VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ị g r KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội ĐÈ TÀI “NGHIÊN CỨU THIẾT KÉ VÀ BIÉU HIỆN NHÓM GEN íơxAVC TRÊN CHỦNG XẠ KHUẤN STREPTOMYCES LIV.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -Ị g r KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội ĐÈ TÀI: “NGHIÊN CỨU THIẾT KÉ VÀ BIÉU HIỆN NHĨM GEN í/ơxAVC TRÊN CHỦNG XẠ KHUẤN STREPTOMYCES LIVIDANS” Giáo viên hướng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên : Nguyễn Văn Tòng Lóp : CNSH-1301 HÀ NỘI - 2017 MỤC LỤC MỞ ĐÀU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Lịch sử kháng sinh 1.1.3 1.1.4 Phân loại kháng sinh Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2 Xạ khuẩn 10 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên .10 1.2.2 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 13 1.2.3 1.2.4 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius 14 Xạ khuần Streptomyces lividans TK24 15 1.3 Giói thiệu kháng sinh Doxorubicin 16 1.3.1 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 16 1.3.2 1.3.3 Cấu trúc cùa kháng sinh Doxorubicin 16 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 17 1.3.4 Lịch sừ nghiên cứu kháng sinh Doxorubicin .20 1.3.5 Cơ chế ho^t dộng yàhoạt (ini? ^iyh học củ^khặng; sinh Dỹxorubicin 22 1.4 Giói thiệu gen doxh., dnrV,drrC 24 1.4.1 Gen doxA dnrV 24 1.4.2 Gen drrC 26 1.5 Vector tách dòng pGEM-T vector biểu pIBR25 27 1.5.1 1.5.2 Vector tách dòngpGEM-T 27 Vector biếu pIBR25 28 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 29 1.6.1 Mục tiêu 29 1.6.2 Nội dung nghiên cứu 29 PHÀN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Chúng vi sinh vật, hóa chất, mơi trường thiết bị 31 2.1.1 2.1.2 2.1.3 Chủng vi sinh vật 31 Môi trường nuôi cấy 31 Thiết bị 33 2.1.4 Hóa chất 34 2.2 Các phưoitg pháp nghiên cún 37 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA genome từ xạ khuẩn 37 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi 38 2.2.3 2.2.4 Phương pháp PCR 39 Phương pháp điện di DNA gel agarose 40 2.2.5 2.2.6 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose 40 Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 41 2.2.7 Phương pháp chuyển gen vào E coli sốc nhiệt 42 2.2.8 Phương pháp nối DNA 43 2.2.9 Phương pháp cắt DNA enzyme giới hạn 43 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào xạ khuẩn Streptomyces lividans tế bào trần 44 PHÀN III KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Tách dòng gen doxAV drrC 46 3.1.1 Tách DNA tống số từ xạ khuẩn Streptomyces peucetius 46 3.1.2 Tách dòng gen doxAV bàng vector pGEM-T 47 3.1.3 Tách dòng gene drrC bang vector pGEM-T 49 3.2 Thiết kế vector biểu pIBR25-dAVC 52 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp plBR25-drrC 52 3.2.2 Tạo vector biểu plBR25.dAVC 53 3.3 Chuyển vector pIBR25-dAVC tế bào trần (Streptomyces lividans) 54 3.3.1 Ảnh hường cùa nồng độ' khang sình Thiostrepton phú tế bào 55 3.3.2 3.3.3 Ảnh hường thời gian phàn ứng enzyme (lysozyme) 55 Ánh hưởng nồng độ PEG bổ sung chuyển gene 56 3.4 Tách thu nhận hỗn hựp enzyme thô doxÁVC 57 PHẤN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 59 4.1 4.2 Kết luận 59 Dề xuất 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC CÁC CHŨ VIÉT TẤT Chữ viết tắt Amp Chú thích Ampicillin bp Base paire c Carbon DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotides ARN Ribonucleic Acid HTKS Hoạt tính kháng sinh kb Kilobase Polymerase Chain Reaction PCR1 hư viện , \X lẽn Đại nặc Mo Ha