nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60. 42. 30 HÀ NỘI – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60. 42. 30 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu HÀ NỘI – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoài Châu – Viện trƣởng Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hƣớng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ thân Môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng đặc biệt là PGS.TSKH. Ngô Quốc Bƣu đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt – Trung tâm ứng dụng Khoa học & Công nghệ Nha Trang đã hƣớng dẫn tận tình và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi. Tôi cũng xin bày tỏ sự cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào tạo sau Đại học - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác tại Việt Nam. Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate Tris.Base Tris (hydroxy methyl) amiomethane (HOCH 3 )CNH 2 TEMED Trichloroacetic acid kb kilo base kDa kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction U Unit ADN Acid Deoxyribonucleic EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid TCA Trichloroacetic acid OD Optical density SDS-PAGE Sodium dodecylSulphate polyacrylamide gel Electrophorei SDS Sodium dodecyl sulphate DEP Diethoxylphosphoryl DFP Di-isopropylfluorophosphate 3,4-DCI 3,4-Dichloroisocoumarin PMSF Phenylmethysulfonyl fluoride TLCK Tosyl-L-lysine Chloromethyl Ketone PCMB P-Chloromercuribenzoate v/p vòng/phút v/v Volume/volume Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính protease từ mẫu Nhà máy chế biến hải sản Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính dịch chiết chạy qua màng lọc 50kDa Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính với casein sau khi ủ với casein Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính protease với mẫu mua ghẹ Bảng 3.5. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của enzyme Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 30%; 40% Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 50% Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 60%;70% và 80% Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 90% Bảng 3.10. Hoạt tính và hiệu suất thu hồi ở các tỉ tệ cồn khác nhau Bảng 3.11. Kết quả thử hoạt tính ở các tốc độ li tâm khác nhau. Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (10kDa;50kDa). Bảng 3.13. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (50kDa;100kDa). Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính theo các phân đoạn (NH 4 ) 2 SO 4 Bảng 3.15. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme Bảng 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme Bảng 3.18. Hàm lượng protease thu được so sánh với mẫu của Nga Bảng 3.19. Kết quả mẫu đem chạy điện di Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme protease Hình 1.4. Sơ đồ phân loạ i protease Hình 1.5. Sơ đồ cơ chế xúc tác trung tâm hoạt động của enzyme Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của cysteine protease. Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease Hình 1.8. Mô hình phân tử enzyme protease Hình 1.9. Nội tạng cua biển Hình 1.10. Sự phân bố của cua vua đỏ (vùng màu vàng) Hình 1.11. Loài cua vua (king crab)Paralithodes camtschaticus Hình 2. Đường chuẩn Tyrosine Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cồn tới enzyme protease. Hình 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ máy lọc màng tới enzyme protease Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 SO 4 lên hoạt tính của protease Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính của enzyme protease Hình 3.5. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme Hình 3.7. Điện di đồ sau khi tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 và cồn 70% Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc…………………… 4 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE…………………….5 1.3. PHÂN LOẠI 7 1.3.1. Exopeptidase…………………………………………………………8 1.3.2. Endopeptidase 9 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE 10 1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC PHẢN ỨNG 11 1.5.1. Serine protease…………………………………………………………… 12 1.5.2. Metallo protease……………………………………………………………12 1.5.3. Cysteine protease………………………………………………… ………13 1.5.4. Aspartic protease………………………………………………… …… 14 1.6. CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE 15 1.7. NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE 18 1.7.1. Enzyme protease từ động vật 18 1.7.2. Enzyme protease từ thực vật 18 1.7.3. Enzyme protease từ vi sinh vật 19 1.7.3.1. Vi khuẩn 19 1.7.3.2. Nấm …………………………………………………………………………20 1.7.3.3. Xạ khuẩn……………………………………………………………………21 1.7.3.4. Virus…………………………………………………………………………21 1.8. TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN 22 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.1. Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển……… …….……………….22 1.8.2. Ứng dụng trong y học……………………………….……………… 24 1.8.3. Giới thiệu về loài cua nghiên cứu tại Nga………………………… 25 1.9. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE 26 1.9.1. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm………………………………27 1.9.2. Trong chế biến thuỷ sản 27 1.9.3. Trong công nghiệp chế biến sữa 28 1.9.4.Trong công nghiệp sản xuất bia 28 1.9.5. Trong công nghiệp da 28 1.9.6. Trong công nghiệp dệt 29 1.9.7. Trong công nghiệp y – dƣợc 29 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31 2.1.1. Nguyên liệu 31 2.1.2. Hoá chất 31 2.1.3. Thiết bị 32 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1. Xác định hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas theo phƣơng pháp Anson cải tiến, 1972 33 2.2.2. Xác định hàm lƣợng tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phƣơng pháp Lowry cải tiến 35 2.2.3. Phƣơng pháp định tính hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cơ chất casein 36 2.2.4. Phƣơng pháp tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas 37 2.2.5. Phƣơng pháp tinh sạch 37 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng dung dịch (NH 4 ) 2 SO 4 ………………………………………………………………………… 38 2.2.5.