Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển việt nam

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60 42 30 HÀ NỘI – 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Hoài Châu HÀ NỘI – 2010 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hồi Châu – Viện trƣởng Viện Cơng nghệ Mơi trƣờng – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hƣớng dẫn, quan tâm tạo điều kiện tốt cho tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phịng Cơng nghệ thân Mơi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng đặc biệt PGS.TSKH Ngơ Quốc Bƣu tận tình giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Duy Nhứt – Trung tâm ứng dụng Khoa học & Công nghệ Nha Trang hƣớng dẫn tận tình truyền đạt kiến thức quý báu cho Tôi xin bày tỏ cảm ơn thầy cô cán sở Đào tạo sau Đại học - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học Công nghệ Việt nam Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Việt Nam Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate Tris.Base Tris (hydroxy methyl) amiomethane (HOCH3)CNH2 TEMED Trichloroacetic acid kb kilo base kDa kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction U Unit ADN Acid Deoxyribonucleic EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid TCA Trichloroacetic acid OD Optical density SDS-PAGE Sodium dodecylSulphate polyacrylamide gel Electrophorei SDS Sodium dodecyl sulphate DEP Diethoxylphosphoryl DFP Di-isopropylfluorophosphate 3,4-DCI 3,4-Dichloroisocoumarin PMSF Phenylmethysulfonyl fluoride TLCK Tosyl-L-lysine Chloromethyl Ketone PCMB P-Chloromercuribenzoate v/p vịng/phút v/v Volume/volume Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính protease từ mẫu Nhà máy chế biến hải sản Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính dịch chiết chạy qua màng lọc 50kDa Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính với casein sau ủ với casein Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính protease với mẫu mua ghẹ Bảng 3.5 Ảnh hưởng dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme Bảng 3.6 Kết thử hoạt tính protease tỉ lệ cồn 30%; 40% Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính protease tỉ lệ cồn 50% Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính protease tỉ lệ cồn 60%;70% 80% Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính protease tỉ lệ cồn 90% Bảng 3.10 Hoạt tính hiệu suất thu hồi tỉ tệ cồn khác Bảng 3.11 Kết thử hoạt tính tốc độ li tâm khác Bảng 3.12 Kết thử hoạt qua lọc màng (10kDa;50kDa) Bảng 3.13 Kết thử hoạt qua lọc màng (50kDa;100kDa) Bảng 3.14 Kết thử hoạt tính theo phân đoạn (NH4)2SO4 Bảng 3.15 So sánh phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Bảng 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme Bảng 3.17 Ảnh hưởng đồng thời nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme Bảng 3.18 Hàm lượng protease thu so sánh với mẫu Nga Bảng 3.19 Kết mẫu đem chạy điện di Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide Hình 1.2 Mơ hình enzyme protease thủy phân Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian enzyme protease Hình 1.4 Sơ đồ phân loại protease Hình 1.5 Sơ đồ chế xúc tác trung tâm hoạt động enzyme Hình 1.6 Cơ chế xúc tác cysteine protease Hình 1.7 Cơ chế hoạt động Aspartic protease Hình 1.8 Mơ hình phân tử enzyme protease Hình 1.9 Nội tạng cua biển Hình 1.10 Sự phân bố cua vua đỏ (vùng màu vàng) Hình 1.11 Lồi cua vua (king crab)Paralithodes camtschaticus Hình Đường chuẩn