Quy trình nghiên cứu

Với những kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng đƣợng qui trình nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas nhƣ sau:

Nội tạng cua biển đƣợc thu nhận và bảo quản ở nhiệt độ -5 đến 60C. Tiếp theo, nội tạng cua biển đƣợc cắt nhỏ và nghiền với dung dịch đệm đệm Tris.Base theo tỷ lệ thích hợp, hỗn hợp đƣợc ngâm chiết trong 6 giờ, loại bã bằng cách ly tâm dịch nghiền. Dịch nghiền đƣợc điều chỉnh về pH 7 và keo tụ lipit bằng chitosan 0.001%. Dịch chiết đƣợc làm sạch bằng cách ly tâm. Tiếp

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

theo, chúng tôi kết tủa phân đoạn enzyme bằng cồn 70% hoặc ammonium sulfate 60% và cho dịch chiết qua màng siêu lọc 50kDa để tinh sạch enzyme. Cuối cùng, enzyme đƣợc sấy đông khô và bảo quản ở nhiệt độ thấp (40C).

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên, chúng tôi đƣa ra những kết luận nhƣ sau: 1. Sử dụng dung dịch đệm Tris.Base là thích hợp hơn so với dung dịch đệm

phosphate trong các thí nghiệm tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy của cua biển Việt nam.

2. Tổ hợp enzyme phân giải protein đƣợc tách chiết sử dụng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 60% kết hợp sử dụng phƣơng pháp lọc màng để tinh sạch tổ hợp enzyme cho khả năng thu hồi enzyme tốt nhất. Kết quả chạy điện di ho thấy tổ hợp enzyme hepatopancreas thu đƣợc từ gan tụy cua biển Việt Nam có khối lƣợng phân tử ở trong khoảng (15-60kDa). Kết quả này phù hợp với những kết quả nghiên cứu của Nga. 3. Tổ hợp enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao nhất ở 65°C. Trong khoảng khảo

sát pH 5-8 enzyme hoạt động tốt; ở khoảng pH 7 cho hoạt tính cao nhất. 4. Qua các thí nghiệm khảo sát các điều kiện ảnh hƣởng tới tổ hợp enzyme từ

gan tụy của cua biển Việt Nam chúng tôi đã đƣa ra đƣợc qui trình tách chiết.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

KIẾN NGHỊ

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đạt đƣợc trong khóa luận này, tác giả có một số kiến nghị nhƣ sau:

1. Đề tài mới nghiên cứu khảo sát bƣớc đầu qui trình tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy của cua biển Việt Nam, cần có những nghiên cứu tiếp theo để tinh sạch tổ hợp enzyme này thu đƣợc hoạt tính cao, tƣơng đƣơng với hoạt tính có trong chế phẩm enzyme của Nga (41.717 U/mg).

2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hƣởng tới hoạt tính của tổ hợp enzyme thu nhận đƣợc để cấy lên nano xenllulo ứng dụng trong việc chế tạo băng gạc điều trị vết thƣơng-hoạt tử do bị bỏng tại Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Đông Thị Thanh Thu (2000), “Nghiên cứu hoạt tính đông tụ sữa của một số protease vi sinh vật “. Kỷ yếu hội thảo khoa học Công nghệ thực phẩm và bảo vệ môi trường, Bộ Giáo dục Đào tạo, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Việt Thiết, Nguyễn Thu Hoài (1994), “Nghiên cứu khả năng phân hủy một số loại protein bằng papain”, Tạp chí Hóa học, 32, tr. 6-33

3. Phạm Trân Châu. Công nghệ enzyme và ứng dụng protese trong công nghệ chế biến, Tạp chí Thủy sản, 1, pp 18-20. (1993).

4. Lê Đức Ngọc, Trịnh Thế Hùng, Võ Sỹ Hùng (1996), “Nghiên cứu protease của bí đao, khảo sát nguồn protease trong bí đao ở Việt Nam”,

Tạp chí hóa học, 34, tr 7-63

5. Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ, T. 9, S. 11 (2006)

6. Nguyễn Minh Trí, Ngô Thị Hoài Dƣơng,Phạm Thị Mai, Đỗ Thị Ánh Hoà

Thu nhận enzyme protease từ canh cấy vi khuẩn P. aeruginosa CB07- Xác định một số tính chất của enzyme protease thu được. Khoa Chế biến, Trƣờng Đại học Nha Trang. pp 53-67 (2008)

7. Nguyễn Trọng Cẩn – Đỗ Minh Phụng, Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản- Tập 2 : Ướp muối, chế biến nước mắm, chế biến khô, thức ăn chín, NXB Nông nghiệp, 1990. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

8. Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẩn, Lê Doãn Diên (2002), Hóa Sinh công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr 428-432.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

9. A.B.Maksimenko. Modified enzymes for medical purposes with improved action.Thesis Dr. Science. Moscow, 1989, sec. 274

10. Belov AA, Belov, LA, Filatov VN, et al Interaction of protease inhibitors of blood plasma from immobilized on dialdegidtsellyuloze proteolytic complex from hepatopancreas of the crab. Herald M. Univ, Ser 2 Chemistry, 44, 1, 2003

11. Dew, C.B. 1990. Behavioural ecology of podding red king crab, Paralithodes camtschatica. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 47(10): 1944- 1958.Ser 2 Chemistry, 44, 1, 2003.