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng…………………………………………………………………………….… 39 2.2.5.3. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác nhau…………………………………………………………………………………40 2.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………….40 2.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas……………………………………………………41 2.2.8. Khảo sát ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………………….41 2.2.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas ……………………………………………………………42 2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide xác định khối lƣợng tổ hợp enzyme…………………………………………………………………… 42 2.2.11. Phƣơng pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme ………………… 44 3.1. Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ 2 nguồn thu nhận khác nhau 45 3.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………….48 3.2.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác nhau 48 3.2.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng 52 3.2.3. Tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển dùng (NH 4 ) 2 SO 4 54 [...]... Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều trị đặc thù Vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đề xuất đề tài: Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển ở Việt Nam, tiến tới chế tạo băng gạc điều trị vết thƣơng mang lại sản phẩm có giá trị công nghệ... Khảo sát quá trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam - Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết và đánh giá hoạt tính tổ hợp enzyme thu đƣợc 2 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE 1.1.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên... nhiều nghiên cứu tập trung vào cấu trúc không gian ba chiều của các protease virus và sự tƣơng tác của chúng với quá trình tổng hợp chất ức chế có hiệu lực trong cuộc chiến không ngừng với miễn dịch bệnh AIDS 21 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8 TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN 1.8.1 Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển Gan tụy. .. là thành quả nghiên cứu khoa học hàng chục năm qua của đội ngũ các nhà khoa học Nga Vấn đề này tại nƣớc ta hiện chƣa có cơ sở nghiên cứu khoa học nào triển khai nghiên cứu Tại Việt Nam có nhiều cơ sở chế biến sản phẩm hải sản xuất khẩu từ cua biển, trong đó phần nội tạng của cua đƣợc loại bỏ dƣới dạng chất thải Từ lâu ngƣời ta biết rằng gan tụy cua biển chứa một lƣợng đáng kể các loại enzyme tiêu hóa... Những nghiên cứu gần đây tại Việt Nam cho thấy, protease có thể đƣợc thu nhận từ rất nhiều nguồn khác nhau Tại các phòng thí nghiệm trọng điểm của các Viện nghiên cứu, các trung tâm nghiên cứu hoặc từ một số trƣờng đại học lớn trên cả nƣớc đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và tìm các điều kiện ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme này Chúng ta có thể thu nhận enzyme protease từ ruột cá basa [5], từ vi... vi sinh vật Hiện nay từ gan tụy cua ngƣời ta có thể thu nhận chế phẩm enzyme có độ sạch cao chứa chất xúc tác hydrolase, cụ thể là tổ hợp enzyme hepatopancreas (HP) phân giải protein có khả năng ứng dụng trong điều trị vết thƣơng tốt nhất [20] Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano chế tạo vật liệu phủ vết thƣơng trên cơ sở xenlulo đƣợc cấy enzyme phân huỷ protein là một hƣớng nghiên cứu tƣơng đối mới trên... tụy của các loài cua biển là một tổ chức kết hợp chức năng gan và túi mật, bộ phận này thƣờng tiết ra một khối lƣợng lớn các loại enzyme tiêu hóa có khả năng thuỷ phân protein, có phổ đặc trƣng rất rộng với hoạt tính cao đặc Hình 1.9 Nội tạng cua biển biệt Gan tụy thuộc loại nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền và không độc, hiện nay từ gan tụy cua ngƣời ta có thể thu nhận những chế phẩm từ enzyme có độ sạch... cách đáng kể, còn trong trƣờng hợp pH < 4.5 và pH > 10.5 thì một phần enzyme sẽ bị vô hiệu hoá không thuận nghịch [29] 1.8.2 Ứng dụng trong y học Tổ hợp enzyme hepatopancreas (HP) tách từ cua biển có thể thủy phân bất kỳ loại protein nào trong quá trình tiêu hóa bao gồm từ collagen đến các polypeptit, kể cả các cơ chất tổng hợp nhân tạo mạch ngắn Tổ hợp enzyme HP thủy phân các cơ chất nhằm vào nhóm... dƣỡng và vết sẹo sau phẫu thuật Điểm đặc biệt ở các enzyme protease thu nhận từ gan tụy 24 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn của cua biển so với các enzyme thu nhận từ nguồn khác là độ bên khá cao trong dải rộng của các yếu tố tác động [16] Các nghiên cứu cho thấy các enzyme tách chiết từ nội tạng cua cua biển chứa 4 loại bao gồm: hydrolases - protease, nucleases,... tác hyđrolase cụ thể là protease phân huỷ colagen [30] Cũng theo nghiên cứu này, ngƣời ta nhận thấy tổ hợp enzyme phân giải protein chứa nhiều men có khả năng thuỷ phân 4 lớp biopolime tự nhiên là protein, acid nucleic, polysacarit và lipit nhằm mục đích ứng dụng rộng rãi với hiệu quả cao Kết quả của giải pháp là một chế phẩm chứa nhiều enzyme: enzyme phân huỷ colagen, enzyme phụ thuộc kim loại, ribonuclease, . nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đề xuất đề tài: Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải. trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam. - Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết và đánh giá hoạt tính tổ hợp enzyme. THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN