Nghiên cứu tách chiết các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa sản xuất bột vẹm xanh Perna viridis đông khô 2

CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Mẫu vẹm xanh (Perna viridis) đƣợc thu mua từ trại nuôi trồng xã Xuân Phƣơng, thị xã Sông Cầu, Phú Yên (Việt Nam) Vẹm xanh đƣợc thu hoạch vào quý III (từ đầu tháng đến cuối tháng 9) năm, cấp đông ảo quản theo điều kiện tiêu chuẩn để thực nghiên cứu 2.2 Hóa chất Nƣớc cất lần; hexan, K3[Fe(CN)6] 1%; FeCl3 0,1%; dung dịch đệm phosphat 0,2M (pH=6,6) (Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4 0,2M, Na2HPO4.12H2O); TCA10% (Tricloacetic acid 10% ); Vitamin C (100µg/ml); Tris-HCl 0,05M (pH=7,0) Dung dịch chuẩn DPPH (100µM); etanol; enzym protease (2mg/ml), dung dịch chuẩn ABTS; K2S2O8; Maltosedextrin Enzyme protease SEB-Neural PL thƣơng mại đƣợc mua từ Công ty Hƣng Thịnh đạt tiêu chuẩn ISO 9002 Các đặc điểm kỹ thuật tuân theo kỹ thuật tiêu chuẩn dành cho enzyme thực phẩm FAO/WHO JECFA, FCC IFOAM 2.3 Thiết bị dụng cụ 2.3.1 Thiết bị - Cân kĩ thuật - Máy sắc kí khí GC/MS - Cân phân tích - Tủ lắc - Tủ sấy - Tủ hút - Tủ lạnh - Máy đông khô - Máy đo độ ẩm - Máy sấy phun - Máy li tâm - Thiết bị chiết soxhle 2.3.2 Dụng cụ 20 - Đũa thủy tinh - Erlen - Bóp cao su - Đũa thủy tinh - Ống nhỏ giọt - Giá đỡ ống nghiệm - Giấy lọc - Ống ly tâm - Nhiệt kế - Bình cầu 500ml - Ống đong - Becher - Ống nghiệm - Bình định mức - Micro pipet - Bình tia - Pipet thẳng - Cuvet 2.4 Phƣơng pháp phân tích 2.4.1 Phương pháp xác định hàm ẩm [49]  Cách tiến hành: Cân 10g mẫu vẹm xanh đƣợc xay nhỏ đồng đƣợc cho vào cốc nung iết trƣớc khối lƣợng, sấy mẫu 100-105oC đến khối lƣợng khơng đổi, lƣợng nƣớc tự có mẫu bốc hết  Cơng thức tính độ ẩm (W): (2-1) Trong đó: M1 khối lƣợng cốc nung mẫu trƣớc sấy (g) M2 khối lƣợng cốc nung mẫu sau sấy (g) M khối lƣợng mẫu đem sấy (g) 2.4.2 Xác định hàm lượng kim loại, khoáng phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)  Cách tiến hành: o Cân từ 10g đến 20g mẫu thử, xác đến 0,1mg cho vào chén nung Trong tro hóa, khả sơi mạnh cần sấy tủ, nồi cách thủy bếp điện 100°C Tro hóa lị nung cài đặt chƣơng trình Đặt chén vào 20 lị nung nhiệt độ an đầu không cao 100°C Tăng nhiệt độ với tốc độ tối đa 50°C/ đến 450°C (kim loại) 525°C (khống) Để n chén qua đêm [25], [26] o Lấy chén nung khỏi lò để nguội àm ƣớt tro 1ml đến 3ml nƣớc cho ay nồi cách thủy bếp điện Đặt chén nung trở lại lị nhiệt độ khơng q 200°C tăng đến 450°C (kim loại) 525°C (khoáng) với tốc độ tăng nhiệt 50°C/ đến 100°C/ Tiếp tục tro hóa đến lâu ặp lại quy trình sản phẩm đƣợc tro hóa hồn tồn, tức tro