VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẺ TÀI“ NGHIÊN củu ĐẶC ĐIÈM SINH HỌC VÀ KHÁ NĂNGSINH TRUỞNG SINH TÓNG HỢPACID CLAVULANIC TỪ CHỦNG XẠ KHUÁN STREPTOMYCES CLAVULK ERTS.
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẺ TÀI“ NGHIÊN củu ĐẶC ĐIÈM SINH HỌC VÀ KHÁ NĂNGSINH TRUỞNG-SINH TÓNG HỢPACID CLAVULANIC TỪ CHỦNG XẠ KHUÁN STREPTOMYCES CLAVULK.ERTS" Giáo viên hưóng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực : Trình Thị Thanh Hương Lóp : KSCNSH -1302 Hà Nội - 2017 LỊI CẢM ƠN Với lịng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Tạ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô q báu lịng nhiệt tình suốt q trình hồn thành khóa luận tot nghiệp cùa Em xin cám ơn thấy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức bàn đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Đồng thời em xin chân thành cám ơn chị Nguyền Thị Phương Tháo - Kỹ sư công nghệ sinh học nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình học tập hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tập nghiêmqứu xr-A TX • _ HJ1.TT1 XI A- Tnu viên Viện Đại hoc Mở Ha Nội Do thời gian khà cùa bủn thân hạn chế, khóa luận em khơng tránh khói thiêu sót Em mong nhận chi bảo cùa thầy đóng góp ý kiến cùa bạn đê khóa luận cùa em đầy đù hoàn chinh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinlì viên Trình Thị Thanh Hương MỤCLỤC MỚ ĐẦU Phần LTÓNGQUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Khái niệm kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh .6 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1,5 Các kháng sinh nhóm 0-lactam 11 1.2 Đại cương xạ khuấn 13 1.2.1 Đặc điếm chung xạ khuẩn 13 1,2.2 cấu tạo xạ khuẩn 13 1.2.3 Các yếu tố ảnh hường đến khả sinh axit cùa xạ khuẩn 17 1.3 Tổng quan xajkhpan Sưept(>mỵféíị Ảnh hướng nồng độ MgSO4.7H2O Với điều kiện toi ưu khào sát trên, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn hàm lượng MgSO4.7H2Okhác đế khảo sát ảnh hường hàm lượng MgSO4.7H2Otrong môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng sinh tổng hợp axit cụ thề 2g/l ; 4g/l; 6g/l ; 8g/l; 10g/l Kết xác định phương pháp đo vòng kháng khuấn sau ngày nuôi cấy với vsv kiểm định B.cereus amoxicillin trình bày bãng sau: Báng 3.1 lẢnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đen khả sinh trương sinh tổng hợp axil cùa chúng S.clavuligerus Khối lượng, Ị vjệ ' Trọng lượng ướt Khâ tăng hoạt MgSO4.7H2O (g) (g/1) tính axitõ (mm) 9,3 g/1 25,58 4g/l 26,45 10 6g/l 27,68 11,2 8g/l 27,61 10,5 10g/l 26,88 9,4 Trình Thị Thanh Hương - Lóp 1302 48 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Hình 3.15 Anh hường cùa hàm lượng MgSO4.7H2O đến sinh trưởng sinh tống hợp axit chủng S.clavuligerus Qua biếu đồ ta thấy: Hàm lượng muối thích hợp cho khả sinh trưởng g/1 trọng lượng ưởt trung bình đạt lớn nhất, đường kính vịng kháng khuẩn hàm lượng khác đường kính vịng kháng khuấn thu lớn Như vậy, nồng độ khoáng cao hay thấp anh hưởng đên khả sinh axit chủng Hình 3.16Vịng kháng khn cùaB.cereus cáchàm lượng MgSO4.7H2O khác Ghi chú: Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội 1- Chùng S.clavuligerus môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O2g/l 2- Chùng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O4g/l 3- Chủng S.clavuligerus mơi trườngcó hàm lượngMgSO4.7H2O8g/l 4-Chùng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượngMgSO4.7H2O 6g/l 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O10g/l 3.3 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 3.3.1 Ảnh hưởng thịi gian ni cấy Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0.5%, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn thời gian đề khão sát ảnh hưởng cứa thời gian nuôi cấy đến khả sinh tống hợp axit 24h, 48h, 72h, 96h, 120h Đối với mốc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với vsv kiềm định ỉằB.cereus amoxicillin, thu kết hình