịch chiết, bổ sung 15 ml nước cất, lắc sau điều chỉnh pH=2 dung dịch H2SO4 5% Dùng chloroform theo tỷ lệ 1/3 Sau lắc Dịch bị phân thành lớp chất lỏng, loại phần chất lỏng trên, chất khơng phải alkaloid Sau điều chỉnh tiếp pH=8-10 NaOH 10% Cho chloroform vào, lắc Dung dịch phân thành lớp, lớp phía phần alkaloid cần thu Tiếp tục sử dụng thiết bị cô quay chân không, đuổi hết clorofoc Phần chất khơ thu alkaloid Mang cân, xác định hàm lượng alkaloid mẫu Phụ lục 4: Số liệu kết thí nghiệm Bảng 3.1 Nồng độ DPPH (nm) bị khử dịch chiết từ tim sen với loại dung môi khác Dịch chiết sau lọc đem pha loãng với hệ số pha lỗng k=9 sau đem xác định nống độ DPPH bị khử Dung môi OD sau pha loãng Lần OD trước pha loãng Lần Nồng độ DPPH bị ĐLC Lần khử (mM/ml) Nồng độ DPPH ( mM/ml) DPPH Lần Lần DPPH Lần Lần Ban đầu Lần Lần Methanol 0.234 0.152 0.157 0.145 21.06 13.68 14.13 13.05 8.62 5.60 5.78 5.34 3.04 0.128 Ethanol 0.234 0.183 0.174 0.188 21.06 16.47 15.66 16.92 8.62 6.74 6.41 6.92 1.93 0.151 Aceton 0.234 0.141 0.146 0.137 21.06 12.69 13.14 12.33 8.62 5.19 5.38 5.05 3.41 0.096 Bảng 3.2 Tổng lực khử dịch chiết tim sen với loại dung môi khác Dung môi Đo lần Đo lần Đo lần TBC Độ lệch chuẩn Methanol 0.340 0.387 0.347 0.358 0.015 Ethanol 0.273 0.251 0.243 0.256 0.009 Acetone 0.425 0.487 0.501 0.471 0.023 Bảng 3.3 Nồng độ DPPH (nm) bị khử dịch chiết từ tim sen với nồng độ dung môi khác Dịch chiết sau lọc đem pha loãng với hệ số pha lỗng k=9 sau đem xác định nống độ DPPH bị khử 50 0.275 0.198 0.200 0.201 24.75 17.82 18.00 18.09 10.13 7.29 7.36 Nồng độ DPPH bị ĐLC Lần khử (mM/ml) 7.40 2.77 0.03 60 0.275 0.194 0.198 0.205 24.75 17.46 17.82 18.45 10.13 7.14 7.29 7.55 2.80 0.12 70 0.275 0.199 0.198 0.203 24.75 17.91 17.82 18.27 10.13 7.33 7.29 7.48 2.76 0.06 80 0.275 0.188 0.187 0.193 24.75 16.92 16.83 17.37 10.13 6.92 6.89 7.11 3.15 0.07 90 0.275 0.187 0.190 0.182 24.75 16.83 17.10 16.38 10.13 6.89 7.00 6.70 3.26 0.09 100 0.275 0.226 0.226 0.219 24.75 20.34 20.34 19.71 10.13 8.32 8.32 8.06 1.89 0.09 OD sau pha loãng Nồng độ Lần Lần Lần (%) DPPH OD trước pha loãng Lần Nồng độ DPPH ( mM/ml) DPPH Lần Lần Ban đầu Lần Lần Bảng 3.4 Tổng lực khử dịch chiết tim sen với nồng độ dung môi khác Nồng độ (%) 50 60 70 80 90 100 Đo lần 0.245 0.275 0.371 0.602 0.998 1.115 Đo lần 0.183 0.298 0.452 0.678 1.089 1.126 Đo lần 0.21 0.283 0.37 0.669 1.072 1.027 TBC 0.213 0.285 0.398 0.650 1.053 1.089 Độ lệch chuẩn 0.018 0.007 0.027 0.024 0.028 0.031 Bảng 3.5 Nồng độ DPPH (nm) bị khử dịch chiết từ tim sen với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi khác Dịch chiết sau lọc đem pha loãng với hệ số pha lỗng k=9 sau đem xác định nống độ DPPH bị khử Tỷ lệ NL/DM OD sau pha loãng OD trước pha loãng Nồng độ DPPH Nồng độ (mM/ml) DPPH bị ĐLC khử Ban Lần Lần Lần đầu (mM/ml) 8.06 6.19 6.19 6.30 1.84 0.04 1:05 0.219 Lần Lần Lần Lần Lần Lần DPPH 3 0.168 0.168 0.171 19.71 15.12 15.12 15.39 1:10 0.219 0.155 0.149 0.152 19.71 13.95 13.41 13.68 8.06 5.71 5.49 5.60 2.47 0.06 1:15 0.219 0.145 0.147 0.147 19.71 13.05 13.23 13.23 8.06 5.34 5.41 5.41 2.68 0.02 1:20 0.219 0.141 0.142 0.138 19.71 12.69 12.78 12.42 8.06 5.19 5.23 5.08 2.90 0.04 1:25 0.219 0.136 0.138 0.139 19.71 12.24 12.42 12.51 8.06 5.01 5.08 5.12 2.99 0.03 DPPH Bảng 3.6 Tổng lực khử dịch chiết tim sen với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi khác Tỷ lệ NL:DM Đo lần Đo lần Đo