có màu trắng/xám sáng màu Số lần cần thiết lặp lại tùy thuộc vào loại sản phẩm o Với mẫu đo kim loại Thêm 5ml dung dịch acid clohydric 6M vào chén nung đảm bảo tất tro tiếp xúc với acid àm ay acid nồi cách thủy bếp điện Hòa tan tro 10ml đến 30ml dung dịch acid nitric 0,1M, xác đến 0,1ml o Với mẫu đo khống, hịa tan tro 5ml HNO3 1M, làm ấm nồi bếp từ phút - phút để hỗ trợ dung dịch Thêm dung dịch vào bình định mức 50ml định mức HNO31M Thêm dung dịch LaCl3 vào độ pha loãng cuối dung dịch chuẩn mẫu thử để tạo 0,1% (w/v) a để xác định Mg o Xoay chén nung tất tro tiếp xúc với acid Đậy mặt kính đồng hồ để yên khoảng đến Sau đó, khuấy kỹ dung dịch chén nung que khuấy chuyển tất vào chai nhựa Xử lý mẫu trắng giống nhƣ mẫu thử Thực hai phép thử mẫu trắng cho mẻ phân tích o Đo phổ hấp thu nguyên tử: Chiều dài ƣớc sóng, hỗn hợp khí thơng số kỹ thuật khác thích hợp với kim loại đƣợc nêu sách hƣớng dẫn nhà sản xuất thiết bị cung cấp Các thông số khuyến cáo đƣợc nêu bảng 2.1 21 Bảng 2.1 Các thông số thiết bị kỹ thuật đo AAS Nguyên tố Ngọn lửa Bƣớc sóng (nm) Fe Dinitơ monoxit-axetylen, oxy hóa 248,30 Cu Khơng khí-axetylen, oxy hóa 324,70 Zn Khơng khí-axetylen, oxy hóa 213,90 Mg Khơng khí-axetylen, oxy hóa 285,20 K Khơng khí-axetylen, oxy hóa 227,00 Cơng thức tính: Tính hàm lƣợng kim loại mẫu thử, X, biểu thị miligam kilogam (mg/kg), theo cơng thức: (2-2) Trong đó: C nồng độ kim loại dung dịch thử, tính miligam lít (mg/l); C0 nồng độ trung bình kim loại dung dịch thử trắng, tính miligam lít (mg/l); V thể tích dung dịch thử, tính mililit (ml); m khối lƣợng phần mẫu thử, tính gam (g) 2.4.3 Xác định hàm lượng iod phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)[27]  Cách tiến hành: Cân khoảng 100mg đến 500mg mẫu (tính theo chất khơ), xác đến 1mg, thêm 5ml nƣớc trộn kỹ Thêm 1ml dung dịch TMAH trộn kỹ, làm kín ình đặt tủ sấy làm nóng trƣớc đến 90oC Sau 22 nguội, chuyển định lƣợng chứa sang ình định mức 25ml pha loãng nƣớc đến vạch Lọc qua lọc màng lỗ 0,45µm  Sau thiết bị đƣợc hiệu chuẩn, tiến hành phân tích mẫu thử Mỗi mẫu pha loãng đƣợc lọc từ 5-10ml phân tích ICP-MS Tốc độ đếm tín hiệu thử nghiệm giảm dần theo tăng tổng hàm lƣợng muối dung dịch mẫu thử Việc hiệu chỉnh hiệu ứng chất chuẩn nội hợp lý trƣờng hợp cƣờng độ dung dịch mẫu khác với cƣờng độ dung dịch hiệu chuẩn q 30%  Cơng thức tính: (2-3) Trong đó: C: nồng độ mẫu (mg/ml, dung dịch mẫu đọc đƣờng cong); V: thể tích dịch chiết (ml); d: hệ số pha loãng; W: khối lƣợng mẫu (g); S: nồng độ mẫu iod (µg/100g) 2.4.4 Xác định hàm lượng canxi, photpho phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS)  