3.3.3.1 Đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Tiến hành:
(Khi cho DPPH 0,1mM vào thì lắc rồi đậy kín bằng giấy bạc).
Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tiến hành đo quang ở ƣớc sóng 517nm. Tính kết quả
Hoạt tính đánh ắt gốc tự do HTCO (%) đƣợc tính theo cơng thức:
Phƣơng pháp Khối lƣợng ban đầu
Khối lƣợng sau phƣơng pháp
Hiệu suất thu hồi (%) Sấy phun 100 9,45 9,45 Đông khô 100 3,89 3,89 Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Dịch thủy phân (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Tris-HCl (ml) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 DPPH (ml) 2 2 2 2 2 2
46
HTCO (%) = [(ODchứng – ODthử)/ ODchứng ] x 100 (3-1)
Các số liệu kết quả thử nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo độc lập khác nhau. Cùng với vitamin C, cho kết quả HTCO (%) cao nhất, tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn. Dựa vào đƣờng chuẩn tính đƣợc IC50. Giá trị IC50 càng thấp thì HTCO càng cao và ngƣợc lại.
Cách tính IC50: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % khả năng dập tắt gốc tự do theo nồng độ khảo sát của thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách thay y = 50.
Bảng 3.9 Kết quả đo OD của dịch thủy phân theo phƣơng pháp DPPH.
Khả năng ắt gốc tự do của mẫu:
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Lần 1 0,721 0,378 0,265 0,230 0,179 0,147 Lần 2 0,727 0,377 0,276 0,234 0,186 0,146 Lần 3 0,725 0,379 0,279 0,231 0,179 0,142 Trung bình 0,724 0,378 0,273 0,232 0,181 0,145 % Bắt gốc tự do trung bình 0,00 47,81 62,26 68,02 74,79 79,98
47
Kết quả Biểu đồ
DPPH
(%) 79.98%
Hình 3.3 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh theo phƣơng pháp DPPH.
IC50 của dịch thủy phân: 77,05 Giá trị IC50 = 10,56 (mg/ml).
Bảng 3.10 Kết quả đo OD của Vitamin C
Nồng độ VitC (µg/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 OD 0,768 0,645 0,539 0,441 0,327 0,21 0,115 0,021 % Bắt gốc tự do 0 16,015 29,818 42,578 57,422 72,656 85,026 97,265
49
Cân 0,034g K2S2O8 định mức lên 50ml bằng nƣớc cất (2,6mM). Trộn ABTS : K2S2O8 = 1 : 1.
Để hỗn hợp qua đêm ( > 18 giờ ở nhiệt độ phòng )
Thử nghiệm ABTS : Pha loãng ABTS bằng nƣớc cất cho đến khi đạt giá trị OD734nm = 0,7 0,02. Tiến hành: Nồng độ (mg/ml) Trắng 0 9 18 27 36 45 Dịch thủy phân (ml) 0,1 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 ABTS (ml) 0 3 3 3 3 3 3 Nƣớc cất (ml) 3 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
Bảng 3.12 Kết quả đo OD của dịch thủy phân vẹm xanh
Nồng độ mẫu(mg/ml) 0 9 18 27 36 45 Lần 1 0,674 0,508 0,350 0,241 0,138 0,12 Lần 2 0,615 0,46 0,316 0,233 0,173 0,126 Lần 3 0,676 0,440 0,316 0,231 0,157 0,114 Trung bình 0,655 0,469 0,327 0,235 0,171 0,120 % Độ giảm độ hấp thu 0,00 28,35 50,03 64,12 73,89 81,68
50
ABTS
(%) 81.68%
Hình 3.5 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ mẫu vẹm xanh theo phƣơng pháp ATBS .
IC50 của dịch thủy phân: 99,11 Giá trị IC50 = 18,31 (mg/ml).
Bảng 3.13 Kết quả đo % HTCO của Vitamin C.
Nồng độ VitC (µg/ml) L1 L2 L3 Trung bình 5 13,33 14,31 13,84 13,827 10 25,78 25,66 25,45 25,630 15 39,26 39,09 41,52 39,957 20 55,7 56,05 55,51 55,753 25 70,37 68,14 69,49 69,333 30 80,59 82,45 82,14 81,727
51
Hình 3.6 Đồ thị biểu thị sự tƣơng quan giữa % HTCO và nồng độ vitamin C Theo hình 3.6 ta thấy vitamin C ở nồng độ 30g/ml khả năng ắt gốc tự do trung bình 3 lần đo là cao nhất đạt 81,727 %.
3.3.3.3 So sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH và ATBS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
a) So sánh khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Bảng 3.14 So sánh khả năng ắt gốc tự do DPPH của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với vitamin C
Nhận xét: Giá trị IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do. Giá trị IC50 càng nhỏ thì mẫu có hoạt tính càng cao[36].
Phƣơng trình hồi quy IC50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 )
Dịch thủy phân vẹm Y e X 5 10,56
52
Dựa vào Bảng 3.14 ta thấy rằng, giá trị IC50 của dịch thủy phân ( IC50 = 10,56 ) lớn hơn rất nhiều so với mẫu chuẩn là vitamin C ( IC50 = 0,01373 ), gấp 769 lần. Từ đó, minh chứng đƣợc rằng mẫu dịch thủy phân bột vẹm xanh có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH thấp hơn nhiều so với vitamin C.
b) So sánh khả năng bắt gốc tự do ABTS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Bảng 3.15. So sánh khả năng ắt gốc tự do ABTS của dịch thủy phân bột vẹm xanh bằng enzym protease với Vitamin C
Dựa vào Bảng 3.15 ta thấy rằng, giá trị IC50 của dịch thủy phân (IC50 = 18,31) lớn hơn rất nhiều so với mẫu chuẩn là vitamin C (IC50 = 0,0183), gấp 1000 lần. Từ đó, minh chứng đƣợc rằng mẫu dịch thủy phân bột vẹm xanh có hoạt tính bắt gốc tự do ATBS thấp hơn nhiều so với vitamin C.
Nhận xét: Về ngun tắc, các chất kháng oxy hóa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại ƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD phản ánh khả năng kháng oxy hóa của mẫu. Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, chúng tôi xây dựng phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính, từ đó chúng tơi xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà tại đó ắt 50% gốc tự do DPPH) để làm cơ sở so sánh khả năng kháng oxy hóa giữa mẫu Vẹm xanh và Vitamin C. Mẫu Vẹm xanh có giá trị IC50 cao hơn Vitamin C vì vậy mẫu có khả năng ắt gốc tự do DPPH thấp hơn so với Vitamin C ( IC50 vẹm xanh: 10,56 > IC50 vitamin C: 3,49×10-3).
Phƣơng trình hồi quy IC50 ( 𝐦𝐠 𝐦𝐥 )
Dịch thủy phân
vẹm Y e X 18,31
Vitamin C Y= 2,759 X - 0,5015
53
Tƣơng tự, dịch thủy phân bột vẹm xanh cũng có hoạt tính bắt gốc tự do ATBS cao hơn nhiều so với vitamin C (IC50 dịch thủy phân:18.31 mg/ml > IC50 vitamin C: 0.0183 mg/ml).
Đông khô và sấy phun dịch thủy phân vẹm xanh bằng enzym protease 3.4
và thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa của chúng bằng phƣơng pháp DPPH và ABTS