Nghiên cứu tách chiết các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất bột vẹm xanh perna viridis đông khô

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGÔ VŨ QUỲNH ANH NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CÁC HOẠT CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA SẢN XUẤT BỘT VẸM XANH PERNA VIRIDIS ĐÔNG KHÔ Chuyên ngành CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã chuyên ngành 8540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Ngọc Tuấn TS Trần Thị Huyền Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm ảo vệ uận văn thạc sĩ.

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGƠ VŨ QUỲNH ANH NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CÁC HOẠT CHẤT CĨ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA SẢN XUẤT BỘT VẸM XANH PERNA VIRIDIS ĐÔNG KHÔ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã chuyên ngành: 8540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 Cơng trình đƣợc hồn thành Trƣờng Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Ngọc Tuấn TS Trần Thị Huyền Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Hội đồng chấm ảo vệ uận văn thạc sĩ Trƣờng Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 19 tháng 03 năm 2022 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS.TS Đống Thị Anh Đào - Chủ tịch Hội đồng PGS.TS Hoàng Kim Anh - Phản biện GS.TS Trần Đình Thắng - Phản biện TS Nguyễn Đức Vƣợng - Ủy viên TS ê Hƣơng Thủy - Thƣ ký CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN TRƢỞNG VIỆN CNSH&TP BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Ngô Vũ Quỳnh Anh MSHV: 18105151 Ngày, tháng, năm sinh:16/05/1982 Nơi sinh: Khánh Hòa Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: 8540101 I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất ột vẹm xanh Perna viridis đông khô NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định thông số tối ƣu thời gian, pH, lƣợng chất để tối ƣu hóa thủy phân ột vẹm ằng enzyme protease đạt hiệu suất cao - Sử dụng phần mềm PRISM để xác định hoạt tính xúc tác enzyme protease dung dịch protein vẹm II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 12/01/2021 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/01/2022 IV NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Ngọc Tuấn TS Trần Thị Huyền Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 20 … NGƢỜI HƢỚNG DẪN NGƢỜI HƢỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) VIỆN TRƢỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian từ bắt đầu học tập trƣờng đến nay, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ quý Thầy Cô bạn bè Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, ln hỗ trợ nhiệt tình cho chúng em suốt trình học tập nghiên cứu luận văn Nay em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện sở vật chất - kỹ thuật tốt cho chúng em suốt trình học tập rèn luyện trƣờng Đồng thời thuận lợi làm luận văn tốt nghiệp suốt q trình vừa qua Bộ mơn Cơng nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, q thầy cơ, tập thể cán quản lý phịng thí nghiệm mơn tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện cho em tiếp xúc với trang thiết bị thí nghiệm đại Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuấn cô Trần Thị Huyền hƣớng dẫn sát cánh, tận tình bảo truyền đạt hết kinh nghiệm quý báu giúp em thực đề tài từ ƣớc ản kết cuối luận văn Ngoài ra, thầy cịn ngƣời giúp em có thái độ nghiên cứu, làm việc khoa học, nghiêm túc hiệu Trong trình thực đề tài thời gian có giới hạn, thiếu kinh nghiệm thực tế nên khơng tránh khỏi sai sót Em mong đóng góp ý kiến q thầy để luận văn hoàn thiện tốt Em xin chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Quy trình thủy phân Vẹm xanh sử dụng phƣơng pháp thủy phân tác nhân sinh học enzyme protease Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi công nghệ thực phẩm sử dụng hóa chất, hạn chế đƣợc biến đổi acid amin, tạo sản phẩm an tồn có giá trị dinh dƣỡng cao Nghiên cứu xác định đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng thủy phân thịt vẹm xanh enzyme protease điều kiện pH = 7.0, nhiệt độ 25oC, 10 giờ, tỉ lệ dịch thủy phân với enzyme 1:1, ly tâm 13000 rpm/phút 15 phút Sử dụng phƣơng pháp phân tích đại: sắc kí khí GC-MS, phân tích sắc kí lỏng hiệu cao HP C, chiết Soxhlet,… để xác định thành phần acid amin, béo, vitamin, khống, có thịt vẹm xanh nguyên liệu Nghiên cứu tiến hành với phƣơng pháp khác nhƣ sấy phun đông khơ Từ xác định đƣợc khả kháng oxy hóa dịch thủy phân bột vẹm xanh, sản phẩm sau sấy phun sau đông khô ằng phƣơng pháp phân tích nhƣ ABTS, DPPH Kết nghiên cứu xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng thịt vẹm xanh đƣợc nuôi Phú Yên - Việt Nam; khảo sát đƣợc khả chống oxy hoá dịch vẹm với vitamin C nhƣ so sánh khả chống oxy hố phƣơng pháp phân tích DPPH ABTS dịch vẹm sau sấy khô đông khô Từ kết nghiên cứu xác định đƣợc khả kháng oxy hóa dịch thủy phân vẹm, sản phẩm sau sấy phun sau đông khô ii ABSTRACT The hydrolysis process of green mussels uses the method of hydrolysis by biological agents with protease enzymes This method is widely used in food technology because of the low use of chemicals, limited changes in amino acids, produce safe products with high nutritional value The study has determined the optimal conditions for the hydrolysis of green mussel meat by protease enzyme at the conditions of pH = 7.0, temperature of 250C, for 10 hours, the ratio of hydrolysate to enzyme is 1:1, centrifuge at 13000 rpm/min for 15 Using modern analytical methods, gas chromatography (GC-MS), high performance liquid chromatography (HPLC), Soxhlet extraction, etc., to determine the components of amino acids, fats, vitamins, minerals, etc raw mussel meat The study was conducted with different methods such as spray drying and freeze drying From there, determine the antioxidant capacity of hydrolyzed green mussel powder, spray-dried and freeze-dried products by analytical methods such as ABTS, DPPH Research results have determined the nutritional composition of green mussel meat raised in Phu Yen - Vietnam; investigated the antioxidant capacity of mussel solution with vitamin C as well as compared the antioxidant capacity of DPPH and ABTS analytical methods for mussel solution after drying and lyophilization From the research results, the antioxidant capacity of mussel hydrolysates, spray-dried and freeze-dried products have been determined iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo tốt nghiệp đề tài “Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất ột vẹm xanh Perna viridis đông khô” cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Ngọc Tuấn TS Trần Thị Huyền Những phần có sử dụng tài liệu tham khảo có áo cáo đƣợc liệt kê nêu rõ phần tài liệu tham khảo Đồng thời số liệu hay kết trình bày luận văn mang tính chất trung thực, khơng chép, đạo nhái Nếu nhƣ có sai phạm chúng tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm chịu tất kỷ luật môn nhƣ nhà trƣờng đề Học viên Ngô Vũ Quỳnh Anh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH ẢNH ix DANH MỤC BẢNG BIẾU x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu đề tài 2.1 Mục tiêu chung 2.2 Mục tiêu cụ thể .2 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƢƠNG 1.1 TỔNG QUAN Tổng quan vẹm xanh .4 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 1.1.3 Sinh sản 1.1.4 Giá trị dinh dƣỡng 1.1.5 Một số cơng dụng vẹm xanh 1.1.6 Tình hình nuôi nhuyễn thể 1.2 Tổng quan enzyme 10 v 1.2.1 Định nghĩa enzyme 10 1.2.2 Đặc tính chung enzyme 11 1.2.3 Tính đặc hiệu enzyme [37] .11 1.2.4 Cơ chế xúc tác enzyme[38] 12 1.2.5 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme[39] 13 1.2.6 Enzym protease .14 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Nguyên liệu 20 2.2 Hóa chất .20 2.3 Thiết bị dụng cụ 20 2.3.1 Thiết bị 20 2.3.2 Dụng cụ 20 2.4 2.4.1 Phƣơng pháp phân tích 20 Phƣơng pháp xác định hàm ẩm 20 2.4.2 Xác định hàm lƣợng kim loại, khoáng phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 20 2.4.3 Xác định hàm lƣợng iod phƣơng pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS) 22 2.4.4 Xác định hàm lƣợng canxi, photpho phƣơng pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS) .23 