Nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh trong cây thạch tùng răng cưa (HUPERZIA SERRATA) phân bố ở đà lạt việt nam

:p lí KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC .Cũ ••* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đe tài: NGHIÊN CÚT ĐA DẠNG VI NÁM NỘI SINH TRONG CÂY THẠCÉ TÙNG RÁNG ỨƯA (Huperùa serrata) PHÂN BỐ Ỏ ĐÀ LẠT - VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn : TS LÊ THỊ MINH THÀNH Sinh viên thực : NGUYÊN THỊ LINH Lóp : CNSH13 Hà Nội - 2017 Nguyen Thị Linh Lớp 13-01 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TÁT V DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG .vii MỞ ĐÀU 1 Tính cấp thiết Mục tiêu cửa đề tài 3 Nội dung nghiên cún đề tài PHÀN 1: TÔNG QUAN 1.1 Các nghiên cún Thạch tùng cưa (Huperzia serrate) 1.1.1 Lịch SUnghiên cứu 1.1.2 1.1.3 Phân loại kifoaViện^ĐạrhọơMỚ^H-à^Nợi Mô tả 1.1.4 Phân bố 7.7.5 1.2 Hoạt chat Huperzine A Thạch tùng cua Tổng quan vi nấm nội sinh thực vật 7.2.7 Khái niệm vi nấm nội sinh thực vật 7.2.7 Quan hệ giữ vỉ nấm nội sinh thực vật 7.2.2 Nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh thực vật 1.2.3 ủng dụng vi nấm nội sinh thực vật 13 1.3 Tinh hình nghiên cún nấm nội sinh Thạch tùng cưa 15 1.3.1 1.3.2 1.4 1.4.1 Các nghiên cứu nước 15 Các nghiên cứu nước 16 Nghiên cún định danh vi nấm 16 Nghiên cứu định danh vi nấm theo phương pháp truyền thống 16 Nguyễn Thị Linh 1.4.2 Lớp 13-01 Kỹ thuật sinh học phân tử dùng định danh vi nấm nội sinh .18 PHẦN : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 25 2.1 2.1.1 2.1.2 2.2 Thòi gian, địa điểm đối tưọng nghiên cứu 25 Thòi gian địa điểm 25 Đối tượng nghiên cứu 25 Hóa chất trang thiết bị thí nghiệm 25 2.2.1 Hóa chất 25 2.2.2 Trang thiết bị thí nghiệm 26 2.2.3 2.3 Môi trường dung dịch 26 Phưong pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 27 2.3.2 Phương pháp phân lập báo quán nấm nội sinh 27 2.3.3 Phương pháp định danh vi nấm nội sinh theo phương pháp truyền thống 11 28 2.3.3 Định danh vi nấm nội sinh phương pháp sinh học phân tử 29 PHÀN 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết thu nhập mẫu phân lập nấm nội sinh từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt 33 3.1.1 Ket thu thập mẫu 33 3.1.2 Kết phân lập nấm nội sinh từ Thạch tùng cua 34 3.2 Kết định danh sư chùng nấm nội sinh phưưng pháp truyền thống 35 3.3 Kết định danh chủng nấm nội sinh phân tích trình tự vùng rAD N - ITS 43 3.3.1 Kết khuếch đại vùng ITS1 44 3.3.2 Kết giải trình tự vùng gen ITSỈ .45 3.4 Đánh giá đa dạng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố ỏ’ Đà Lạt - Việt Nam 46 iii Nguyễn Thị Linh Lớp 13-01 PHÀN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 57 Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội iv Nguyen Thị Linh Lớp 13-01 DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TẤT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleotic BIAST Basic Local Alignment Search Tool AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ETS External transcribed spacer HTKL Thư vj^ Hà Nội ITS Internal transcribed spacer LSU Large subunit NCBI National Center for Biotechnology Informatic PDA Potato Dextrose Agar PCR Polymerase chain reaction rADN Ribosomal acid deoxyribonucleotide rARN Ribosomal acid rubonucletic RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Rectriction fragment length polymorphism SDS Sodium Dodecyl Sulfate ssu Small subun Nguyen Thị Linh Lớp 13-01 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Thạch tùng cưa [6J Hình 1.2: cấu trúc hóa học chất Huperzine A [13] Hình 1.3: Hình ănh vi nấm nội sinh loài thực vật thuộc học Hoa loa kèn (Erythronium americanum) [9] Hình 1.4: Hệ sợi nấm nội sinh phát triền rễ Phong đường.[9] HÌnh 1.5: Sơ đồ vùng rADN - ITS nấm 19 Hình 3.1: Mầu Thạch tùng cưa (H.serrata) Đài Lạt- Việt Nam 34 Hình 3.2: Đặc điếm hìnhthái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 37 Hình 3.3: Đặc điếm hìnhthái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 37 Hình 3.4: Đặc điềm hìnhthái khuẩn lạc nấm nội sinh thuộc nhóm HTKL 37 Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc bảo tứ nấm chi Mucor thuộc nhóm HTKL 40 ^Thuvjjen-Viên Đại học Mợ Hà Nơi A ,, Hình 3.6: Hình thái khuân lạc bảo tử nam chi Acremonium thuộc nhóm HTKL 40 Hình 3.7: Hình thái khuân lạc bảo tử nấm chi Clasdosporium thuộc nhóm HTKL 41 Hình 3.8: Hình thái khuẩn lạc bão tử nấm chi Alternaria thuộc nhóm HTKL1.41 Hình 3.9: Hình thái khuấn lạc bào tử nấm chi Trichoderma thuộc nhóm HTKL , 42 Hình 3.10: Hình thái khuấn lạc bào tử nấm chi Phialophara thuộc nhóm HTKL 43 Hình 3.11: Hình thái khuấn lạc bào tứ nấm bất thụ có vách 43 Hình 3.12: Ket điện di sản phẩm PCR gel agarose 45 vi Nguyen Thị Linh Lớp 13-01 DANH MỤC BẢNG Báng 3.1: Ket phân lập nấm nội sinh từ mẫu Thạch tùng cưa thu thập từ Đà Lạt 35 Băng 3.2: Kết q phân nhóm hình thái khuấn lạc nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa Đà Lạt 38 Bằng 3.3: Mức độ tương đồng gen ITS1 chủng nấm so sánh với trình tự chúng GenBank 46 Bằng 3.4: Ket nhận dạng đến chi chủng nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa phân bổ Langbiang - Đà Lạt - Việt Nam 49 Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội vii MỞ ĐÀU Tính cấp thiết Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khống 80% dân số giới từ nước phát triền dựa yếu vào loại thuốc truyền thống (chu yếu có nguồn gốc từ thực vật) để chăm sóc sức khóe Trong 119 loại hợp chất hóa học, 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, loại thuốc sử dụng ngày nhiều nhiều quốc gia Hiện có nhiều chất chiết xuất từ có tác dụng chữa bệnh, vấn đề đặt chất có hoạt tính sinh học sinh kết quà mối liên hệ tương sinh với vi sinh vật nội sinh có ích mơ thực vật Vi sinh vật nội sinh thực vật (endophyte) vi sinh vật phát triển bên mô sâu thường khơng gây bệnh cho Trong đó, vi khuấn vi nấm vi sinh vật nội sinh thường gặp Tần số ly trích vi sinh vật nội sinh vi nấm chiếm tỷ lệ cao hơn, hội tìm chúng vi nấm nội sinh từ cao Những nghiên cứu gần cùa " Toil’ vlgirVicnDaTnocMo;HaNoi ,, , Hawksworth Rossman ước tính có đên triệu loài vi nâm khác nhau, chi khoảng lOO.OOO loài mô tả Hiện tương lai, vi nam nội sinh nguồn đa dạng sinh học dồi dào, lạ có nhiều lồi chưa biết đến Nấm nội sinh thực vật thường sinh trưởng, phát triến nội sinh hoàn toàn phần mô cùa tế bào chủ, thường không gây triệu chứng rõ ràng bệnh Một số nấm endophytic kích thích tăng trường thực vật sàn xuất chất có hoạt