pháp Lowry cải tiến
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein. Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bƣớc sóng 675nm. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thƣờng dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính đƣợc hàm lƣợng protein trong mẫu nghiên cứu. y = 1.6138x + 0.1122 R2 = 0.9908 O D 7 5 0 n m Nồng độ Tyrosine
36
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Phƣơng pháp Lowry đƣợc dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện đƣợc protein trong dung dịch ở nồng độ 1µg/ml. Tuy nhiên cƣờng độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein. Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cƣờng độ màu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cƣờng độ màu thấp hơn trypsin nhƣng cao hơn gelatin.
Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cƣờng độ màu phản ứng, vì vậy phƣơng pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã đƣợc tinh sạch.
Công thức tính toán
Hoạt tính riêng là số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc tính trên 1mg protein của chế phẩm. Hiệu suất thu hồi protease là tỷ lệ giữa tổng hoạt tính enzyme thu đƣợc sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt tính enzyme trong mẫu trƣớc khi đem tinh sạch.
Độ tinh sạch là tỷ lệ giữa hoạt tính riêng của enzyme thu đƣợc sau quá trình tinh sạch và hoạt tính riêng của mẫu enzyme trƣớc khi đem tinh sạch.