Nội SDS Sodium dodecyl sulfate IPTG lsopropyl-thio-p-galactoside SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate DTT Dithinotheitol Da Dalton DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng 33 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng 34 Bảng 3.1 Ánh hướng nồng độ kháng sinh phú bề mặt đìa ni 55 tế bào (overlay) Bảng 3.2 Khảo sát thời gian lysozyme thích hợp cho chuyền gene 56 Bảng 3.3 Ánh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất chuyến gene 56 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Tên hình Hình 1.1 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian hóa học Doxorubicin 17 Hình 1.3 Các gen tham gia vào trình sinh tồng hợp kháng sinh 18 DXR Hình 1.4 Các gen tham gia vào q trình mã hóa cho enzyme 19 Polyketide synthase loại II tổng hợp họp chất trung gian £-rhodomycinone Hình 1.5 Cơ chế đường tống hợp DNR DXR từ E- 20 rhodomycinone Hình 1.6 Các gen tham gia vào trình tống hợp kháng sinh 24 Dox^ịcựiiện Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 1.7 Tóm tắt phản ứng xúc tác gen doxA 25 Hình 1.8 Cẩu trúc pGEM - T vector dùng tách dịng gen 27 Hình 1.9 Cấu trúc vetcor biếu pIBR25 28 Hình 1.5 Tiến trình thực 30 Hình 3.1 Điện di DNA tổng số 46 Hình 3.2 Qui trình tạo vector tách dịng pGEM-T-í/ơxAV 47 Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR gen dox\N 47 Hình 3.4 Điện di plasmid pGEm-T-dơxAV từ khuấn lạc 48 Hình 3.5 Điện di plasmid pGEM-T-í/ơxAV cắt bàng 49 enzyme Xbal EcoRI Hình 3.6 Qui trình tạo vector pGEM-T-í/rrC 49 Hình 3.7 Điện di chạy PCR gen drrC 50 Hình 3.8 Điện di kiêm tra plasmid từ khuân lạc 51 Điện di plasmid pGEm-T-drrC cắt enzyme 51 Hình 3.9 Xbal HindlII Hình 3.10 Chạy điện di vector tái tổ hợp pIBR25-í//7-C 52 Hình 3.11 Kết điện di sán phẩm PCR pIBR25-í/rrC 53 Kết điện di pIBR25-JAVC cắt bới 54 Hình 3.12 enzyme Xbal EcoRI Hình 3.13 Các khuẩn lạc S.lividans pIBR25.í/AVC tái tổ 57 hợp phát triển đĩa thạch sau chuyến gen 36 Hình 3.14 Điện di enzyme tơng so protein Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội 58 MỞ ĐÀU Năm 1928, penicillin, loại kháng sinh đàu tiên tìm bời nhà sinh học người Scotland, Alexander Fleming Ông coi người mở kỳ nguyên vàng cùa kháng sinh y học Nó gọi thần dược tây y, cứu hàng triệu người bệnh năm khỏi chết gây nhiễm khuẩn Tuy nhiên, câu chuyện tuyệt vời dường đến hồi kết Sau 70 năm kháng sinh đưa vào y học, thời đại hồng kim cùa khơng cịn trì Có hàng triệu người chết năm thời đại chưa có kháng sinh, số tương tự năm tới Cơn ác mộng mang tên "kháng kháng sinh", xuất phát từ lạm dụng thuốc người Các hệ quà thấy vi khuấn trờ nên kháng thuốc làm cho hiệu q điều trị khơng cao Chính vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lí cùa người bệnh việc nghiên cứu, phát triền ứng dụng sàn xuất loại kháng sinh nghía vụ trách nhiệm nhà khoa học toàn giới Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cố tử cung, ung thư máu Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điếm vượt trội có phồ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình sinh tồng hợp tế bào ung thư Doxorubicin loại kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Doxorubicin có phổ tác dụng rộng so với DNR nhiên đường sinh tổng hợp tự nhiên chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius hàm lượng DNR tạo với hàm lượng lớn nhiều so với DXR Một biện pháp tăng kháng sinh DXR Page I thực phản ứng chuyến hóa DNR thành DXN Một biện pháp làm tăng suất kháng sinh DXR thực phàn ứng in vitro để biến đổi Daunorubicin