Tyrosine Hình 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ cồn tới enzyme protease Hình 3.2 Ảnh hưởng tốc độ máy lọc màng tới enzyme protease Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)2SO4 lên hoạt tính protease Hình 3.4 Ảnh hưởng độ pH lên hoạt tính enzyme protease Hình 3.5 So sánh phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ pH lên hoạt tính enzyme Hình 3.7 Điện di đồ sau tủa (NH4)2SO4 cồn 70% Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nƣớc…………………… 1.2 ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE…………………….5 1.3 PHÂN LOẠI 1.3.1 Exopeptidase…………………………………………………………8 1.3.2 Endopeptidase 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE 10 1.5 CƠ CHẾ XÚC TÁC PHẢN ỨNG 11 1.5.1 Serine protease…………………………………………………………… 12 1.5.2 Metallo protease……………………………………………………………12 1.5.3 Cysteine protease………………………………………………… ………13 1.5.4 Aspartic protease………………………………………………… …… 14 1.6 CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE 15 1.7 NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE 18 1.7.1 Enzyme protease từ động vật 18 1.7.2 Enzyme protease từ thực vật 18 1.7.3 Enzyme protease từ vi sinh vật 19 1.7.3.1 Vi khuẩn .19 1.7.3.2 Nấm …………………………………………………………………………20 1.7.3.3 Xạ khuẩn……………………………………………………………………21 1.7.3.4 Virus…………………………………………………………………………21 1.8 TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN 22 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.1 Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển……… …….……………….22 1.8.2 Ứng dụng y học……………………………….……………… 24 1.8.3 Giới thiệu loài cua nghiên cứu Nga………………………… 25 1.9 ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE 26 1.9.1 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm………………………………27 1.9.2 Trong chế biến thuỷ sản 27 1.9.3 Trong công nghiệp chế biến sữa 28 1.9.4.Trong công nghiệp sản xuất bia 28 1.9.5 Trong công nghiệp da 28 1.9.6 Trong công nghiệp dệt 29 1.9.7 Trong công nghiệp y – dƣợc 29 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31 2.1.1 Nguyên liệu 31 2.1.2 Hoá chất 31 2.1.3 Thiết bị 32 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.2.1 Xác định hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas theo phƣơng pháp Anson cải tiến, 1972 33 2.2.2 Xác định hàm lƣợng tổ hợp enzyme hepatopancreas phƣơng pháp Lowry cải tiến 35 2.2.3 Phƣơng pháp định tính hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas chất casein 36 2.2.4 Phƣơng pháp tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas 37 2.2.5 Phƣơng pháp tinh 37 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas dung dịch (NH4)2SO4………………………………………………………………………… 38 2.2.5.2 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas phương pháp lọc màng…………………………………………………………………………….… 39 2.2.5.3 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas cồn theo tỷ lệ khác nhau…………………………………………………………………………………40 2.2.6 Khảo sát ảnh hƣởng dung dịch đệm đến hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………….40 2.2.7 Khảo sát ảnh hƣởng tốc độ ly tâm đến khả tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas……………………………………………………41 2.2.8 Khảo sát ảnh hƣởng pH tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………………….41 2.2.9 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas ……………………………………………………………42 2.2.10 Điện di protein gel polyacrylamide xác định khối lƣợng tổ hợp enzyme…………………………………………………………………… 42 2.2.11 Phƣơng pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme ………………… 44 3.1 Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ nguồn thu nhận khác 45 3.2 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………….48 3.2.1 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas cồn theo tỷ lệ khác 48 3.2.2 Tinh tổ hợp enzyme hepatopancreas phương pháp lọc màng 52 3.2.3 Tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển dùng (NH4)2SO4 54 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mẫu : mẫu trƣớc tủa Mẫu : mẫu khơng pha lỗng tủa (NH4)2SO4 M : thang protein chuẩn Mẫu : mẫu pha loãng lần tủa (NH4)2SO4 Mẫu : mẫu khơng pha lỗng tủa cồn 70% Mẫu : mẫu pha loãng lần tủa cồn 70% Từ bảng điện di gel polyacrylamid cho thấy: Mẫu chế phẩm Việt Nam có protein khối lƣợng (lần lƣợt từ xuống dƣới): 60; 35; 28; 17 15 kDa (mũi tên hình 3.7) Những kết chạy điện di tren gel polyacrylamid phù hợp so với công trình nghiên cứu đƣợc cơng bố nƣớc ngồi: theo tác giả Cunningham cộng [17], tổ hợp enzyme phân giải protein có khối lƣợng phân tử nhỏ 30kDa; cịn Balov AA cơng [10], tổ hợp emzyme chứa colagenase gồm thành phần có khối lƣợng phân tử từ 1827kDa Nhƣ vậy, việc xử lý dịch protein tổng số bƣớc đầu cồn (NH4)2SO4 loại bớt đƣợc số protein tạp giúp cho việc tinh protease sau dễ dàng 3.9 Quy trình nghiên cứu Với kết nghiên cứu, chúng tơi xây dựng đƣợng qui trình nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas nhƣ sau: Nội tạng cua biển đƣợc thu nhận bảo quản nhiệt độ -5 đến 60C Tiếp theo, nội tạng cua biển đƣợc cắt nhỏ nghiền với dung dịch đệm đệm Tris.Base theo tỷ lệ thích hợp, hỗn hợp đƣợc ngâm chiết giờ, loại bã cách ly tâm dịch nghiền Dịch nghiền đƣợc điều chỉnh pH keo tụ lipit chitosan 0.001% Dịch chiết đƣợc làm cách ly tâm Tiếp 64 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn theo, kết tủa phân đoạn enzyme cồn 70% ammonium sulfate 60% cho dịch chiết qua màng siêu lọc 50kDa để tinh enzyme Cuối cùng, enzyme đƣợc sấy đông khô bảo quản nhiệt độ thấp (40C) 65 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu nêu trên, đƣa kết luận nhƣ sau: Sử dụng dung dịch đệm Tris.Base thích hợp so với dung dịch đệm phosphate thí nghiệm tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển Việt nam Tổ hợp enzyme phân giải protein đƣợc tách chiết sử dụng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 60% kết hợp sử dụng phƣơng pháp lọc màng để tinh tổ hợp enzyme cho khả thu hồi enzyme tốt Kết chạy điện di ho thấy tổ hợp enzyme hepatopancreas thu đƣợc từ gan tụy cua biển Việt Nam có khối lƣợng phân tử khoảng (15-60kDa) Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nga Tổ hợp enzyme thu đƣợc có hoạt tính cao 65°C Trong khoảng khảo sát pH 5-8 enzyme hoạt động tốt; khoảng pH cho hoạt tính cao Qua thí nghiệm khảo sát điều kiện ảnh hƣởng tới tổ hợp enzyme từ gan tụy cua biển Việt Nam đƣa đƣợc qui trình tách chiết 66 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KIẾN NGHỊ Trên sở kết nghiên cứu đạt đƣợc khóa luận này, tác giả có số kiến nghị nhƣ sau: Đề tài nghiên cứu khảo sát bƣớc đầu qui trình tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam, cần có nghiên cứu để tinh tổ hợp enzyme thu đƣợc hoạt tính cao, tƣơng đƣơng với hoạt tính có chế phẩm enzyme Nga (41.717 U/mg) Nghiên cứu điều kiện ảnh hƣởng tới hoạt tính tổ hợp enzyme thu nhận đƣợc để cấy lên nano xenllulo ứng dụng việc chế tạo băng gạc điều trị vết thƣơng-hoạt tử bị bỏng Việt Nam 67 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đơng Thị Thanh Thu (2000), “Nghiên cứu hoạt tính đông tụ sữa số protease vi sinh vật “ Kỷ yếu hội thảo khoa học Công nghệ thực phẩm bảo vệ môi trường, Bộ Giáo dục Đào tạo, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Trần Đình Toại, Đỗ Ngọc Lanh, Nguyễn Việt Thiết, Nguyễn Thu Hoài (1994), “Nghiên cứu khả phân hủy số loại protein papain”, Tạp chí Hóa học, 32, tr 6-33 Phạm Trân Châu Công nghệ enzyme ứng dụng protese công nghệ chế biến, Tạp chí Thủy sản, 1, pp 18-20 (1993) Lê Đức Ngọc, Trịnh Thế Hùng, Võ Sỹ Hùng (1996), “Nghiên cứu protease bí đao, khảo sát nguồn protease bí đao Việt Nam”, Tạp chí hóa học, 34, tr 7-63 Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti) Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, T 9, S 11 (2006) Nguyễn Minh Trí, Ngơ Thị Hồi Dƣơng,Phạm Thị Mai, Đỗ Thị Ánh Hoà Thu nhận enzyme protease từ canh cấy vi khuẩn P aeruginosa CB07- Xác định số tính chất enzyme protease thu Khoa Chế biến, Trƣờng Đại học Nha Trang pp 53-67 (2008) Nguyễn Trọng Cẩn – Đỗ Minh Phụng, Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản- Tập : Ướp muối, chế biến nước mắm, chế biến khơ, thức ăn chín, NXB Nơng nghiệp, 1990 68 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lƣu Duẩn, Lê Doãn Diên (2002), Hóa Sinh cơng nghiệp NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 428-432 TÀI LIỆU TIẾNG ANH A.B.Maksimenko Modified enzymes for medical purposes with improved action.Thesis Dr Science Moscow, 1989, sec 274 10 Belov AA, Belov, LA, Filatov VN, et al Interaction of protease inhibitors of blood plasma from immobilized on dialdegidtsellyuloze proteolytic complex from hepatopancreas of the crab Herald M Univ, Ser Chemistry, 44, 1, 2003 11 Dew, C.B 1990 Behavioural ecology of podding red king crab, Paralithodes camtschatica Can J Fish Aquat Sci., 47(10): 19441958.Ser Chemistry, 44, 1, 2003 12 Barrett, A.J (1994), “Proteolytic enzymes: serine and cysteine peptidase” Methods Enzymeol, 244, pp 1-15 13 Bright, D.1967 Life histories of the king crab, Paralithodes camtschatica, and the Tanner crab, Chionoecetesbairdi, in Cook Inlet, Alaska Ph.D Thesis, University of Southern California, Los Angels, California, 265 pp 14 Boyer P.D (1971), The enzyme, 3rd ed Academic Press, Inc, NewYork, NY; = Hoffman, T (1974) Food related enzymes Adv Chem Ser 136:146–185 15 C Fermi and H Pernossi, Z Hyg 18 (1894), p 83 16 Fukuhara, F.M 1985 Biology and fishery of south-eastern Bering Sea red king crab (Paralithodes camtschatica, Tilesius) Pp 801-982, In: NOAA Processed Rep., 85-11 69 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 Cunningham, C W., Blackstone, N W & Buss, L W 1992 Evolution of king crabs from hermit crab ancestors Nature 355, 539–542 18 Cunningham, D.T 1969 A study of the food and feding relationships of the Alaskan king crab Paralithodes camtschatica Master thesis State College, California, San Diego 84 pp 19 Sielecki A.R., Fujinaga M., Read R.J., James M.N.G "Refined structure of porcine pepsinogen at 1.8-A resolution." J Mol Biol 219:671692(1991) 20 Smirnov EB, Mukhin VA, Novikov VY, "The effect of temperature on the activity of digestive proteases of marine invertebrates, Bulletin of Moscow State Technical University, Volume 9, N5, 2006 21 T Godfrey & S West Industrial Enzymemology (1996) Microbiology and molecular biology reviews,62 (3):597-635 22 International Union of Biochemistry and Molecular Biology (1992), enzyme nomeclature, Academic Press Inc., Corlando 23 Rawlings, N.D & Barrett, A.J (1994) Families of serine peptidases Methods Enzymeol, 244 19-61 24 Rao,M.B., Tanksale, A P., Ghatge, M.S., Deshpande,V.V.1998 Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases, pp 246253 25 Novikov V.Yu Effect of temperature on the activity of digestive proteases of marine invertebrates Vestnik MSTU, Volume 9, N5, 2006 26 Priest, FG (1997), Extracell enzyme synthesis in the genus Bacillus”, Bacteriol Res, 41, pp 711-753 27 Holmes, M A & Matthews, B W (1981) Binding of hydroxamic acid inhibitors to crystalline thermolysin suggests a pentacoordinate zinc intermediate in catalysis, Biochemistry 20, 6912–6920 70 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 Hocman G.: Chemoprevention of cancer: protease inhibitors Int.J Biochem 1365-1375 1992 29 Zaklan, S D & Cunningham, C W 2002 Molecular phylogeny, circumstances and consequences of the transition from hermit crabs to king crabs Proc R Soc Lond B (Submitted.) 30 Kuzmin S & Sundet, J.H 2000 Joint report for 2000 on the red king crab (Paralithodes camtschaticus) investigations in the Barents Sea Basic requirements for managements of the stock Report to the 29th Session for the Mixed Russian-Norwegian Fisheries Commission, 24 pp 31 Kenedy A.R.: Prevention of carcinogenesis by protease inhibitors Cancer research 54, 1999-2005 1994 32 Kennedy AR Overview: anticarcinogenic activity of protease inhibitors In: Troll W, Kennedy AR, eds Protease inhibitors as can-cer chemopreventive agents New York: Plenum Press, 1993:9–64 33 Laemmli U K Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4 Nature 227, 680-685, 1970 34 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randall R J., 1951, “Protein measurement with the Folin phenol reagent”, J Biol Chem 193, 265-275 35 T Godfrey & S West Industrial Enzymemology (1996) 36 Kulichkova, V.A 1955 The feding pattern of the Kamchatka crabs off the coasts off Kamchatka and Sakhalin Izvestiya Tikhookeanskogo Nauchno-Issledovatel'skovo Istituta Rybnogo Khoziaistva i Okeanografii [TINRO], 43: 21-42 [In Russian] 37 Jorgensen LL., Manushin I, Sundet JH and SR Birkely (2005) The introduction of the marine red king crab Paralithodes camtschaticus into the southern Barents Sea ICES Cooperative Research Report No 277 71 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU TRANG WEB 38 http://tailieu.vn (Enzyme protease) 39 http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sub… 40 http://www.enzymessentials.com/HTML/pro… 41 http://www.pacseafood.com/products/king_crab.html 42 http://www.nobanis.org/ 43 http://www.merops.ac.uk 72 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NANO XELLULO TRONG Y HỌC - BĂNG GẠC CỐ ĐỊNH ENZYME ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG KHĨ LÀNH Cơng nghệ nanơ y học phần quan trọng lĩnh vực cơng nghệ nanơ nay, tác động vật liệu mới, phƣơng pháp lên thể sống, xâm nhập vật liệu nanô vào bên thể sống tƣơng tác chúng với Trong y học cơng nghệ nanơ có hai hƣớng chủ yếu – chẩn đoán điều trị Trong lĩnh vực điều trị nhà khoa học hy vọng ứng dụng đáng kể y học nanô đƣợc nhanh chóng khẳng định q trình giải vấn đề dẫn thuốc đến tế bào mục tiêu Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt (VNCVLD) Moskva chế tạo thành cơng băng gạc phủ vết thƣơng có khả làm vết thƣơng mà không cần đến trợ giúp phẫu thuật, nghĩa có khả làm tan protein hoại thƣ để chúng thấm vào lớp vải phủ Viện chế tạo 12 chế phẩm băng gạc phủ vết thƣơng đƣợc