sau: Hình 3.17Biểu đồ ãnh hường cùa thời gian nuôi cấy đến khã sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết biếu đồ cho thấy chủng xạ khuấn S.clavuligerus tự nhiên phát triến tốt khoáng thời gian 72h khoáng thời gian lượng sàn phẩm tạo nhiều xạ khuẩn tăng trưởng với số lượng lớn lượng sản phấm trao đổi chất tạo nhiều Trước khoảng thời gian lượng axit tạo chưa nhiều xạ khuấn thích ứng chậm với mơi trường ni cấy Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Sau khoảng thời gian 96h nuôi cấy xạ khuẩn phát triển chậm lại môi trường dinh dưỡng cạn kiệt lượng axit tạo giảm dàn Hình 3.18Vịng kháng khuẩn cùữB.cereus thời gian nuôi cấy khác Ghi chú:l- Chùng S.clavuligerus trongmôi trường cóthời gian 24h 2- Chùng S.clavuligerus mơi trường có thời gian 48h 3- Chúng S.clavuligerus trongmơi trường cóthời gian 72h 4-Chúng S.clavuligerus mơi trường có thời gian 96h 5-Chủng S.clavuligems môi trường cộ thời gian 120h Thir vienVlên Đại nọc MO' I Nội 3.3.2 Anh hưởng nhiệt độ Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0,5%, ni cấy khống thời gian 72 giờ, pH 7, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn mốc nhiệt độ khác để khào sát ãnh hưởng cùa nhiệt độ nuôi cấy đen sinh tống họp axit cùa chủng xạ khuấn S.clavuligerus tự nhiên 24°C; 26 °C; 28 °C; 30 °C; 32 °C.Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính axit với vsv kiếm định ỉằB.cereusvằ amoxicillin, thu kết q hình Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội Hình 3.19 Biêu đồ ảnh hường nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tông hợp axit chúng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết quà biếu đồ cho thấy chúng xạ khuân S.clavuligerus tự nhiên ni mơi trường giàu khống tạo nhiều sân phâm nhiệt 28°c, lượng axit tạo ni-chủng-trong mơi trường giàu khống nhiệt độ khác hơn, đặc biệt nhiệt độ 24°c lượng axit tạo Điều cho thấy nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng lớn đến sinh axit chủng xạ khn S.clavuligerus Hình 3.20Vịng kháng khuẩn cùãB.cereus ni cấy nhiệt độ khác Ghi chú: 1- Chùng S.clavuligerus mồi trường có nhiệt độ 32°c Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 2- Chúng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 24"c 3- Chùng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 28"c 4-Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ 26°c 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có nhiệt độ30"C 3.3.3 Ảnh hưỏng pH Với hàm lượng glycerol 2,2% pepton 0,5%, ni cấy khoảng thời gian 72giờ Nhóm nghiên cứu lựa chọn pH đẻ kháo sát ánh hường pH môi trường nuôi cấy đến khã sinh tông hợp axit 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0.Sau đó, ta tiến hành kiếm tra hoạt tính axit với vsv kiếm định ỉằB.cereus amoxicillin thu kết quâ nhưhình sau: pH Hình 3.21 Biểu đồ anh hưởng pH mơi trường nuôi cấy đến khả sinh tồng hợp axit chúng S.clavuligerus tự nhiên Qua kết quà biểu đồ cho thấy chúng xạ khuấn S.clavuligerus tự nhiên phát triển tốt mơi trường giàu khống có pH 7,0 cịn mơi trường có pH khác lượng kháng sinh tạo hon, đặc biệt mơi trường có pH - 6,0 lượng axit tạo Như pH mơi trường ni cấy có ành hưởng lớn đến sinh axit cùa chúng khuấn S.cỉavuligerus tự nhiên, pH cao thấp làm ảnh hướng đến số khống chất Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Cần thiết cho sinh tổng hợp kháng sinh, làm cho khả sinh axit cùa chùng xạ khuân S.clavuligerus tự nhiên bị giảm Hình 3.22 Vịng kháng khuấn củaB.cerens ni cấy pH khác Ghi chú: 1- Chúng S.clavuligerus mơi trường có pH = 2- Chúng S.clavuligerus mồi trường có pH = 6,5 3- Chúng S.clavuligerus mồi trường có pH = 4-Chting.S.J«,VMZ/gi>rw^ mơỹtíỊXỜng 5-Chủng S.clavuligerus mơi trường có pH = 3.3.6 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn sản phẩm chũngS cla vuligerus Chúng S.clavuligerus tự nhiên ni cấy mơi trường giàu khống lịng Sau đó, dịch ni cùa chủng xạ khuấn thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc,với vi sinh vật kiếm định B.cereus Hình 3.23 Kết thứ hoạt tính kháng khuấn chúngS.clavuligerus từ Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội PHẦN - KÉT LUẶN VÀ ĐÈ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề thu kết quà sau: l)Khão sát sơ đặc điếm hình thái chủngS.clavuligerustợ nhiênbao gồnrhình dạng khuẩn lạc, dạng khuẩn ty, màu sắc môi trường nuôi cấy khác 2)Nghiên cứu khã sinh trường sinh kháng sinh chủng S.clavuligerus tự nhiên cho thấy: nguồn cacbonhydratthích hợp để tạo môi trường nuôi cấy cho chúng sinh trướng phát triểnlà glycerol với hàm lượng 2,2%; nguồn nitơ thích hợp pepton với hàm lượng 0,5%; hàm lượng vi lượng tồng thích hợp 0,2% Chúng phát triển mạnh khoáng thời gian 72 ni cấy mơi trường có pH 7, nhiệt độ 28°c 4.2 Đề xuất - Thư viện Viện Oại Ị-]ỌC Mo' Hà Nội Tiếp tục nghiên cứu đề tài đề cải tạo, nâng cao hiệu suất sinh tống hợp axil clavulanic chùngS.clavuligerus bàng phương pháp vật lý phương pháp hóa học - Thực lên men sản xuất axit clavulanic chủng S.clavuligerus quy mơ lớn Nghiên cứu đưa quy trình lên men thu nhận tách axit clavulanic thơ tìr xạ khuấn S.clavuligerus - Nghiên cứu phương pháp tách chiết tinh axit clavulanic cùa chùng S.clavuligerus đế phục vụ cho y học nghiên cứu liếp theo Trình Thị Thanh Huong - Lóp 1302 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO A I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cao Văn Thu, Bài giăng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu sinh chất kháng sinh cùa so chủng xạ khuấn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội Bùi Thị Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Hưng, TV, Malla, s., Park, BC Liou, K Lee HC, Sohng, JK (2007) J Microbiol Công nghệ sinh., 17, 1538-1545 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuấn thuộc chi Streptomyces sinh CKS chống nam gây bệnh đạo ôn thối cổ rề phân lập lại Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1994 Nguyễn Hoàng Chien /Nghiên cựu chủng xạ khuấn Streptomyces V6 sinh CKS chống vi khuấn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội, 2000 Nguyền Khang, Kháng sinh học ứng dụng, Nhà xuất bàn y học Hà Nội,Trang 7-20, 2005 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyền Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứuvi sinh vật học Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 - 345 Nguyền Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội, tr 39 - 41 10 Nguyền Lân Dũng, Nguyền Nữ Kim Thào, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 11 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 12 Nguyen Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tứ Xạ khuân sinh choromomycin, Act.A buraviensis,microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp 13 Nguyền Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 14 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TSsinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 15 A study on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, FED-batch and continuous processes Article (PDF Available)inBrazilian Journal of Chemical Engineering 22(4) • October 2005 16 Daniela A ịVỊana Mụrpụẹs, Mafcja Ư Carneirp Cunha,2 Janete M Araujo ,3 José L Lima-Filho ,2 Attilio Convert!, 4Adalberto Pessoa- Jr , Ana L Figueiredo Porto Optimization of clavulanic acid production by Streptomyces daufpe 3060 by response surface methodology.Fermentation Conditions that Affect Clavulanic Acid Production in Streptomyces clavuligerus: A Systematic Review Published online 2016 Apr 22 doi: 10.3389/fmicb.2016.00522 17 Production of Clavulanic Acid by Streptomyces Clavuligerus Bacteria using Rapeseed Meal as The Source of Nitrogen Herbal Medicines Research Center, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran (HMRC) 18 Studies on the Biosynthetic Pathways of Clavulanic Acid and Cephamycin