Cách tiến hành: Cân xác 1g mẫu thử, sấy khô nghiền cho vào chén sứ tráng men, dạng cao Tro hóa 500°C để nguội Tro ƣớt với 10 giọt H2O cẩn thận thêm 3-4 ml HNO3 (1:1) àm ay HNO3 dƣ nóng 100-120°C Quay trở lại lị tro hóa thêm 500°C Làm nguội chén, hòa tan tro 10ml HCl (1:1) chuyển định lƣợng sang ình định mức 50 ml Pha lỗng đến thể tích H2O [26]  23 Xác định nguyên tố đƣợc thực phƣơng pháp quang phổ phát xạ plasma kết hợp tự cảm Hiệu chuẩn thiết bị đƣợc thực thông qua việc sử dụng tiêu chuẩn hiệu chuẩn iết Sau hiệu chuẩn xong, giải pháp kiểm tra đƣợc phân tích  Cơng thức tính: Tính nồng độ cho phần tử dung dịch thử pha lỗng theo µg/ml (2-4) Trong đó: a: hàm lƣợng nguyên tố Ca P mẫu, tƣơng ứng với cƣờng độ phát xạ đƣợc đo đồ thị chuẩn (ppm); Vđm: thể tích định mức dung dịch đo phổ (ml); m: khối lƣợng mẫu lấy để phân tích (g); Fd: hệ số pha lỗng 2.4.5 Xác định hàm lượng vitamin B1 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)  Cách tiến hành: Mẫu đƣợc đồng hóa xử lý enzyme Mẫu thử xử lý enzyme đƣợc ly tâm lọc qua giấy lọc đầu lọc cỡ 0,45µm (nhằm loại bỏ hợp chất gây nhiễu bảo vệ cột HPLC) Tiến hành oxy hóa thiamin thành thiocrom Dung dịch mẫu đƣợc ơm vào hệ thống HP C pha đảo Bơm thể tích giống gồm dung dịch chuẩn, mẫu mẫu trắng vào hệ thống HPLC Nhận dạng thiocrom so sánh thời gian lƣu pick riêng lẻ sắc ký đồ thu đƣợc từ dung dịch mẫu dung dịch chuẩn [28]  Tính kết quả: Sử dụng đƣờng chuẩn, tính khối lƣợng vitamin B1, biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua, mg/100g mẫu 24 (2-5) Trong đó: Ats: diện tích pick chiều cao pick thiocrom thu đƣợc với dung dịch mẫu thử, tính đơn vị chiều cao diện tích; Ast: diện tích pick chiều cao pick thiocrom thu đƣợc với dung dịch thử chuẩn, tính đơn vị chiều cao diện tích; Vts: thể tích dung dịch mẫu thử, tính mililit (ml); ρ: nồng độ khối lƣợng thiamin clorua hydroclorua dung dịch chuẩn (µg/ml); ms: khối lƣợng mẫu, tính gam (g); 100: hộ số để tính hàm lƣợng 100g; 1000: hệ số chuyển đổi µg/100g thành mg/100g; Báo cáo kết vitamin B1 mg/100g đƣợc biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua (M=337,28) 2.4.6 Xác định hàm lượng vitamin B12 phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)  Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu thử điều kiện tránh ánh sáng UV Bảo quản mẫu thử chuẩn bị nhiệt độ từ 2oC đến 8oC sử dụng vòng 14 ngày Đồng hóa mẫu thử Thêm 30ml dung dịch đệm natri acetat 0,1M 1ml dung dịch kali xyanua 1% Đun nóng mẫu nhiệt độ 105oC, 60 phút Sau đó, lấy mẫu làm nguội bể nƣớc đá Cô đặc làm mẫu cột SPE C18 loại 600mg Sử dụng 44 ml axetonitril 