2.4.5 Xác định hàm lƣợng vitamin B1 phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HP C) .24 2.4.6 Xác định hàm lƣợng vitamin B12 phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HP C) .25 2.4.7 Xác định hàm lƣợng vitamin A phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HP C) .26 2.4.8 MS) Xác định hàm lƣợng acid béo phƣơng pháp sắc ký khí (GC .27 vi 2.4.9 Xác định hàm lƣợng acid amin phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .30 2.4.10 Xác định hàm lƣợng protein phƣơng pháp Kjeldahl 30 2.4.11 liệu Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme thích hợp so với nguyên 32 2.4.12 Phƣơng pháp thủy phân protein enzyme 32 2.4.13 Phƣơng pháp xử lý số liệu 33 2.4.14 Phƣơng pháp gốc tự DPPH 33 2.4.15 Phƣơng pháp gốc tự ABTS 33 2.4.16 Phƣơng pháp thiết bị sấy phun [46] 34 2.4.17 Phƣơng pháp thiết bị đông khô [48] .35 CHƢƠNG 3.1 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 Xác định thành phần nguyên liệu 36 3.1.1 Hàm lƣợng protein vẹm xanh .36 3.1.2 Hàm lƣợng acid béo vẹm xanh .38 3.1.3 Yên Thành phần khoáng chất, vitamin kim loại vẹm xanh Phú .39 3.2 Kết xác định thông số kỹ thuật 41 3.3 Quy trình cơng nghệ thủy phân vẹm xanh enzym protease 41 3.3.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ 43 3.3.2 Thuyết minh quy trình 43 3.3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm 45 3.3.4 Đánh giá khả chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh 45 3.4 Đông khô sấy phun dịch thủy phân bột vẹm xanh enzym protease thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa chúng phƣơng pháp DPPH ABTS 53 vii CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vẹm xanh 1.1.1 Khái quát chung Họ Vẹm (Mytilidae) họ lớn lớp hai mảnh vỏ Bivalvia với khoảng 75 lồi, có lồi ni Ở Việt Nam có khoảng 10 lồi, giá trị kinh tế cao vẹm xanh (Perna viridis) Vỏ vẹm có hình muỗm (hoặc xồi, phần đỉnh nhọn, phần sau tròn) Phần lớn vỏ nhƣng hai cạnh khơng Vịng sinh trƣởng mặt vỏ nhỏ, dày, rõ Mặt vỏ thƣờng màu xanh đen, mặt màu trắng bạc, nhẵn bóng, phía ngồi mép có màu xanh nhạt [44] Tên tiếng anh: Green Mussel Ngành: Mollusca Bộ: Mytiloida Loài: Perna viridis Vẹm vỏ xanh động vật sống vùng biển ấm, nhiệt đới cận nhiệt đới Trên giới chúng phân bố vùng biển Srilanca, Quảng Đông - Trung Quốc, Indonesia, Malysia, Thái Lan, Ấn Độ Ở Việt Nam, vẹm vỏ xanh phân bố vùng triều tỉnh, Hải Phịng, Hà Tĩnh, Quảng Bình, TT Huế, Bình Định, Phú n, Khánh Hồ, Bình Thuận, Phú Quốc Kiên Giang Trong số 52 loài động vật hai mảnh vỏ, xác định đƣợc 26 lồi có giá trị kinh tế Trong nhiều lồi hình thành đƣợc sản lƣợng khai thác, đối tƣợng ni thả có giá trị kinh tế cao nhƣ sị huyết, sị lơng, vẹm xanh, nghêu, ngao [38] Vẹm vỏ xanh phân bố từ tuyến hạ triều đến nơi có độ sâu 10 m nƣớc Vẹm sống vùng nƣớc có độ mặn dao động từ 20 - 30 ppt, chất đáy đá, sỏi, san hô Vẹm tiết tơ chân để bám chặt vào vật cứng dƣới đáy Sự sinh trƣởng cá thể loài khác nhau, nuôi nơi, thời gian sau năm có lớn - cm, có lớn - cm 1.1.4 Giá trị dinh dưỡng Vẹm xanh đƣợc xem loài hải sản bổ dƣỡng giàu dinh dƣỡng, đặc biệt sắt, protein, vitamin, khống chất omega 3, bên cạnh vẹm lại cịn chứa chất béo, calories cholesterol, giúp hạn chế nguy ệnh tim mạch, mỡ máu tăng cƣờng hoạt động não bộ, giúp chống lại bệnh azheimer làm chậm q trình trí nhớ ngƣời cao tuổi, đặc biệt giúp ngăn ngừa hỗ trợ điều trị bệnh xƣơng khớp nhƣ ệnh viêm xƣơng khớp, thấp khớp, lỗng xƣơng, thối hóa khớp [44] Nếu nhƣ protein, car ohydrate nhóm dƣỡng chất giúp trì sống acid amin, khống chất, omega 3, glycosaminoglycan, vitamin có đầy đủ vẹm xanh giúp đảm bảo khỏe mạnh, dẻo dai, linh hoạt thể Vẹm xanh đặc biệt đƣợc ứng dụng phổ biến điều trị bệnh lý xƣơng khớp, nhƣ viêm khớp, thối hóa khớp, viêm khớp dạng thấp…Sự phong phú thành phần glycosaminoglycan (bao gồm acid hyaluronic, keratin sulfate hợp chất chondroitin sulfate chất ản tham gia cấu tạo khớp, sụn khớp), với thành phần omega giàu có vẹm xanh có tác dụng giảm đau chống viêm tự nhiên tốt cho tim mạch, làm giảm khả mắc bệnh liên quan đến thần kinh, hạn chế thối hóa giúp mang lại lợi ích to lớn toàn diện cho vấn đề