12. Barrett, A.J. (1994), “Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidase” Methods Enzymeol, 244, pp. 1-15

13. Bright, D.1967. Life histories of the king crab, Paralithodes camtschatica, and the Tanner crab, Chionoecetesbairdi, in Cook Inlet, Alaska. Ph.D. Thesis, University of Southern California, Los Angels, California, 265 pp.

14. Boyer P.D. (1971), The enzyme, 3rd ed Academic Press, Inc, NewYork, NY; = Hoffman, T. (1974). Food related enzymes. Adv. Chem. Ser. 136:146–185

15. C. Fermi and H. Pernossi, Z. Hyg. 18 (1894), p. 83.

16. Fukuhara, F.M. 1985. Biology and fishery of south-eastern Bering Sea red king crab (Paralithodes camtschatica, Tilesius). Pp. 801-982, In: NOAA Processed Rep., 85-11.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

17. Cunningham, C. W., Blackstone, N. W. & Buss, L. W. 1992 Evolution of king crabs from hermit crab ancestors. Nature 355, 539–542.

18. Cunningham, D.T. 1969. A study of the food and feding relationships of the Alaskan king crab Paralithodes camtschatica. Master thesis. State College, California, San Diego. 84 pp.

19. Sielecki A.R., Fujinaga M., Read R.J., James M.N.G. "Refined structure of porcine pepsinogen at 1.8-A resolution." J. Mol. Biol. 219:671- 692(1991).

20. Smirnov EB, Mukhin VA, Novikov VY, "The effect of temperature on the activity of digestive proteases of marine invertebrates, Bulletin of Moscow State Technical University, Volume 9, N5, 2006.

21. T. Godfrey & S. West. Industrial Enzymemology (1996). Microbiology and molecular biology reviews,62 (3):597-635

22. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (1992), enzyme nomeclature, Academic Press Inc., Corlando.

23. Rawlings, N.D. & Barrett, A.J. (1994). Families of serine peptidases.

Methods Enzymeol, 244 19-61.

24. Rao,M.B., Tanksale, A .P., Ghatge, M.S., Deshpande,V.V.1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases, pp 246- 253.

25. Novikov V.Yu. Effect of temperature on the activity of digestive proteases of marine invertebrates. Vestnik MSTU, Volume 9, N5, 2006 26. Priest, FG (1997), Extracell enzyme synthesis in the genus Bacillus”,

Bacteriol Res, 41, pp 711-753

27. Holmes, M. A. & Matthews, B. W. (1981) Binding of hydroxamic acid inhibitors to crystalline thermolysin suggests a pentacoordinate zinc intermediate in catalysis, Biochemistry 20, 6912–6920.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

28. Hocman G.: Chemoprevention of cancer: protease inhibitors. Int.J. Biochem. 9. 1365-1375. 1992.

29. Zaklan, S. D. & Cunningham, C. W. 2002 Molecular phylogeny, circumstances and consequences of the transition from hermit crabs to king crabs. Proc. R. Soc. Lond. B. (Submitted.) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

30. Kuzmin. S. & Sundet, J.H. 2000. Joint report for 2000 on the red king crab (Paralithodes camtschaticus) investigations in the Barents Sea. Basic requirements for managements of the stock. Report to the 29th Session for the Mixed Russian-Norwegian Fisheries Commission, 24 pp.

31. Kenedy A.R.: Prevention of carcinogenesis by protease inhibitors. Cancer research. 54, 1999-2005. 1994.

32. Kennedy AR. Overview: anticarcinogenic activity of protease inhibitors. In: Troll W, Kennedy AR, eds. Protease inhibitors as can-cer chemopreventive agents. New York: Plenum Press, 1993:9–64

33. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, 1970

34. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randall R. J., 1951,

“Protein measurement with the Folin phenol reagent”, J. Biol. Chem. 193, 265-275.