25% vào cột SPE 600mg để rửa giải vitamin B12 Sau dịch đƣợc hịa tan nƣớc đƣợc ơm vào máy HPLC Với pha động D: Dung dịch axetonitril 2,5%, tốc độ dòng: 1,2 ml/phút; 25 điều chỉnh cho dịch rửa giải vitamin B12 chảy từ cột rây phân tử thời gian từ 10,5 phút đến 14,5 phút [29]  Tính kết quả: Tính phần khối lƣợng vitamin B12 mẫu thử, X (µg/kg), theo cơng thức sau: (2-6) Trong đó: Ci: nồng độ vitamin B12 dung dịch mẫu thử đƣợc ơm vào thiết bị HP C, đƣợc xác định từ đƣờng chuẩn, tính microgram lít (µg/l); D1: thể tích dung dịch pha lỗng thứ nhất, tính mililit (D1=100ml); D2: thể tích dung dịch pha lỗng cuối cùng, tính mililit (ml); V: thể tích dịch lọc đƣợc đƣa lên cột SPE, tính mililit (ml); w: khối lƣợng mẫu, tính gam (g) 2.4.7 Xác định hàm lượng vitamin A phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)  Cách tiến hành: Khởi động hệ thống HPLC cho phép làm nóng cân tối thiểu 30 phút với pha động di chuyển với tốc độ dòng chảy ml/phút.Tiêm vitamin chuẩn đƣợc thực thông qua xà phịng hóa vào hệ thống HPLC Điều chỉnh pha động để đạt đƣợc độ phân giải 1,5 tốt Các pha A B di động lần lƣợt nƣớc/metanol (20:80) metanol (100%), với hai pha di động bao gồm acid formic 0,1% Các thông số khác bao gồm tốc độ dòng pha di động 0,25 đến 0,50 ml/phút, nhiệt độ cột 29°C, thể tích tiêm mẫu 5μl, lƣợng va chạm 21V, áp suất khí ion 50 psi, nhiệt độ ion hóa 320°C [30]  Cơng thức tính: Sử dụng tiêu chuẩn USP Xác định yếu tố đáp ứng cho vitamin A (RFA): 26 (2-7) Trong đó: PkHTstd chiều cao cực đại diện tích tiêu chuẩn từ sắc ký đồ; mlstd ml tiêu chuẩn làm việc đƣợc sử dụng thủ tục; concstd cô đặc USP vitamin A (dƣới dạng retinol) chứng nhận USP (mg/g); mgstd mg tiêu chuẩn USP đƣợc cân phần thuốc thử 10000 yếu tố pha loãng kết hợp cho tiêu chuẩn vitamin A Thêm chiều cao diện tích pick hiệu chỉnh cho đồng phân 13-cis với đồng phân all-trans để có tổng chiều cao diện tích mẫu thử Tính nồng độ vitamin A (tính µg/g dƣới dạng retinol) theo phƣơng trình sau: (2-8) Trong đó: RFA: yếu tố ảnh hƣởng vitamin A; PkHTSPLE: tổng chiều cao mẫu thử diện tích diện tích tất trans 13-cis retinol; 100: khối lƣợng pha loãng phần thử nghiệm, ml; W: trọng lƣợng phần kiểm tra 2.4.8 Xác định hàm lượng acid béo phương pháp sắc ký khí (GC-MS)  Cách tiến hành: 27 Cân xác 100mg mẫu thử đồng vào bình mojonnier có nhãn Thêm 100mg acid pyrogallic 2ml dung dịch chuẩn nội triglyceride, 2,0ml ethanol trộn toàn phần mẫu thử đồng dung dịch Thêm 10ml HCl 8,3M trộn Đặt bình vào rổ bể siêu âm 70-80oC đƣợc đặt tốc độ khuấy trộn vừa phải 40 phút Thêm 25ml dietyl ete vào bình mojonnier Đậy nắp ình đặt máy ly