thuộc bệnh lý xƣơng khớp [45] 1.1.5 Một số cơng dụng vẹm xanh 1.1.5.1 Cải thiện lưu thông máu Vẹm xanh nguồn thực phẩm giàu omega 3, nguồn acid béo không no tốt cho sức khỏe tim mạch Các thành phần có hoạt tính tăng cƣờng sức bền động mạch, tăng cƣờng lƣu lƣợng máu, ngăn ngừa đau tim xơ vữa động mạch, nhờ ngăn ngừa đột quỵ cục máu đông động mạch bị tắc nghẽn [49] 1.1.5.2 Tốt cho não Vẹm xanh nguồn giàu acid éo omega (trong có DHA, EPA…), có lợi cho não DHA vitamin B12, hai chất dinh dƣỡng quan trọng giúp bảo vệ sức khỏe não bảo vệ trí nhớ, tăng cƣờng tập trung Nghiên cứu DHA, chất đƣợc vận chuyển vào não, làm giảm đáng kể tỷ lệ co rút não theo tuổi tác [49] Một số nghiên cứu cho thấy chất bổ sung omega làm giảm triệu chứng tăng động, giảm ý Omega quan trọng phát triển chức não bộ, cung cấp số lợi ích bổ sung cho phƣơng pháp điều trị truyền thống Một số chứng khác cho thấy omega giúp bảo vệ chống sa sút trí nhớ suy giảm tinh thần liên quan đến tuổi tác Những ngƣời lớn tuổi có chế độ ăn nhiều acid béo omega có khả ị bệnh alzheimer [44] 1.1.5.3 Tăng khả sinh sản Vẹm xanh đƣợc biết đến thực phẩm giàu kẽm, có lợi cho sức khỏe sinh sản nam giới Các nghiên cứu rằng, thịt vẹm giúp tăng chất lƣợng tinh dịch nam giới tăng tăng khả thụ thai cho phụ nữ [44] 1.1.5.4 Tăng cường khả miễn dịch Bên cạnh đó, vẹm xanh có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, tăng cƣờng hệ miễn dịch Trong vẹm có chứa chất kháng khuẩn tự nhiên, vẹm xanh có tác dụng chống viêm ngăn ngừa nhiễm trùng, kích thích hình thành kháng thể ngƣời thƣờng xun sử dụng tránh đƣợc bệnh nhiễm trùng Trong vẹm xanh có chứa omega giúp kích thích sản xuất prostaglandin làm cho hệ miễn dịch khỏe mạnh giúp thể đối phó với tình trạng nhiễm trùng [44] 1.1.5.5 Tốt cho da Vẹm xanh không tốt cho tim mạch, xƣơng khớp… dƣỡng chất có vẹm xanh nhƣ omega 3, vitamin, khống chất cịn tốt cho sức khỏe da, tóc, móng tay [49] Trong omega có chứa hai thành phần quan trọng DHA EPA Chất EPA giúp cho da đƣợc tƣơi trẻ, mịn màng cung cấp dƣỡng chất cần thiết ni dƣỡng da từ sâu bên Ngoài ra, EPA cịn có khả kiểm sốt lƣợng dầu tiết da, phịng tránh nguy khơ da ngăn ngừa mụn trứng cá Một mặt tích cực dầu cá cịn giúp cho q trình lão hóa da bị chậm lại hạn chế xuất nếp nhăn Vậy việc dùng omega chống lão hóa, giảm hình thành nếp nhăn, làm đẹp da, Ngồi omega có vẹm xanh cịn có tác dụng giúp trị thâm, điều trị mụn [44] 1.1.5.6 Cải thiện tâm trạng Kẽm có nhiều vùng não Hippocampus, nơi chịu trách nhiệm cho trí nhớ cảm xúc Nồng độ kẽm thấp làm ức chế hoạt động thần kinh, góp phần dẫn đến hành vi bất thƣờng nhƣ ùng nổ giận dữ, cáu gắt hay hành vi cực đoan Ngƣời thiếu hụt kẽm có nguy mắc chứng rối loạn nhƣ tự kỷ, hiếu động thái quá, trầm cảm, rối loạn ăn uống, tâm thần phân liệt Trong vẹm xanh có chứa hàm lƣợng kẽm cao có lợi cho việc cải thiện điều hịa lại tâm trạng Giúp tâm trạng thoải mái phấn chấn [44] 1.1.5.7 Phịng chống nguy lỗng xương Vẹm xanh chứa hàm lƣợng giàu canxi, magie, kẽm dạng hữu giúp tăng cƣờng sức khỏe, ổn định xƣơng tăng dẻo dai [49] 1.1.6 Tình hình ni nhuyễn thể 1.1.6.1 Tình hình ni nhuyễn thể hai mảnh vỏ giới Sản lƣợng nuôi trồng vẹm giới tăng đặn kể từ năm 1950, đạt triệu vào năm 2016, trị giá 3,8 tỷ USD (3,4 tỷ Euro) (FAO 2019) Gần 94% sản lƣợng vẹm giới từ nuôi trồng thủy sản Các nƣớc sản xuất vẹm năm 2016 Trung Quốc (43%), Chile 15%, Tây Ban Nha (11%), Thái Lan (6%), New Zealand (5%), Ý, Pháp, Đại diện Hàn Quốc Hà an (tất ốn nƣớc với khoảng 3%), với Châu Âu đóng góp khoảng 20% tổng sản lƣợng Tuy nhiên, nƣớc châu Âu nhƣ Tây Ban Nha, Ý, Pháp Hà an nhà sản xuất quan trọng, sản lƣợng nuôi trồng vẹm châu Âu đạt đỉnh 600.000 vào cuối năm 1990 từ giảm xuống 480.000 (trị giá 420 triệu €, tƣơng đƣơng 465 triệu USD1 ) vào năm 2016 Sản lƣợng vẹm chiếm ⅓ sản lƣợng nuôi trồng EU Do đó, sản lƣợng vẹm giảm yếu tố then chốt góp phần làm đình trệ hoạt động ni trồng thủy sản EU có nguy không đạt đƣợc mục tiêu sản lƣợng nuôi trồng thủy sản năm 2020 EU (Guillen et al 2019a) [9] Nhìn chung, sản phẩm nhuyễn thể ngày đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng đƣợc thị trƣờng nƣớc phát triển ý Tuy nhiên, có nhiều nƣớc tham vọng phát triển sản xuất xuất mặt hàng này, thách thức lớn việc xây dựng kế hoạch phát triển ngành hàng 1.1.6.2 Tình hình ni nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam Nghề nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam có cách lâu, tập trung chủ yếu địa phƣơng ven iển nhƣ đầm ăng Cô, đầm Nha Phu (Khánh Hịa)…Về cơng tác khai thác cho thấy tổng sản lƣợng khai thác tự nhiên iển ven iển lồi nhuyễn thể có vỏ thuộc lớp hai chân ụng nhuyễn thể hai mảnh vỏ ƣớc đạt 300.000 – 350.000 tấn/năm [3] Theo FAO (2010), 10 nƣớc dẫn đầu giới sản lƣợng ni nhuyễn thể Việt Nam đứng thứ nhƣng so tốc độ tăng trƣởng bình quân năm Việt Nam nƣớc có tốc độ tăng trƣởng cao (24,9%/năm) Năm 1998, sản lƣợng nhuyễn thể nuôi Việt Nam đạt 21,3 nghìn đến năm 2003 đạt đƣợc 100 nghìn năm 2008 đạt 170 nghìn tấn, với nhiều đối tƣợng khác nhƣ: vẹm xanh, nghêu, trai ngọc, sò huyết, ốc hƣơng, ngƣ vành tai, vẹm xanh tu hài Hình thức ni đa dạng: nuôi bãi triều, nuôi lồng bè, nuôi dàn Nguồn nuôi chủ yếu dựa vào tự nhiên Nhƣng gần sản xuất nhân tạo thành công giống số loài nhƣ trai ngọc, điệp, bào ngƣ, vẹm xanh… [3] 1.1.6.3 Tình hình xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ chủ yếu sang thị trƣờng Mỹ, Canađa Đây hai thị trƣờng có mức tăng trƣởng ổn định khả quan nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam Tính đến hết tháng 9, Mỹ tăng 29% Canađa tăng 30% giá trị so với kỳ năm 2010 iên tiếp 9 tháng qua, Mỹ tăng nhập nhuyễn thể hai mảnh vỏ từ Việt Nam từ - 150% khối lƣợng giá trị so với kỳ năm trƣớc Còn Canađa, thay Thụy Sỹ danh sách thị trƣờng nhập lớn, tháng 4/2011, thị trƣờng làm "sáng bừng" tranh xuất nhuyễn thể Việt Nam tăng đến 1.800% khối lƣợng gần 1.100% giá trị so với kỳ năm ngoái Điều đƣa kết xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ sang Canađa tháng đầu năm tăng 30,3% so với kỳ năm ngoái [13] Từ tài liệu thu nhận đƣợc cho thấy tìm lớn từ nguồn tài nguyên thiên nhiên vẹm xanh việc phát triển sản phẩm mức độ tinh nhằm phục vụ cho sức khỏe nhân dân Việt Nam nói riêng, xuất thị trƣờng giới nói chung Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu phát triển sản phẩm từ vẹm xanh nhằm phát huy toàn giá trị nguồn tài nguyên cần thiết Các nghiên cứu trƣớc cho thấy chƣa tập trung nhiều vào việc nghiên cứu hoạt chất từ dịch thủy phân vẹm xanh hoạt tính chống oxi hóa Đây tiền đề nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu định hƣớng hoạt tính chống oxi hóa cho đối tƣợng 1.2 Tổng quan enzyme 1.2.1 Định nghĩa enzyme Enzyme chất xúc tác sinh học, có chất protein, hồ tan nƣớc Enzyme có phân tử lƣợng lớn từ 20 000 – 000 000 daltons nên không qua đƣợc màng bán thấm Enzyme có tính chất ƣu việt hẳn chất xúc tác hóa học Enzyme có cƣờng lực xúc tác lớn, điều kiện thích hợp hầu hết phản ứng có enzyme xúc tác xảy với tốc độ nhanh gấp 108-1011 lần so với phản ứng chất xúc tác Bên cạnh đó, enzyme có tính đặc hiệu cao tác dụng điều kiện đơn giản, nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động 30-50oC, pH trung tính áp suất thƣờng [19] 10 1.2.2 Đặc tính chung emzyme [21] - Enzyme có chất protein nên có tất thuộc tính lý hóa protein Đa số enzyme có dạng hình cầu khơng qua màng án thấm có kích thƣớc lớn - Tan nƣớc dung môi hữu phân cực khác, không tan ete dung môi không phân cực - Không bền dƣới tác dụng nhiệt độ, nhiệt độ cao enzym bị biến tính Mơt trƣờng axít hay azơ làm enzym khả hoạt động - Enzyme có tính lƣỡng tính: tùy pH mơi trƣờng mà tồn dạng: cation, anion hay trung hòa điện - Enzyme chia làm hai nhóm: enzyme cấu tử (chỉ chứa protein) nhƣ pepsin, amylase enzym hai cấu tử (trong phân tử cịn có nhóm khơng phải protein) Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần enzyme: • Apoenzyme: phần protein (nâng cao lực xúc tác enzyme, định tính đặc hiệu) • Coenzyme: phần protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), chất hợp chất hữu phức tạp 1.2.3 Tính đặc hiệu enzyme [35] Tính đặc hiệu đặc tính ản quan trọng enzyme, đƣợc chia thành nhóm chính, bao gồm: Đặc hiệu kiểu phản ứng: Phần nhiều enzyme có tính đặc hiệu với loại phản ứng định Những chất có khả xảy nhiều loại phản ứng hóa học loại phản ứng phải enzyme đặc hiệu xúc tác Acid amin có khả xảy phản ứng khử carboxyl, phản ứng khử amin cách carboxy hóa phản ứng vận chuyển nhóm amin, phản ứng cần có enzyme đặc hiệu tƣơng ứng xúc tác theo thứ tự decarboxylase, acid amin oxydase aminotransferase 11 Đặc hiệu chất: Enzyme lựa chọn chất tham gia phản ứng Khơng phải chất có khả phản ứng đƣợc enzyme tiếp nhận nhƣ mà enzyme chuyên xúc tác cho một vài chất định mức độ đặc hiệu tùy thuộc vào loại enzyme Có mức độ đặc hiệu chất chủ yếu: - Đặc hiệu tƣơng đối: Khơng phụ thuộc vào nhóm hóa học nằm hai bên liên kết - Đặc hiệu nhóm: Một hai nhóm nằm hai bên liên kết có cấu tạo định - Đặc hiệu tuyệt đối: Các nhóm hóa học hai bên liên kết phải xác định 1.2.4 Cơ chế xúc tác enzyme[36] Trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ tạo thành phức hợp trung gian enzyme - chất mà chất đƣợc hoạt hóa Khi chất kết hợp vào enzyme, kết chuyển dịch electron biến dạng liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổi động nhƣ năng, kết làm cho phân tử chất trở nên hoạt động hơn, nhờ tham gia phản ứng dễ dàng Năng lƣợng hoạt hóa có xúc tác enzyme khơng nhỏ nhiều so với trƣờng hợp xúc tác mà nhỏ so với trƣờng hợp có chất xúc tác thơng thƣờng Ví dụ phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O O2 khơng có chất xúc tác lƣợng hoạt hóa 18 Kcal/mol, có chất xúc tác platin lƣợng hoạt hóa 11,7 Kcal/mol, cịn có enzyme catalase xúc tác lƣợng hoạt hóa cịn 5,5 Kcal/mol Nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy trình tạo thành phức hợp enzyme chất biến đổi phức hợp thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự thƣờng trải qua a giai đoạn theo sơ đồ sau: 12 E+S P + ES (1-1) Trong đó: E enzyme, S chất (substrate), ES phức hợp enzyme - chất, P sản phẩm (product)  Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với chất liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - chất (ES) không bền, phản ứng xảy nhanh cần lƣợng hoạt hóa thấp  Giai đoạn thứ hai: Xảy biến đổi chất dẫn tới kéo căng phá vỡ liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng  Giai đoạn thứ ba: Tạo thành sản phẩm, cịn enzyme đƣợc giải phóng dƣới dạng tự Các loại liên kết chủ yếu đƣợc tạo thành E S phức hợp ES tƣơng tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tƣơng tác Van der Waals Mỗi loại liên kết đòi hỏi điều kiện khác chịu ảnh hƣởng khác có nƣớc 1.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme[36] 1.2.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ Mỗi enzyme hoạt động tốt nhiệt độ tối ƣu định Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính enzyme giảm tốc độ phản ứng giảm theo Nhiệt độ làm cho làm cho động enzyme chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều Các phức chất enzyme - chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy nhanh Tuy nhiên nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính Khi cấu hình vị trí xúc tác khơng cịn phù hợp với chất, enzyme hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ tối ƣu, chất phân tử enzyme chuyển động chậm Tần số va chạm chúng thấp hơn, phức hợp enzyme - chất hình thành tốc độ phản ứng giảm 13 1.2.5.2 Ảnh hưởng pH Mỗi enzyme hoạt động tối ƣu giới hạn pH thích hợp, chẳng hạn pepsin hoạt động tối ƣu pH=2, trypsin hoạt động tối ƣu pH=8,5 Khi pH lệch sang hai bên phía pH tối thích, hoạt tính enzyme giảm xuống 1.2.5.3 Ảnh hưởng nồng độ enzyme Tốc độ phản ứng phần lớn phản ứng biến đổi theo nồng độ chất nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng tăng nồng độ chất tƣơng đối thấp Khi nồng độ chất lớn tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ chất có khuynh hƣớng đạt cực đại nồng độ enzyme có mặt định Ở nồng độ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động chƣa liên kết với chất Nên việc tăng hạn chế chất tăng tốc độ phản ứng Tuy nhiên, nồng độ chất cao, hầu hết trung tâm phản ứng liên kết với chất làm cho số phân tử enzyme trở thành yếu tố giới hạn Khi số phân tử ezyme tăng tốc độ phản ứng cực đại tăng lên tƣơng ứng 1.2.6 Enzym protease 1.2.6.1 