Bộ Y tế LB Nga cho phép đƣa vào áp dụng lâm sàng Chế phẩm sở số gạc Multiferm đƣợc cấu tạo từ vật mang xenlulo đƣợc liên kết hóa học với men phân hủy protein protease Các hãng sản xuất vật liệu phủ vết thƣơng sợi xenlulo hàng đầu giới Abbott, B Brown, C.R Bard, Bayersdorf, Conva-Tech, Johnson & Johnson, Kendall-Gelener (Taiko), Minesota Mining & Menufanchuril (3M), Smith Beachem Clip, Smith & Nephew, Sherwood Medical Các vật mang sở xenlulo vật liệu phù hợp để tiếp xúc với bề mặt da, nhiên kích thƣớc lớn mức độ liên kết men - vật mang không phù hợp, nên việc ứng dụng bị hạn chế Để phịng ngừa điều trị vết 73 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thƣơng bệnh khác cách có hiệu trƣớc hết đòi hỏi chất mang phải thẩm đƣợc qua lớp da, phải có kích thƣớc nanơ cỡ micro Một men dạng tự đƣợc giải phóng vào dịch vết thƣơng chúng bị hiệu lực nhanh, việc điều trị đòi hỏi phải sử dụng lƣợng men lớn Để giảm lƣợng men tiêu hao, nhà khoa học chế tạo loại vật liệu phủ đƣợc cấy men có tác dụng điều trị kéo dài Loại vật liệu phủ chứa men có khả đề kháng cao trƣớc biến đổi yếu tố mơi trƣờng, nhƣng hoạt tính phân hủy protein chúng thấp đáng kể so với hoạt tính men dạng tự Trong quyền sáng chế Nga công bố năm 1979, tác giả giới thiệu vật liệu màng với chất mang triacetat xenlulo chứa hoạt chất sinh học enzyme phân hủy protein (trypsin -chimotrypsin), triacetat xenlulo chiếm từ 80 – 99% lại enzyme Khi enzyme đƣợc giải phóng vào dịch vết thƣơng thể tính chất enzyme nguyên khai với tất nhƣợc điểm vốn có nhƣ khơng có khả đề kháng tác nhân ức chế, biến đổi pH nhiệt độ môi trƣờng, thể tính kháng nguyên tính gây sốt Các nhà khoa học Pháp đề xuất phƣơng pháp điều chế vật liệu có HTSH dƣới dạng hạt với chất mang nhƣ dextran chitin, chitosan, đƣợc cấy enzyme nhƣ tripsin chymotripsin, với tỷ lệ nhƣ sau: chất mang từ 80 – 80,5% lại enzyme Vật liệu đề xuất thể hiệu ứng tác dụng kéo dài, nhƣng enzyme chứa khơng có khả tan vào dịch vết thƣơng thể tính kháng nguyên Vật liệu có nhƣợc điểm có giá thành hàm lƣợng enzyme cao (chiếm 20% trọng lƣợng vật liệu) Ngồi phải có 74 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thiết bị đặc biệt để bảo quản dung dịch đệm đặc biệt nhiệt độ thấp 20C Các nhà khoa học Anh Quốc giới thiệu loại băng gạc phủ vết thƣơng bao gồm lớp bảo vệ (vải không dệt), lớp hấp thụ (bông hút nƣớc) lớp tiếp giáp vết thƣơng (vải không dệt, màng polyuretan polyetilen triacetat xenlulo có chứa bột đồng) mà đƣợc phủ lớp enzyme Vật liệu phủ tiếp xúc với dịch vết thƣơng, lớp enzyme bị vơ hiệu hóa nhanh giống nhƣ enzyme ngun khai Vì vật liệu khơng tìm đƣợc ứng dụng rộng rãi Cũng theo patent Anh Quốc, mức độ ơxy hóa xenlulo cao tỷ lệ cố định đảo nhỏ, hầu nhƣ tất số lƣợng tripsin đƣợc liên kết cộng hóa trị qua cầu nối azomethin HC=N Năng lƣợng liên kết cầu nối azomethin tƣơng đối lớn, dao động khoảng 393 – 583 kJ/mol, phân tử enzim (tripsin) đƣợc cố định tƣơng đối bền vững bề mặt phân tử xenlulo Kết thực nghiệm thu đƣợc vật liệu phủ chế tạo theo patent Anh Quốc cho thấy hiệu điều trị thấp đáng kể so với men dạng tự do, hầu hết tripsin liên kết cộng hóa trị với xenlulo, khơng có liều “xung kích” để tác dụng với dịch vết thƣơng vào giai đoạn đầu trình điều trị Theo patent Đức, trình chế tạo vật liệu phủ vết thƣơng với men cố định đƣợc thực nhƣ sau: - Trƣớc tiên vải sợi xenlulo đƣợc hoạt hóa cách tạo nhóm anđehyt phân tử monosaccarit xenlulo nồng độ nhóm đạt giá trị 0,0625 – 3,125 mg-đƣơng lƣợng gram