c in Streptomyces clavuligerus A.K Mackenzie Faculty of Natural Resources and Agricultural Sciences Trình Thị Thanh Hương - Lóp 1302 19 Manipulation of the physiology of clavulanic acid production in Strcptomyces clavuligcrus Paul R Ivest and Michael E Bushell Author for correspondence: Michael E Bushell Tel: +44 1483 259277 Fax: +44 1483 300374 e-mail : m.bushell@surrey.ac.uk Microbial Physiology and Ecology Group, University of Surrey, Guildford, Surrey GU2 5XH, UK ~ 20 Improvement for the production of clavulanic acid by mutant Streptomyces clavuligerus S.D Lee, s.w Park, K.K Ohl , S.I Hong and s.w Kim Department of Chemical Engineering, Korea University, Seoul, and Department of Industrial Chemistry, Dankook University, Cheonan, Korea 2001/253: received 30 August 2001 and accepted 21 January 2002 21 Parente, E Ricciardi, A and Addavio, G (1994) Influence of pH on growth and bactriocin production by Lactococcus lactis subsp lactis 140NWC during batch fermentation Applied Microbial Biotechnology 41, 388-394 22 Pitlik, J (1997) The fate of |Ị2ị^r?^3~ụ2-13C2]-D,C.-glycerate in clavulanic acid biosynthesis Chemical Communications 1997, 225-226 Rolinson, G.N (1991) Evolution of b-lactamase inhibitors Reviews of Infectious Diseases 13, 5727-5732 University of Chicago 23 Baggaley, K.H., Brown, A.G and Schofield C.J (1997) Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams Natural Product Reports 14,309-333 24 Cole, M (1981) United States patent No 4,525,352 Foulstone, M and Readings, c (1982) Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the components of augmentin in biological fluids with high performance liquid chromatography Antimicrobial Agents and Chemotherapy 22, 753-762 25 Lee, D.c and Ho, c.c (1996) Production of clavulanic acid and cephamycin c by Streptomyces clavuligerus in palm-oil medium World Journal of Microbiological Biotechnology 12, 73-75 Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 26 Lee, J.H., Lee, LY and Park, Y.H (1997) Optimal pH control of batch processes for the production of culdlan by Agrobacterium species Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 23, 143-148 27 Mayer, A.F and Decker W.D (1996) Simultaneous production and decomposition of clavulanic acid during Streptomyces clavuligerus cultivations Applied Microbiological Biotechnology 45, 41-46 28 SE Jensen, KJ Elder, KA Aidoo, AS ParadkarEnzymes catalyzing the early steps of clavulanic acid biosynthesis are encoded by two sets of paralogous genes in Streptomyces clavuligerus Antimicrob Agents Chemother, 44 (2000), pp 720-726 29 M Cole Clavulanic acid: a beta-lactamase-inhibiting beta-lactam from Streptomyces clavuligerus Antimicrob Agents Chemother, 11 (1977), pp 852-857 c TÀI LIỆU WEBSITE 31 http://vi Wikipedia.org/wiki/sắc_kíjớp_mỏng 32.http://www.case.vn/vi-VN/87/88/l 17/details.case 33.http://www.khoahoc.com, vn/doisong/ung-dung/5463 Nam-kho-bao-vebong-khoi-nam-gay-benh.aspx 34.http://www.sciencefoto.de/detail.php?id=214660&rubrik=Bio&lang=en& q=&qrubrik= http://www.voer.cdu.vn/modulc/khoa-hoc-va-cong-nghe/xac-dinh-su-sinhtruong-cua-vi-sinh-vat.html http://sciencc.howstuffworks.com/qucstion479.htm Trình Thị Thanh Hương - Lớp 1302 ... họp sinh tổng họp sinh axit clavulanic sinh từ chúng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus > Lựa chọn điều kiên thích hợp ni cấy xạ khuẩn sinh axit clavulanic sinh từ chúng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus. .. điểm sinh học Streptomyces clavuligerus > Nghiên cứu khà sinh tồng hợp- sinh trưởng chủng xạ khuân đê tạo axit clavulanic 1.4.2 Nội dung dề tài > Nghiên cứu đặc điểm chùng xạ khuấn Streptomyces clavuligerus. .. clavulanic - chế phẩm phối hợp giúp tăng hoạt tính kháng sinh nhóm nghiên cứu thực đề tài: "Nghiên cún đặc điềm sinh học khả sinh truóng -sinh tổng họp acid clavulanic sinh tù’ chúng xạ khuẩn Streptomyces