tính sinh học với chức hoạt động chuyến hóa Một số nấm nội sinh tìm thấy nguồn tiềm thuốc trị điều trị bệnh Gần đây, nấm nội sinh phân lập từ loại trồng chấp nhận nguồn nguyên liệu quan trọng ngành công nghiệp dược Một lượng lớn hợp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học khác chiết xuất từ nấm nội sinh Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrate ) biết nhiều Trung Quốc tên Qian Ceng Ta loài thuốc dùng đe chữa bệnh cầm máu, rách cơ, sốt tinh thần phân lập H serrate thuốc quý chúng sử dụng Trung Quốc đề điều trị bệnh: sốt , lạnh, sung, tâm thần phân liệt, thấp khớp, từ ngàn năm nay, Mỹ Châu Âu, chúng bồ sung chế độ ăn uống đề tăng cường trí nhớ tăng cường nhận thức cho hệ thần kinh trung ương Hoạt chất Thạch tùng cưa Huperzine Hầu hết Huperzine A (HupA) sử dụng loài thuốc thào dược chiết xuất từ H serrate số loài họ Thạch sam Tuy nhiên, H.serrata khác họ Thạch sam yêu cầu điều kiện canh tác ngặt nghèo sinh trướng phát triến chậm, phái nhiều năm (có lên đến 15 năm) phát triển tự nhiên đẻ sử dụng làm thuốc Chính vậy, nguồn cung cấp hoạt chất HupA từ Thạch tùng cưa làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc không cao (khoảng 0,1%) Bởi vậy, có nhiều nồ lực đe thực việc sản xuất HupA nuôi cấy in vitro H.serrata tổng hợp hóa học Việc nghiên cứu vi nấm nội sinh Thach tùng cưa săn sinh HupA í Thuyjetfyicn Dai hoc MơHa,NoT Il­ se mang den hiệu qua to lớn việc thu nhạn hoạt chat HupA, tiêt kiệm thời gian chi phí phương pháp chiết xuất từ Hiện giới, nhà khoa học Trung Quốc - nơi sản xuất nhiều HupA làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược điều che thuốc hồ trợ chữa trị bệnh Alzheimer - tiến hành nghiên cứu phân lập số chúng nấm nội sinh có khả sàn sinh hoạt chất HupA, chủng nghiên cứu điều kiện lên men đề tách chiết lượng lớn HupA phục vụ cho ngành công nghiệp dược hồ trợ điều trị bệnh Alzheimer Ờ Việt Nam, Thạch tùng cưa phát Đà Lạt, Lâm Đồng độ cao 1.000 m Đây loài dược liệu q hiếm, thuộc danh sách "đị" Chương trình Nghiên círu bảo tồn phát triển nguồn gen địa quý thuốc, chưa quan tâm nghiên cứu khai thác ứng dụng điều trị bệnh Việt Nam Mặt khác, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa Việt Nam chưa có cơng bố Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh Thạch tùng cua (Huperzia serrata) phân bố Đà Lạt - Việt Nam” thực với hy vọng mớ hướng việc nghiên cứu phân lập chủng nấm nội sinh có khả sản sinh hoạt chất HupA nhằm hướng tới nguồn nguyên liệu lớn có hiệu kinh tế cho ngành công nghiệp dược nước điều trị bệnh rối loạn trí nhớ Việt Nam M ục tiêu cùa đề tài Phân lập, phân loại đánh giá đa dạng vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt - Việt Nam làm tiền đề cho việc tuyển chọn chúng nấm sán sinh hoạt chất HupA N ội dung nghiên cún đề tài T - hu thập mầu Thạch tùng cưa Đà Lạt - p hân lập cSlMuh^íiầiỉí nội sfifijlihofc mẫu’ thu thập - N ghiên cứu, định danh chúng nấm phân lập theo phương pháp truyền thống Đ - ịnh danh chủng nấm phân lập theo phương pháp sinh học phân tử Đ - ánh giá đa dạng vi nam nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt - Việt Nam 3.3.2 Kết giải trình tự vùng gen ITS1 Sản phấm khuếch đại vùng ITS I chùng nấm đọc máy giái trình tự AEI PRISM @ 3700 Genetic Analyzer Trình tự vùng đối chiếu ngân hàng dừ liệu gen NCBI với phần mem BLAST So sánh chủng đổi chiếu có trình tự tương đồng cao hàng loạt chủng khác (bảng 3.3) Bảng 3.3: Mức độ tưong đồng gen ITS1 chủng nấm so sánh vói trình tự chủng GenBank STT Tên chủng Chủng so sánh Ml.10 Rđl1.2 Tđl14 Mức độ tuong đồng (%) NR-l 11791 100 92 NR-l 36592 N A- ĩ ĩ A NT £ NR_136591 88 88 87 87 NR_137083 NR_111759 86 87 86 87 NR_ 137083 NR_111791 100 88 82 88 NR_111759 87 86 NR_ 120048 NR_ 120050 100 100 80 78 NR_ 120047 89 82 NR_120107 NR_ 120048 89 100 79 80 Mã số Tên Độ dài đoạn so sánh (%) Phyllosticta aristolochiicola BR1P 53316a Phyllosticta ardisiicola NBRC 10226) tr* ! Phyuosticta hgúiíncơtó• 102256 Phyllosticta hymenocallidicola Phyllosticta ericarum CBS 132534 Phyllosticta hymenocallidicola Phyllosticta aristolochiicola BRỈP 53316a Phyllosticta ericarum CBS 132534 Daedalea cữcularis BJFC K.Cui 8488 Megasporoporia minor BJFC Dai 12170 Daedalea radiata IFP H.S.Yuan 3629 Antrodia tropica BJFC Cui 6741 Daedalea circularis BJFC K.Cui 8488 45 Tđi.5 Lđl13 Fomitopsis sp CLF-T AB505425.1 Fomitopsis cf tneliae KYO AB540581.1 Trametes villosa isolate P4 KF850163.1 Trametes villosa isolate CIAR 60 KF850162.1 Trametes villosa isolate CIAR KF850161.1 Uncultured ectomycorrhizal AB251833.1 Trametes villosa isolate C1AR KF850161.1 Basidiomycete sp YM3ac AB267390.1 96 96 94 95 95 90 95 74 97 96 93 92 92 94 92 98 Từ số liệu bàng 3.3 cho kết : Chủng nấm M1.10 RĐL 1.2 có độ tương đồng nhó 98% so với chùng đối chiếu; chưa the khẳng định xác đến lồi chủng, chi khẳng định chúng thuộc chi Phyllosticta - Các chủng TĐL 14, TĐL 5, LĐL 13 độ tương đồng thấp so với chùng đối chiếu GenBank nên chưa khăng định thuộc chi lóp nấm Agaricomycetes thuộc ngành nấm đảm Btẩìdỉtíỳ^ề^tQ Ha Nọi - Việc định danh dựa trình tự vùng ITS cịn nhiều hạn chế lồi có tương đồng trình tự vùng rDNA - ITS Mặt khác, theo phân loại truyền thống số chủng nghiên cứu thuộc nhóm nấm bất thụ có vách, chúng thuộc lồi chưa mô tả cần thiết tiến hành thêm phương pháp có hiệu để định danh phương pháp giải trình tự thơng lượng cao (high - throughput sequencing) cần xác định vùng gen chuyên biệt vùng gen mã hóa actin, calmodulin, endochitinase, vùng Tef giúp xác việc phân biệt nhóm với hay lồi nhóm 3.4 Đánh giá đa dạng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt - Việt Nam Từ kết quà ta có bảng 3.4 tống họp đánh giá đa dạng vi nấm nội sinh phân lập từ Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt 46 Báng 3.4 cho thấy, nấm nội sinh cư trú nhiều vùng thân cùa với tỷ lệ phân lập chiếm ưu 58,72% (65 chủng) Ket sơ bộ, 109 chùng nấm phân lập thuộc ngành nấm: ngành nấm tiếp hợp (Zygomycota), ngành nấm túi (Ascomycota) ngành nấm đám (Basidiomycota) Có (3,67%) chung nấm thuộc chi Mucor (ngành Zygomycota); 23 (21,1%) chúng thuộc chi: Acremonium, Altemaria, Clasdosporium, Trìchoderma, Phialophora, Phyllosticta (ngành Ascomycota); (2,75%) chùng thuộc lớp Agaricomycetes (ngành Basidiomycota) 79 (72,48%) chủng thuộc nhóm nấm bất thụ có vách thuộc lớp nam bất tồn (Deuteromycetes), khơng đồng phân loại học với đa số đại diện thuộc ngành nấm bất thụ có vách nhóm cịn hiếu biết sinh thái, vai trò chức hệ sinh thái