tâm y tâm phút Đổ lớp ether (trên cùng) dƣ lƣợng lại cốc chứa chất béo chiết xuất Tiến hành methyl hóa Hịa tan dƣ lƣợng chất béo chiết xuất 2-3ml chloroform 2-3ml dietyl ete Cho ay đến khô bể nƣớc 40oC Thêm 2ml thuốc thử BF3 7% 1ml toluene Bịt kín lọ nắp vặn có chứa vách ngăn ằng chất liệu teflon/silicone Đặt lọ lò 45 phút 100oC Lắc nhẹ lọ sau 10 phút Làm nguội sau thêm 5ml H2O, 1ml hexane khoảng 1g Na2SO4 Đậy nắp lọ lắc phút đến có tƣợng tách lớp, sau chuyển lớp sang lọ khác chứa 1g Na2SO4 ( ƣu ý: ớp chứa FAME bao gồm FAME dung dịch chuẩn triglyceride) Tiêm FAME vào lọ lấy mẫu tự động để phân tích GC Sử dụng dung dịch chuẩn FAME để tối ƣu hóa phản ứng sắc ký trƣớc tiêm mẫu Sau tất điều kiện sắc ký đƣợc tối ƣu hóa, tiêm dung dịch thử nghiệm [31]  Cơng thức tính: Tính hệ số đáp ứng (Ri) cho acid béo i sau: (2-9) Trong đó: Psi: diện tích pick acid béo riêng dung dịch chuẩn FAME hỗn hợp; PsC11:0: diện tích pick acid béo C11:0 dung dịch chuẩn FAME hỗn hợp; 28  IC50 mẫu vẹm xanh sau đông khô theo phƣơng pháp DPPH Y X e Giá trị IC50 = 0,996 (mg/ml) 3.4.3.2 Đánh giá khả chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau đơng khô phương pháp ABTS  Chuẩn bị mẫu: Nồng độ mẫu(mg/ml) Trắng 10 15 20 25 Dịch ( l) 100 20 40 60 80 100 Nƣớc cất ( l) 3000 100 80 60 40 20 0 3000 3000 3000 3000 3000 3000 ABTS ( l) Để nhiệt độ phòng phút Tiến hành đo quang ƣớc sóng λ = 734 nm Bảng 3.7 Kết đo OD mẫu vẹm xanh sau đông khô ằng phƣơng pháp ABTS Nồng độ mẫu(mg/ml) 10 15 20 25 Lần 0,682 0,395 0,308 0,151 0,117 0,035 Lần 0,672 0,361 0,24 0,161 0,121 0,024 Lần 0,677 0,358 0,26 0,152 0,126 0,033 Trung bình 0,677 0,371 0,269 0,155 0,121 0,031 45,199 60,266 77,105 82,127 95,421 % Bắt gốc tự 56 Hình 10 Đồ thị biểu thị tƣơng quan % HTCO nồng độ mẫu vẹm xanh sau đông khô  IC50 mẫu vẹm xanh sau đông khô theo phƣơng pháp ABTS ABTS: Y e X Giá trị IC50 = 6,834 (mg/ml) 3.4.4 Đánh giá khả chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy phun 3.4.4.2 Đánh giá khả chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy phun DPPH Chuẩn bị mẫu Nồng độ mẫu(mg/ml) 2,5 7,5 10 12,5 Dịch thủy phân (ml) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 2 2 2 Nƣớc cất (ml) DPPH (ml) 57 Bảng 3.8 Kết đo OD mẫu vẹm xanh sau sấy phun Nồng độ 2,5 7,5 10 12,5 Lần 0,798 0,616 0,353 0,28 0,201 0,167 Lần 0,824 0,568 0,403 0,264 0,215 0,182 Lần 0,807 0,644 0,469 0,285 0,219 0,133 Trung bình 0,81 0,609 0,408 0,276 0,212 0,161 24,815 49,629 65,926 73,827 80,123 mẫu(mg/ml) % Bắt gốc tự Hình 3.1 Đồ thị biểu thị tƣơng quan % HTCO nồng độ mẫu vẹm xanh sau sấy phun  IC50 mẫu vẹm xanh sau sấy