thành Doxorubicin Có 37 gen tham gia vào q trình sinh tơng hợp kháng sinh Doxorubicin từ chủng xạ khuân Streptomỵces peucetius, có gen quan trọng doxN, dnr\ỉ drrC gen tham gia vào q trình chuyền hóa DNR thành Doxorubicin Gen doxÁ gen điều khiến trình sàn xuất DXR gen dnrV gen điều hòa gen doxA gen drrC gen kháng kháng sinh DXR giúp xạ khuẩn tồn mơi trường DXR Do vậy, thiếu gen làm cho sản lượng DXR giảm đáng kề Vì vậy, em tiến hành thực nghiên cứu đề tài mang tên: ‘'Nghiên cún thiết kế hiếu nhóm gen doxAVC chting xạ khuẩn Streptomyces lividans” nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh DXR Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Page I PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Ký nguyên đại hóa trị liệu kháng khuẩn việc tìm sulfonamid (Domagk, 1936) Thời kỳ vàng son cùa kháng sinh sản xuất penicilin đế dùng lâm sàng (1941) Kháng sinh coi chất vi sinh vật tiết (vi khuẩn, vi nấm), có kìm hãm phát triển vi sinh vật khác Khi người ta định nghĩa : "Kháng sinh sán phấm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tiết (vi khuẩn, vi nấm), có tác dụng ức chế phát triển tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác", theo Waksman 1942 sau, với phát triển khoa học, người ta tống hợp bán tổng họp kháng sinh tự nhiên (chloramphenicol); tổng họp nhân tạo chất có tính kháĩg*lẲíềtStólìt từ vi sinh vật chất diệt tế bào ung thư (actinomycin) Vì định nghĩa kháng sinh thay đổi: “Kháng sinh tất cà hợp chất có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp với nồng độ thấp có khã đặc hiệu kìm hãm phát triền tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh, đồng thời khơng có tác dụng tác dụng yếu lên người, động vật thực vật đường cung cấp chung” 131 Đê biếu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học cùa kháng sinh ml dung dịch (đơn vị/ml) hay mg chế phấm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh lượng kháng sinh tối thiều hoà tan thể tích mơi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiếm định thời gian xác định 13| Đơn vị kháng sinh quốc tế UI, ví dụ UI penicillin - 0,6 pg, UI streptomycin = l,()pg (Hopwood, 2007) Page I 3.1.2 Tách dòng gen doxAN vector pGEM-T Hình 3.2 Qui trình tạo vector tách dịng pGEM-T-doxAV DNA tổng số cúa xạ khuấn sau tách chiết sứ dụng làm khuôn phản ứng PCR đố khuếch đại đoạn gen doxAN với cặp moi đặc hiệu của, DNA ntgrkgr Ikb ladder^ vị tri phù hợp với kích thước đoạn gen doxAN 2076 bp Như vậy, thực phàn ứng PCR gen doxA\ thành cơng ( hình 3.3 ) M:1 kb DNA Ladder; Mầu 1: Sàn phẩm PCR gen doxAN Hình 3.3 Điện di sản phẩm PCR gen doxAV Page 147 Sau thực phản ứng PCR sản phấm tinh thu đoạn gen í/oxAV, thực phàn ứng ligase gen í/ơxAV vào vector pGEM-T Easy Sàn phẩm ligase chuyển gen vào E coli JM109 Sau ni cấy mơi trường LB có bổ sung kháng sinh amp(100mg/ml), X-gal IPTG theo ti lệ thích hợp Ni cấy qua đêm từ 16h-20h tiến hành nhặt khuân lạc trắng, khuấn lạc xanh nuôi cấy tiến hành tách plasmid từ vi khuẩn theo mục 2.2.6 Plamid thu tiến hành chạy điện di kiếm tra gel agarose % Kết thể hình 3.4 Ta thấy băng vạch khuấn lạc trắng cao băng vạch khuẩn lạc xanh Ờ khuấn lạc trắng xuất băng vạch băng vạch thứ tương ứng với vạch 5kb DNA marker plasmid pGEM-T-í/oxAV bao gồm vector pGEM-T (3 kb) gen doxM (2,1 kb) Như tạm thời kết luận chuyển gen doxAM vào vector pGEM-T thành công M:1 kb DNA Ladder; Mầu 1, 2: Khuẩn lạc tráng; Mầu 3: Khuấn lạc xanh Hình 3.4 Điện di plasmid pGEm-T-í/oxAV từ khuân lạc Em tiến hành cắt kiêm tra