khác nhau, phân loại học chủng loại phát sinh Tần suất xuất chùng nấm thuộc chi/nhóm nấm chù yếu chùng phân lập từ thân Các chúng phân lập từ rễ chi có chi Acremonium (1 chủng), Phyllosticta (1 chủng) Khơng có chủng phân lập từ thuộc chi Acremonium, Phialophora Phyllosticta Thử Viện Viện Đại học Mở Hà Nội 47 Bảng 3.4: Kết quă định danh chủng nấn nội sinh phân lập từ Thạch tùng rằn cưa phân bố Đà lạt - Việt Nam Ngành nấm Chi nấm Bộ phận Rễ Thân Lá Số Tỷ lệ chủng (%) Các chủng đại diện Zygomycota Mucor 3,67 Tđl31,Tđl33,Tđl48,Lđl1 Ascomycota Acremonium 0 0,92 Rđl 3.1 Alternaria 2,75 Tđl 18, Lđl 16, Lđl18 Clasdosporium 4.59 Tđl 20, TĐL 21, Tđl 25, Tđl 36, Lđl 4.4 Trichoderma 10 9,17 Tđl Tdl 11 Tđl 40, Tđl 47, Tdl 53, TĐL 56, TDL 62, Lđl 3, Th J’ viẹ ■n Việ Đại lìQỄ MẻĩỉĩàNội Phialophora Tổng số 2 1,83 Tđl2, Tđl4 1,83 Ml 10, Rđl 1.2 1 Nam bat thụ có vách 18 45 16 Agaricomycetes 20 65 24 109 Phyllosticta Basidiomycota 79 72,48 Tđl 3, Tđl 6, Tđl 7, Tđl 8, Tđl 9, TĐL 10, TĐL 12.1, TĐL 13.1, TĐI 11.1, Tđl 11.2, Tđl 15, Tđl 16, Tđi 17, Lf)i Lđl 4, Lđl 5, Lđl 6, Lđl 8, Lđl 10, Lđl 11, Lbl 12, Rdl 1-1» Rdl 2, Rdl 3.2, Rđl Rđl 4.1, Rđl 4.2, RDL RĐL 6, RDL 7, Rđl 8, RĐL 9, RĐI 10, Roi 11, RĐL 12, RĐI 13, RĐI 14, RĐL 15 2,76 Tđl 14,Tđl5,Lđl 13 100 48 PHÀN 4: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ Kết luận Đã thu nhập 28 mẫu Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) Đà Lạt - Việt Nam Đã phân lập 109 chúng nấm nội sinh Thạch tùng cưa Trong đó, số chung nấm phân lập từ thân chiếm tỷ lệ cao 58,72%% (65 chùng), từ chiếm 22,02% (24 chúng) thấp phân lập từ rề 19,27% (20 chùng) Bằng phương pháp phân loại truyền thống phân tích trình tự rADN - ITS, 109 chủng nấm phân lập nhận dạng thuộc ngành nấm: Zygomycota, Ascomycota Basidipmypvtạ: Ọỗ.4)jhủng (3‘,67%;) thuộc chi Mucor (ngành Zygomycota); 23 chủng (21,1%) thuộc chi: Acremoniutn, Alternaria, Clasdosporium, Trichoderma, Phialophora, Phyllosticta (ngành Ascomycota); chúng (2,75%) thuộc lớp Agaricomycetes (ngành Basidiomycota) 79 chúng (72,48%) thuộc nhóm nấm bất thụ có vách thuộc lớp nấm bất tồn (Deuteromycetes) Tần suất xuất chủng nấm thuộc chi/nhóm nấm yếu chúng phân lập từ thân Kiến nghị Tiến hành nhận dạng theo phương pháp sinh học phân tứ thêm chùng thuộc nhóm nấm bất thụ có vách đe đánh giá thêm đa dạng chi/loài nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà lạt, Việt Nam Tiến hành xác định thêm vùng gen chuyên biệt vùng gen mã hóa actin, calmodulin, endochitinase, vùng Tef loài nấm phương pháp giải trình tự thơng lượng cao (high - throughput sequencing ) đế có the định 49 danh đến lồi phát loài chúng nấm chưa phân lập đến lồi Tiếp tục tìm kiếm, thu thập phân lập thêm chúng nấm nội sinh từ mẫu Thạch tùng cưa phân bố vùng khác Việt Nam (Sa Pa, Khánh Hòa ) để so sánh đa dạng sinh học vi nấm nội sinh vùng phân bố khác nhau, xác định thêm nhiều chi, loài nội sinh Thạch tùng cưa, đồng thời tiến tới xác định chủng nấm có khả sinh tổng hợp hoạt chất HupA Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Bùi Xuân Đong (1984) Nhóm nam Hyphomycetes Việt Nam, tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Khuất Hữu Thanh (2006) Kỳ thuật gcn - Nguyên lý ứng dụng Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Lại