35. T. Godfrey & S. West. Industrial Enzymemology (1996)

36. Kulichkova, V.A. 1955. The feding pattern of the Kamchatka crabs off the coasts off Kamchatka and Sakhalin. Izvestiya Tikhookeanskogo Nauchno-Issledovatel'skovo Istituta Rybnogo Khoziaistva i Okeanografii [TINRO], 43: 21-42. [In Russian].

37. Jorgensen LL., Manushin I, Sundet JH and SR. Birkely (2005) The introduction of the marine red king crab Paralithodes camtschaticus into the southern Barents Sea. ICES Cooperative Research Report No. 277

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU TRANG WEB

38. http://tailieu.vn (Enzyme protease)

39. http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sub… 40. http://www.enzymessentials.com/HTML/pro…

41. http://www.pacseafood.com/products/king_crab.html. 42. http://www.nobanis.org/

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

PHỤ LỤC

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NANO XELLULO TRONG Y HỌC - BĂNG GẠC CỐ ĐỊNH ENZYME ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG KHÓ LÀNH

Công nghệ nanô trong y học là một phần quan trọng trong lĩnh vực công nghệ nanô hiện nay, bởi vì đó là sự tác động của các vật liệu mới, phƣơng pháp mới lên cơ thể sống, đó là sự xâm nhập của vật liệu nanô vào bên trong cơ thể sống và sự tƣơng tác giữa chúng với nhau. Trong y học công nghệ nanô có hai hƣớng chủ yếu – đó là chẩn đoán và điều trị. Trong lĩnh vực điều trị các nhà khoa học hy vọng rằng ứng dụng đáng kể nhất của y học nanô sẽ đƣợc nhanh chóng khẳng định trong quá trình giải quyết vấn đề dẫn thuốc đến các tế bào mục tiêu.

Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt (VNCVLD) Moskva đã chế tạo thành công băng gạc phủ vết thƣơng có khả năng làm sạch vết thƣơng mà không cần đến sự trợ giúp của phẫu thuật, nghĩa là có khả năng làm tan các protein hoại thƣ để chúng thấm vào lớp vải phủ. Viện đã chế tạo ra 12 chế phẩm băng gạc phủ vết thƣơng đã đƣợc Bộ Y tế LB Nga cho phép đƣa vào áp dụng trong lâm sàng . Chế phẩm cơ sở trong số đó là gạc Multiferm đƣợc cấu tạo từ vật mang là xenlulo đƣợc liên kết hóa học với men phân hủy protein là protease. Các hãng sản xuất vật liệu phủ vết thƣơng trên nền sợi xenlulo hàng đầu thế giới là Abbott, B. Brown, C.R. Bard, Bayersdorf, Conva-Tech, Johnson & Johnson, Kendall-Gelener (Taiko), Minesota Mining & Menufan- churil (3M), Smith Beachem Clip, Smith & Nephew, Sherwood Medical.

Các vật mang trên cơ sở xenlulo là vật liệu phù hợp để tiếp xúc với bề mặt da, tuy nhiên do kích thƣớc lớn và mức độ liên kết men - vật mang không phù hợp, nên việc ứng dụng bị hạn chế. Để có thể phòng ngừa và điều trị vết

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thƣơng và các bệnh khác một cách có hiệu quả trƣớc hết đòi hỏi chất mang phải thẩm đƣợc qua lớp da, vì vậy nó phải có kích thƣớc nanô hoặc ít nhất là cỡ micro.

Một khi các men dạng tự do đƣợc giải phóng vào dịch vết thƣơng chúng bị mất hiệu lực rất nhanh, vì vậy việc điều trị đòi hỏi phải sử dụng lƣợng men lớn. Để giảm lƣợng men tiêu hao, các nhà khoa học đã chế tạo ra loại vật liệu phủ đƣợc cấy men có tác dụng điều trị kéo dài. Loại vật liệu phủ chứa men này có khả năng đề kháng cao trƣớc những biến đổi của các yếu tố môi trƣờng, nhƣng hoạt tính phân hủy protein của chúng vẫn thấp hơn đáng kể so với hoạt tính của các men dạng tự do.

Trong bản quyền sáng chế của Nga công bố năm 1979, các tác giả giới thiệu một vật liệu màng với chất mang là triacetat xenlulo chứa hoạt chất sinh học là enzyme phân hủy protein (trypsin hoặc -chimotrypsin), trong đó triacetat xenlulo chiếm từ 80 – 99% và còn lại là enzyme. Khi enzyme đƣợc giải phóng vào dịch vết thƣơng nó sẽ thể hiện các tính chất của enzyme nguyên khai với tất cả các nhƣợc điểm vốn có nhƣ không có khả năng đề kháng đối với các tác nhân ức chế, các biến đổi về pH và nhiệt độ môi trƣờng, và thể hiện tính kháng nguyên và tính gây sốt.

Các nhà khoa học Pháp đề xuất phƣơng pháp điều chế vật liệu có HTSH dƣới dạng hạt với chất mang nhƣ là dextran hoặc chitin, chitosan, đƣợc cấy enzyme nhƣ tripsin hoặc chymotripsin, với tỷ lệ nhƣ sau: chất mang từ 80 – 80,5% và còn lại là enzyme. Vật liệu đề xuất thể hiện hiệu ứng tác dụng kéo dài, nhƣng enzyme chứa trong đó không có khả năng tan vào dịch vết thƣơng và thể hiện tính kháng nguyên. Vật liệu này có nhƣợc điểm là có giá thành và hàm lƣợng enzyme cao (chiếm 20% trọng lƣợng vật liệu). Ngoài ra phải có

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

thiết bị đặc biệt để bảo quản trong một dung dịch đệm đặc biệt ở nhiệt độ thấp 20C.

Các nhà khoa học Anh Quốc giới thiệu một loại băng gạc phủ vết thƣơng bao gồm lớp bảo vệ (vải không dệt), lớp hấp thụ (bông hút nƣớc) và lớp tiếp giáp vết thƣơng (vải không dệt, màng polyuretan hoặc polyetilen hoặc triacetat xenlulo có chứa bột đồng) mà trên đó đƣợc phủ một lớp enzyme. Vật liệu phủ này khi tiếp xúc với dịch vết thƣơng, lớp enzyme bị vô hiệu hóa rất nhanh giống nhƣ enzyme nguyên khai. Vì vậy vật liệu này đã không tìm đƣợc ứng dụng rộng rãi.

Cũng theo patent của Anh Quốc, mức độ ôxy hóa xenlulo cao trong khi tỷ lệ cố định đảo nhỏ, do đó hầu nhƣ tất cả các số lƣợng tripsin đã đƣợc liên kết cộng hóa trị qua cầu nối azomethin HC=N. Năng lƣợng liên kết của cầu nối azomethin tƣơng đối lớn, dao động trong khoảng 393 – 583 kJ/mol, vì vậy các phân tử enzim (tripsin) đƣợc cố định tƣơng đối bền vững trên bề mặt phân tử xenlulo. Kết quả thực nghiệm thu đƣợc trên vật liệu phủ chế tạo theo patent Anh Quốc ở trên cho thấy hiệu quả điều trị của nó thấp hơn đáng kể so với men dạng tự do, bởi vì hầu hết tripsin đã liên kết cộng hóa trị với xenlulo, do đó không có liều “xung kích” để tác dụng với dịch vết thƣơng vào giai đoạn đầu của quá trình điều trị.

Theo một patent của Đức, quá trình chế tạo vật liệu phủ vết thƣơng với men cố định đƣợc thực hiện nhƣ sau:

- Trƣớc tiên vải sợi xenlulo đƣợc hoạt hóa bằng cách tạo ra các nhóm anđehyt trên các phân tử monosaccarit xenlulo cho tới khi nồng độ các nhóm này đạt giá trị 0,0625 – 3,125 mg-đƣơng lƣợng trên một gram vật mang.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Vật mang đã hoạt hóa sau đó đƣợc cho phản ứng với các men thích hợp trong dung dịch đệm có pH 6,5 - 7,5 tại nhiệt độ phòng trong vòng 8 -16 giờ; sau đó rửa và sấy khô.

Phƣơng pháp có nhƣợc điểm thƣờng hay gặp là hoạt tính men giảm nhiều so với men ở dạng tự do, chủ yếu là do quá trình tạo nhóm chức và cấy cố định men đã để diễn ra quá sâu.

Đƣợc biết, phân tử lớn của protein (thí dụ, tripsin có khối lƣợng phân tử 24kDa) có thể ức chế dẫn đến làm chậm quá trình tiếp cận giữa các nhóm chức của phân tử protein và phân tử xenlulo để tạo cầu nối azomethin. Do vậy, sự xâm nhập của một phân tử lớn nhƣ tripsin vào trong phân tử chất mang đã đƣợc ôxy hóa một phần cũng nhƣ sự cố định của men là một quá trình diễn ra chậm, thƣờng kéo dài từ 8 - 16 giờ. Điều đó cũng đòi hỏi phải có lƣợng dƣ lớn các nhóm andehyt so với các nhóm amin để tạo liên kết hóa học . Các nhƣợc điểm trình bày trên đã đƣợc các nhà khoa học Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt khắc phục nhờ đã cấy đƣợc phân tử men vào phân tử polyme của vật mang xenlulo có kích thƣớc vi mô. Các chất mang với kích thƣớc nanô hoặc micrô (10m) trên cơ sở xenlulo tự nhiên hiện tại chƣa

Mục lục