Đặc điểm enzym protease Protease enzyme phân huỷ protein làm xúc tác việc phân cắt liên kết peptide protein Protein chuỗi polyme acid amin với cơng thức chung R-CHNH2-COOH, liên kết peptide đƣợc hình thành liên kết cộng hóa trị nguyên tử nitơ nhóm amino với nguyên tử carbon nhóm carboxyl trƣớc với việc giải phóng nƣớc [23] Nhóm enzyme protease xúc tác trình thủy phân liên kết peptide phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối acid amin Ngồi ra, nhiều protease có khả thủy phân liên kết este vận chuyển acid amin 14 Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên đƣợc phân bố rộng rãi nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật đến thực vật, động vật Protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt so với động thực vật Protease vi sinh vật bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lƣợng hình dạng phân tử nên khó tách dƣới dạng tinh thể đồng 1.2.6.2 Giới thiệu enzyme protease Enzym protease enzyme thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) phân tử protein giải phóng acid amin, peton dittripepton Cấu trúc bậc bốn phân tử protein ảnh hƣởng đến trình phân giải chất dƣới tác dụng protease Dạng monomer dimer chất dễ phân giải dạng tetramer Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên đƣợc phân bố rộng rãi nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) đến thực vật (đu đủ, dứa…) động vật (gan, dày ê…) So với protease động vật thực vật, protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trƣớc hết hệ protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lƣợng hình dạng phân tử nên khó tách dƣới dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên protease vi sinh vật thƣờng có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để đa dạng Với enzym protease có nhiều cách phân loại nhƣng ta dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng: Dựa vào vị trí tác dụng protease lên peptide phân tử protein, ngƣời ta chia protease làm nhóm chính: 15 - Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động mạch polypeptide,) đƣợc phân thành loại:  Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide đầu N tự chuỗi poly peptide để giải phóng amino acid, dipeptid tripeptide  Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid đầu C chuỗi polypeptide giải phóng amino acid dipeptide - Endopeptidase: (Dựa vào động lực học chế xúc tác) đƣợc chia thành nhóm:  Serin proteinase: proteinase chứa nhóm –OH gốc serine trung tâm hoạt động có vai trị đặc biệt quan trọng hoạt động xúc tác enzyme Nhóm bao gồm nhóm nhỏ chymotripsin subtilisin Nhóm Chymotripsin: bao gồm enzyme động vật nhƣ chymotripsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm loại enzyme vi khuẩn nhƣ subtilisin carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh vùng kiềm tính thể đặc hiệu chất tƣơng đối rộng  Cystein proteinase: proteinase chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động Cystein protease bao gồm proteinase thực vật nhƣ papayin, bromelin, vài proteinase động vật proteinase ký sinh trùng Các Cystein proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu chất rộng  Aspatic proteinase: hầu hết asportic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm enzyme tiêu hoá nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin… Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trung tâm hoạt động thƣờng hoạt động mạnh pH trung tính 16  Metallo proteinase metallo proteinase: nhóm proteinase đƣợc tìm thấy vi khuẩn, nấm mốc nhƣ vi sinh vật bậc cao Các metallo proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính giảm hoạt động mạnh dƣới tác dụng EDTA Dựa vào thành phần amimo acid vùng pH tối ƣu protease, ngƣời ta chia làm nhóm:  Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động vùng pH acid 2-4  Protease kiềm: trypsin, chymmotrysin, … hoạt động vùng pH kiềm  Protease trung tính: nhƣ papain từ đu đủ, bromelain từ dứa, hoạt động vùng pH trung tính 7-8 Ngồi phân làm loại khác:  Enzyme protease nội bào enzyme đƣợc tiết từ bên ngoại iên màng protein đƣợc trích ly vào mơi trƣờng kĩ thuật trích ly  Enzyme protease ngoại đƣợc thu nhận từ q trình lên men hồn tất trình lên men diễn 1.2.6.3 Nguồn enzym protease a) Từ động vật Tụy tạng: Đây nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài có chứa nhiều enzyme Dạ dày ê: Trong ngăn thứ tƣ dày bê có tồn enzyme thuộc nhóm protease tên renin Enzyme từ lâu đƣợc sử dụng phổ biến công nghệ phomat Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả kết tủa mơi trƣờng sữa có đủ nồng độ Ca2+ Đây q trình đơng tụ sữa điển hình, đƣợc nghiên cứu ứng dụng đầy đủ Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin 17 (trong trƣờng hợp thu chế phẩm renin bê lớn dày ê phát triển đầy đủ có khả tiết pepsin) khả đơng tụ sữa Gần có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin nhƣ loài Eudothia Parasitica Mucor Purillus b) Nguồn thực vật Có loại protease thực vật nhƣ romelain, protease ficin Protease thu đƣợc từ nhựa lá, thân, đu đủ (Carica Papaya); bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple Plant) Các enzyme đƣợc sử dụng để chống lại tƣợng tủa trắng bia làm lạnh (Chilling Proofing) kết tủa protein Những ứng dụng khác protease thực vật công nghệ làm mềm thịt chế biến Ficin thu đƣợc từ nhựa cọ (ficus carica), enzyme đƣợc sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên Nguồn vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm vi rút nguồn protease tuyệt vời Protease vi khuẩn chiếm khoảng 40% lƣợng protein toàn cầu Protease vi khuẩn hoạt động môi trƣờng pH kiềm ổn định tới 60oC, cho phép sử dụng chúng sản xuất chất tẩy rửa Protease nấm có vùng pH rộng từ - 11 nhƣng tỉ lệ phản ứng khả chịu nhiệt so với enzyme từ vi khuẩn 1.2.6.4 Cơ chế xúc tác protease trình thủy phân Quá trình thủy phân protein thƣờng xảy theo trình tự định úc đầu, enzyme protease (endopeptidase) phân cắt liên kết peptit phân tử protein từ chuỗi polypeptide cho sản phẩm thủy phân có phân tử lƣợng trung bình (albumoza, peptide polypeptide) Tiếp enzyme peptidase (exopeptidase) phân cắt acid amin từ hai đầu chuỗi polypeptide cho sản phẩm thủy phân peptit mạch ngắn acid amin Bản chất trình q trình thủy phân protein thành acid amin hịa tan Q trình thủy phân protein đến acid amin trình phức tạp Enzyme protease phân cắt phân tử protein thành phân tử nhỏ Cơ chế hoạt động thủy phân protein enzyme protease đƣợc mô tả theo sơ đồ sau: 18 Endopeptidase(protease): Protein Exopeptidase (peptidase): Peptide Albumoza Pepton Polypeptide Peptide Peptide Acid amin 1.2.6.5 Một số ứng dụng enzym protease Protease có ứng dụng lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm Trong sản xuất sữa, enzyme làm đông tụ sữa (renin động vật, chất đông tụ lấy từ vi khuẩn, engineered chymosin đƣợc sử dụng sản xuất phomat) Chymosin có nhiều lợi renin động vật nhờ vào khả hoạt động đặc hiệu tính sẵn có Các vi sinh vật (thuộc chứng nhận GRAS) tạo protease Mucor michei, Bacillus subtilis Endothia parasitica Protease đƣợc sử dụng làm ánh để điều chỉnh protein gluten không tan lúa mì, việc định đặc tính bột Việc xử lí bột enzyme cải tiến sản xuất tay máy móc, giúp tiết kiệm thời gian tăng khối lƣợng bánh mì Enzyme từ vi khuẩn Aspergillus oryzae đƣợc sử dụng sản xuất bánh mì Tuy nhiên, protease tạo vị đắng, điều làm hạn chế việc sử dụng chúng ngành công nghiệp thực phẩm, vị đắng liên quan đến số lƣợng acid amin kị nƣớc thủy phân Sự kết hợp endoprotease aminopeptidase làm giảm vị đắng Protease có số ứng dụng sản xuất dƣợc phẩm nhƣ hỗ trợ tiêu hóa, sản xuất thực phẩm chức nhƣ tổng hợp aspartame sữa công thức cho trẻ sơ sinh 19 ... dạng hóa sản phẩm từ vẹm xanh (Perna viridis) thị trƣờng, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất bột vẹm xanh Perna viridis đông khô” Đây nghiên cứu. .. cam đoan báo cáo tốt nghiệp đề tài ? ?Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất ột vẹm xanh Perna viridis đông khô” cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn TS Nguyễn Ngọc... TÀI: Nghiên cứu tách chiết hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất ột vẹm xanh Perna viridis đông khô NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định thông số tối ƣu thời gian, pH, lƣợng chất để tối ƣu hóa