Hà Tố Hoa (2006) Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS - rDNA vùng Tef Khóa luận kỹ sư cơng nghệ sinh học Lê Thị Minh Thành (2001) Sơn thục nấm nội sinh, triển vọng ứng dụng nông nghiệp Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp Nguyền Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982) Vi nấm Nhà Xuất Khoa học Kỹ thuật Trần Họp Phùng Mý Hững “Cây thạch tùng cưa Huperzia serrata loài dược liệu quý Việt Nam” Web Sinh vật rừng Việt Nam Khóa luận “Định danh chúng Trichoderma dựa vào vùng trình tự rADN Tef ’ cùa Lại Hà Tố Hoa năm 2006 Tài liệu nước Arnold A.E, Mejia L.c, Kyllo D., Rojas E.I Maynard z., Robbins N., Herre E.A (2003) Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree PNAS USA (100), 15649-15654 Brundrett M.c and Kendrick B (1988) The mycorrhizal status, root anatomy, and phenology of plants in a sugar mappie forest Canadian “Journal ofBotamy” (66), 1153-1173 51 10 Collado J, Platas G, Gonzalez I , Pelaez F (1999) Geographical and seasonal influences on the distribution of fungal endophytes in Quercus ilex New Phytol (144), 525-532 11 Chen XY, Qi YD, Wei JH Zhang z, Wang DL, Feng JD, Gan BC (2011) Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rDNA ITS analysis World J Microbiol Biotechnol (vol 27, no 3), 495-503 12 Chen XY, Qi YD, Wei JH, Zhang z Wang DL, Feng JD, Gan BC (2011) Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rDNA ITS analysis World J Microbiol Biotechnol 27(3):495-503 13 Dobranic J.K, Johnson J.A, Alikhan Q.R (1995) Isolation of endophytic fungi from eastern larch (Larix laricina) leaves from New Brunswick, Canada Can J Microbiol (141), 194-198 hir vien viên Đai hoc Mở Hà Nôi 14 Deshmukh S.K Mishra P.D, Kulkarni-Almeida A et al (2009) Anti­ inflammatory and anticancer activity of ergoflavin isolated from an endophytic fungus Chemistry and Biodiversity (vol 6, no 5), 784-789 15 Fill T.p, Silva B F da and Rodrigues-Fo E (2010) Biosynthesis of phenylpropanoid amides by an endophyticpenicillium brasilianum found in root bark of Melia azedarach Journal of Microbiology and Biotechnology (vol 20, no 3), 622-629 16 Gunatilaka A.A.L (2006) Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence Journal of Natural Products (vol 69, no 3),509-526 (7) 17 Gallery R.A, Dalling J.w, Arnold A.e (2007) Diversity, host affinity and distribution of seed-infecting fungi: a case study with Cecropia Ecol (88), 582-588 52 18 endophytes Gary Strobel and Bryn Daisy (2003) Bioprospecting for microbial and their natural products, department of plant sciences Microbiology and molecular biology reviews 19 Gustavo Molina, Ana Paula Dionisio, Mário Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research International 20 Guy St Germain (1995), Identifying Filamentous Fungi Star Publish Company 21 Hawksworth D (2001) The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited Mycol Res (105), 1422-1432 22 Huang L.H, Feng J.Q, Zhou S.L, Hong Y.K (2009) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia Serrata Academicjournals (9), 2641-2644 23 Ju.z, Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Wang.J and Pan.s (2009) Isolation and preliminary identification of the