phun theo phƣơng pháp DPPH DPPH: Y e X Giá trị IC50 = 5,189 (mg/ml) 58 3.4.4.3 Đánh giá khả chống oxy hóa dịch thủy phân vẹm xanh sau sấy phun ABTS Chuẩn bị mẫu Nồng độ mẫu (mg/ml) 2,5 7,5 10 12,5 Dịch ( l) 10 20 30 40 50 Nƣớc cất ( l) 100 90 80 70 60 50 ABTS ( l) 3000 3000 3000 3000 3000 3000 Mẫu Trắng Nồng độ mẫu (mg/ml) 2,5 7,5 10 12,5 Dịch ( l) 10 20 30 40 50 Nƣớc cất 3090 3080 3070 3060 3050 59 Bảng 3.19 Kết đo OD mẫu vẹm xanh sau sấy phun Nồng độ mẫu (mg/ml) Mẫu trắng 0 2,5 0,002 0,003 7,5 0,004 10 0,005 12,5 0,007 Lần 0,712 0,418 0,309 0,228 0,153 0,066 Lần 0,711 0,399 0,362 0,191 0,148 0,059 Lần 0,713 0,478 0,34 0,195 0,181 0,096 Trung bình 0,712 0,432 0,337 0,205 0,161 0,074 % Độ giảm độ hấp thu 39,373 52,669 71,255 77,434 89,654 Hình 3.2 Đồ thị biểu thị tƣơng quan % HTCO nồng độ mẫu vẹm xanh sau sấy phun  IC50 mẫu vẹm xanh sau sấy phun theo phƣơng pháp ABTS 60 ABTS: Y X e Giá trị IC50 = 4,173 (mg/ml) 3.4.5 So sánh khả bắt gốc tự ABTS dịch thủy phân vẹm xanh enzym protease sau sấy phun đông khô Bảng 3.20 Giá trị IC50 dịch thủy phân vẹm xanh enzym protease sau sấy phun đông khơ Phƣơng trình hồi quy Dịch vẹm sau đơng khơ Y e Y e IC50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 ) X 6,834 Dịch vẹm sau sấy phun X 4,173 Nhận xét: Dựa vào bảng 3.20 ta thấy rằng, giá trị IC50 mẫu vẹm xanh sau đông khô (IC50 = 6,834) lớn so với mẫu vẹm xanh sau sấy phun (IC50 = 4,173), gấp 1,64 lần Từ đó, lần so sánh đƣợc mẫu vẹm xanh sau đơng khơ có hoạt tính bắt gốc tự ABTS thấp mẫu vẹm xanh sau sấy phun 61 3.4.6 So sánh khả bắt gốc tự DPPH dịch thủy phân bột vẹm xanh enzym protease sau sấy phun đông khô Bảng 3.21 Giá trị IC50 dịch thủy phân vẹm xanh enzym protease sau sấy phun đơng khơ Phƣơng trình hồi quy Dịch vẹm sau đông khô Dịch vẹm sau sấy phun IC 50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 ) Y e X 0,996 Y e X 5,189 Nhận xét Dựa vào Bảng 3.21 ta thấy rằng, giá trị IC50 mẫu vẹm xanh sau đông khô (IC50 = 0,996) thấp so với mẫu vẹm xanh sau sấy phun (IC50 = 5,189), khoảng 5,21 lần Từ kết trên, lần so sánh cho ta thấy mẫu vẹm xanh sau đông khơ có hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao nhiều so với mẫu vẹm xanh sau sấy phun 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Đề tài nghiên cứu thành phần dinh dƣỡng vẹm xanh Phú Yên tiêu hàm lƣợng omega 3, Hàm lƣợng omega có vẹm xanh (∑omega = 491,5mg/100g), hàm lƣợng omega vẹm xanh (∑omega = 98,4mg/100g) Đối với hàm lƣợng omega vẹm xanh (∑omega = 45,3 mg/100g Với hàm lƣợng omega 3,6,9 cao vẹm nguồn cung cấp acid béo tốt cho thể ngƣời Hàm lƣợng vitamin D mẫu vẹm xanh (