lần TBC Độ lệch chuẩn 1:05 0.376 0.411 0.387 0.391 0.010 1:10 0.597 0.592 0.595 0.595 0.001 1:15 0.619 0.61 0.615 0.615 0.003 1:20 0.625 0.623 0.63 0.626 0.002 1:25 0.654 0.647 0.65 0.650 0.002 Bảng 3.7 Nồng độ DPPH (nm) bị khử dịch chiết từ tim sen với thời gian chiết khác Dịch chiết sau lọc đem pha loãng với hệ số pha lỗng k=9 sau đem xác định nống độ DPPH bị khử 0.5 0.238 0.184 0.179 0.179 21.42 16.56 16.11 16.11 8.76 6.78 6.59 Nồng độ DPPH bị ĐLC Lần khử (mM/ml) 6.59 2.11 0.06 0.238 0.175 0.176 0.175 21.42 15.75 15.84 15.75 8.76 6.44 6.48 6.44 2.31 0.01 1.5 0.238 0.174 0.173 0.172 21.42 15.66 15.57 15.48 8.76 6.41 6.37 6.33 2.39 0.02 0.265 0.144 0.145 0.142 23.85 12.96 13.05 12.78 9.76 5.30 5.34 5.23 4.47 0.03 10 0.265 0.132 0.132 0.135 23.85 11.88 11.88 12.15 9.76 4.86 4.86 4.97 4.86 0.04 15 0.265 0.129 0.127 0.131 23.85 11.61 11.43 11.79 9.76 4.75 4.68 4.82 5.01 0.04 20 0.265 0.125 0.123 0.125 23.85 11.25 11.07 11.25 9.76 4.60 4.53 4.60 5.18 0.02 25 0.265 0.123 0.122 0.119 23.85 11.07 10.98 10.71 9.76 4.53 4.49 4.38 5.29 0.04 30 0.265 0.129 0.131 0.132 23.85 11.61 11.79 11.88 9.76 4.75 4.82 4.86 4.95 0.03 OD sau pha loãng Thời gian Lần Lần Lần (giờ) DPPH OD trước pha loãng Lần Nồng độ DPPH ( mM/ml) DPPH Lần Lần Ban đầu Lần Lần Bảng 3.8 Tổng lực khử dịch chiết tim sen với thời gian chiết khác Thời gian chiết (giờ) 0.5 1.5 10 15 20 25 30 Đo lần Đo lần Đo lần TBC Độ lệch chuẩn 0.361 0.421 0.436 0.752 0.847 0.992 1.002 1.002 0.912 0.359 0.413 0.437 0.77 0.832 0.981 0.994 0.998 0.901 0.393 0.422 0.462 0.768 0.844 0.993 0.979 1.011 0.914 0.371 0.419 0.445 0.763 0.841 0.989 0.992 1.004 0.909 0.008 0.002 0.006 0.004 0.003 0.003 0.005 0.003 0.003 Bảng 3.9 Nồng độ DPPH (nm) bị khử dịch chiết từ tim sen với nhiệt độ chiết khác Dịch chiết sau lọc đem pha loãng với hệ số pha lỗng k=11 sau đem xác định nống độ DPPH bị khử 30 0.257 0.147 0.145 0.145 28.27 16.17 15.95 15.95 11.57 6.62 6.53 Nồng độ DPPH bị Lần khử (mM/ml) 6.53 5.01 40 0.257 0.141 0.138 0.142 28.27 15.51 15.18 15.62 11.57 6.35 6.21 6.39 5.25 0.05 50 0.246 0.121 0.124 0.123 27.06 13.31 13.64 13.53 11.07 5.45 5.58 5.54 5.55 0.04 60 0.246 0.112 0.107 0.105 27.06 12.32 11.77 11.55 11.07 5.04 4.82 4.73 6.21 0.09 70 0.235 0.102 0.102 0.107 25.85 11.22 11.22 11.77 10.58 4.59 4.59 4.82 5.91 0.07 OD sau pha loãng Nhiệt độ DPPH Lần Lần Nồng độ DPPH ( mM/ml) OD trước pha loãng Lần DPPH Lần Lần Lần Ban đầu Lần Lần Bảng 3.10 Tổng lực khử dịch chiết từ tim sen với nhiệt độ chiết khác Nhiệt độ chiết (0C) 30 40 50 60 70 OD sau pha loãng TNLK 1ml mẫu Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0.163 0.233 0.28 0.353 0.341 0.156 0.235 0.276 0.355 0.335 0.167 0.239 0.284 0.36 0.337 0.82 1.17 1.40 1.77 1.71 0.78 1.18 1.38 1.78 1.68 0.84 1.20 1.42 1.80 1.69 TBC ĐLC 0.81 1.18 1.40 1.78 1.69 0.03 0.01 0.02 0.01 0.01 ĐLC 0.03 ... “ Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tim sen? ?? - ix - Nội dung thực đề tài Khảo sát ảnh hưởng dung mơi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tim sen. .. chống oxy hóa dịch chiết tim sen 43 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết tim sen 46 3.6 Đề xuất quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ tim sen 48 3.6.1... dịch chiết từ tim sen Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tim sen Đề xuất quy trình chiết tách chất chống oxy hóa từ tim sen Với cố gắng để hồn