plasmid pGEM-T-í/ơxAV enzyme giới hạn Xba\ EcơRI, kết quà chạy điện di gel agarose 1% Kct hình 3.5 Page 148 M M: I kb DNA Ladder; Mau 1,2: Sàn phẩm cắt plasmid pGEM-T-íto.rAV Hình 3.5 Điện di plasmid pGEM-T-í/oxAV cat bang enzyme Xbal EcoRI Ket điện di thu băng vạch, băng vạch đầu tương ứng với vạch 3kb DNA marker với kích thước plasmid pGEM-T (3kb) vạch sáng thứ tương ứng với vạch 2kb DNA marker với kích thước đoạn gen doxMỈ cắt với enzyme giới hạn Xba\ EcoRI Như kết luận chuyền gen doxKN vào vector pGEM-T thành công 3.1.3 Tách dịng gene drrC vector pGEM-T Hình 3.6 Qui trình tạo vector pGEM-T-drrC DNA tống số xạ khuẩn sau tách chiết sử dụng làm khuôn phàn ứng PCR đế khuếch đại đoạn gen drrC với cặp mồi đặc hiệu Page 149 drrCỈ drrC2 Và sản phàm phán ứng PCR điện di kiêm tra gel agarose 1% Kct thể hình 3.7 Hình 3.7 Điện di chạy PCR gen drrC M: I kb DNA Ladder; 1,2: Mầu sản phẩm PCR Kct điện di thu I băng vạch tương ứng phía vạch kb cùa DNA marker Ikh ladder với kích thước gen drrC 2,3 kb Điều cho thấy việc PCR gen drrC thành công Sau thực phàn ứng PCR sản phấm tinh thu đoạn gen drrC, thực phản ứng ligase đoạn gen drrC vào vector pGEM-T Easy Sán phẩm ligase chuyến gen vào E.coli JM109 Sau ni cấy mơi trường LB có bổ sung kháng sinh amp( 100mg/ml), X-gal IPTG theo ti lệ thích hợp Ni cấy qua đêm từ 16h-20h tiến hành nhặt khuẩn lạc trắng, I khuẩn lạc xanh nuôi cay tiến hành tách plasmid từ vi khuấn theo mục 2.2.6 Plamid thu tiến hành chạy điện di kiếm tra gel agarose 1% kết quà thề hình 3.8 Kết cho thấy khuẩn lạc trắng xuất băng vạch băng vạch thứ tương ứng với vạch 5kb DNA marker plasmid pGEM-T-drrC bao gồm vector pGEM-T (3 kb) gen drrC (2,3 kb) Như vậy tạm thời kết luận chuyển gen drrC vào vector biểu pGEM-T thành công Page I 50 M: kb DNA Ladder; Mau 1: Khuẩn lạc xanh; Mầu 2,3: Khuẩn lạc trắng Hình 3.8 Điện di kiềm tra plasmid từ khuẩn lạc Em tiến hành cắt kiểm tra plasmid pGEM-T-drrC cắt với enzyme giới hạn EcơRI Hindỉỉỉ, kết chạy điện di gel agarose 1% Kết hình 3.9 M: I kb DNA Ladder; Mầu I, 2: plasmid pGEM-T-c/rrC cắt Hình 3.9 Điện di plasmid pGEm-T-í/rrC cat bang enzyme Xbal HindlII Ket quà điện di thu băng vạch, băng vạch đầu tương ứng với vạch 3kb DNA marker với kích thước plasmid pGEM-T (3kb) vạch sáng thứ tương ứng nam vạch 2kb 2.5kb DNA marker với kích thước đoạn gen drrC Như kết luận chuyến gen drrC vào vector pGEM-T thành công Page I 51 3.2 Thiết kế vector biểu pIBR25-í/AVC 3.2.1 Tạo vector tái tổ họp pIBR25-JrrC Em tiến hành cắt plasmid pGEM-T-í/rrC, vector biểu pIBR25 bang enzyme giới hạn EứỡRI Hindìĩỉ Tiến hành tinh sản phấm cắt từ gel agarose theo mục 2.2.5 Sau tinh ta thu sàn phẩm gen drrC pIBR25 cắt Tiếp theo em tiến hành thực phàn ứng ligase gen drrC với vector biểu pIBR25 để tạo vector tái tổ hợp pIBR25-í/rrC Biến nạp pIBR25-í/rrC vào E coli JM109, nuôi cấy môi trường thạch LB-Amp(100mg/ml) thời gian từ 16h-20h ta thu đìa thạch xuất khuẩn lạc Sau nhặt khuẩn lạc nuôi lỏng qua đêm đế tách DNA plasmid Tiến hành chạy điện di kiểm tra với mẫu plasmid pIBR25 gel agaroge 1% kết thề hình 3.10 Qua hình ảnh điện di (hình 3.10) quan sát thấy vạch sáng plasmid tách chiết có kích thước lớn Hình 3.10 Chạy diện di vector tái tổ họp pIBR25-drrC M: I kb DNA Ladder; Mầu 1,2,3,5: Vector tái tồ hợp pIBR25-í/rrC; Mầu 4: pIBR25 Page I 52 Thực phán ứng PCR đổ kiếm tra plasmid pIBR25-í/rrC Sản phấm chạy điện di gel agarose % Kct thố hình 3.11 Hình 3.11 Kết điện di sán phẩm PCR p!BR25-í/rrC M: kb DNA Ladder Mầu 1, 2, 4: Sản phẩm PCR plBR25-