vật mang 75 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Vật mang hoạt hóa sau đƣợc cho phản ứng với men thích hợp dung dịch đệm có pH 6,5 - 7,5 nhiệt độ phòng vòng -16 giờ; sau rửa sấy khơ Phƣơng pháp có nhƣợc điểm thƣờng hay gặp hoạt tính men giảm nhiều so với men dạng tự do, chủ yếu q trình tạo nhóm chức cấy cố định men để diễn sâu Đƣợc biết, phân tử lớn protein (thí dụ, tripsin có khối lƣợng phân tử 24kDa) ức chế dẫn đến làm chậm q trình tiếp cận nhóm chức phân tử protein phân tử xenlulo để tạo cầu nối azomethin Do vậy, xâm nhập phân tử lớn nhƣ tripsin vào phân tử chất mang đƣợc ơxy hóa phần nhƣ cố định men trình diễn chậm, thƣờng kéo dài từ - 16 Điều địi hỏi phải có lƣợng dƣ lớn nhóm andehyt so với nhóm amin để tạo liên kết hóa học Các nhƣợc điểm trình bày đƣợc nhà khoa học Nga thuộc Viện Nghiên cứu vật liệu dệt khắc phục nhờ cấy đƣợc phân tử men vào phân tử polyme vật mang xenlulo có kích thƣớc vi mơ Các chất mang với kích thƣớc nanơ micrơ (10m) sở xenlulo tự nhiên chƣa đƣợc biết đến giới Tuy nhiên, thực tiễn lâm sàng nƣớc Nga từ vài thập kỷ trƣớc xuất chế phẩm thuốc chữa bệnh tiếng có tên Multiferm với số chế phẩm khác, tạo hệ vật liệu phủ vết thƣơng sở xenlulo tự nhiên mà phân tử lớn đƣợc cấy phân tử thuốc Một điểm đáng ý Multiferm phân hủy protein bị biến chất (denaturalized) Các mơ lành khơng bị tripsin tác động, tế bào sống trƣờng hợp cần thiết xuất chất ức chế đặc 76 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn biệt (gọi chất ức chế proteinase đa hóa trị) có khả vơ hiệu hóa hồn tồn tâm hoạt động tác nhân phân hủy protein Kết thử nghiệm ứng dụng lâm sàng cho thấy hệ điều trị có khả tiết vào vết thƣơng hạt nanô chứa chất HTSH rút ngắn thời gian làm lành vết thƣơng - lần giảm chi phí thuốc xuống hai bậc, đồng nghĩa với việc giảm đáng kể tải lƣợng thuốc bệnh nhân Công nghệ nanô xenlulo cho phép tạo chế phẩm thuốc dƣới nhiều dạng khác nhƣ kem bôi, bọt, gel, dạng dung dịch phun, mà xenlulo tự nhiên làm đƣợc Số TT Các mẫu băng gạc sử dụng Số lƣợng Làm vết bệnh nhân thƣơng (ngày) Làm lành vết thƣơng (ngày) Vết thƣơng không điều trị (đối chứng) 20 14,2±0,35 27,3±0,15 Băng gạc DAC không chứa men 20 13,3±0,6 24,2±0,5 Băng gạc DAC-Tripsin 20 4,8±0,4 16,2±0,3 Băng gạc DAC-ChitozanHepatopancreas 20 3,0±0,2 12,1±0,1 Dƣới vài hình ảnh thí nghiệm điều trị vết thƣơng mƣng mủ hoại tử sử dụng băng gạc nói thực Viện Quân y 108 (TS-BS Nguyễn Quốc Gia cung cấp) Kết cho thấy sau đắp gạc Multiferm vết thƣơng phục hồi nhanh, mủ hoại tử đƣợc loại bỏ, sau ngày bệnh nhân đƣợc vá da 77 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Gãy hở độ III A 1/3 xƣơng đùi trái tai nạn giao thông Vào viện ngày 23-62008 Ngày 17-7-2008: Đắp gạc tẩm Betadin Ngày 18-7-2008: Đắp gạc Multiferm Ngày 23-7-2008: Đắp gạc Multiferm sau bệnh nhân đƣợc da tự thân 78 Số hóa Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... nhóm nghiên cứu lựa chọn đề xuất đề tài: ? ?Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam? ?? nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein. .. Khảo sát trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam - Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình tách chiết đánh giá hoạt tính tổ hợp enzyme thu... http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8 TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN 1.8.1 Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển Gan tụy loài cua biển tổ chức kết hợp chức gan túi mật, phận thƣờng