endophytic fungi which produce Huperzine A from four species in Hupziaceae and deter - mination of Huperzine A by HPLC Fudan Univ J Med Sci (36), 445-449 24 Kenneth Cullings.w, Detlev Vogler.R (1998) A 5.8S nuclear ribosomal RNA gene sequence database: applications to ecology and evolution Molecular Ecology (7), 919-923 25 Korkina.L.G (2007) Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human health Cellular and Molecular Biology (vol 53, no.l), 15-25 53 26 Liu J.s Yu C.M Zhou Y.z, Han Y.Y , Wu F.w , Qi B.F , Zhu Y.L (1986a) Study on the chemistry of huperzine-A and huperzine-B Acta Chimica Sinica (44), 1035-1040 27 Liu J.s, Zhu Y.L , Yu C.M , Zhou Y.z Han Y.Y , Wu F.w , Qi B.F (1986b) The structures of huperzine A and B, two new alkaloids exhibiting marked anticholinesterase activity Canadian Journal of Chemistry (64), 837-839 28 Li.w , Zhou.J , Lin.z , and Hu.z (2007) Study on fermentation for production of Huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrat Chin Med Biotechnol (2), 254-259 29 Mariana Recco Pimentel, Gustavo Molina, Ana Paula Dionisio, Mario Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore (2010) Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process Biotechnology Research International 30 Ma X and Gang DR (2008) In vitro production of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease Phytochemistry (69), 2022 -2028 27 Ma X and Gang DR (2008) In vitro production of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease Phytochemistry (69), 2022 -2028 31 Ma and X.Q (1997) Chemical studies on natural resources of Huperzia and its related genera in China Chinese Academy of Sciences (D), Shanghai 32 Sahar Masumi Soheila Mirzaei , Doustmorad Zafari and Ramezan Kalvandi (2015) Isolation, identification and biodiversity of endophytic fungi from Thymus Process in Biological sciences (vol.5), 43-50 33 Sanchez Marquez s , Bills G.F, Zabalgogeazcoa I (2007) The endophytic mycobiota of the grass Dactylis glomerata Fung Divers (27), 171- 195 54 34 Shen p., Fan XR and Li GW (2000) The Experiment of Microbiology , 3rd version Beijing, China: Publishing House of High Education 35 Shi w , Luo JP Ting ZH., Wu J (2005) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia serrata Herbal Drugs (36), 281-283 36 Shi w., Luo JP., Ting ZH., Wil J (2005) Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia serrata Herbal Drugs (36), 281-283 37 Stone J.K., Polishook J.D, White J.F (2004) Endophytic fungi In: Biodiversity of fungi Inventory and monitoring methods (Mueller G.M., Bills G.F., Foster M.S., eds) Elsevier Academic Press, San Diego, USA, 241-270 38 Sardul Singh Sandhu et al (2014) Isolation and identification of endophytic fungi from Ricinus communis linn and their antibacterial activity International journal of research in pharmacy and chemistry (vol.4 - no.3), 611- 618 39 Szypula Pietrosiuk ẲÍ.1', Stichocki Pi,' OlsziKvs^a'o., Furmanowa M and Kazimieska o (2005) Somatic cmbrogenesis and in vitro culture of Huperzine selago shoots as a potential source of Huperzine A Plant Sci (168), 1443 - 1452 40 Tan R.x, Zou w.x (2001) Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites Nat Prod Rep (18), 448 - 459 41 Tang x.c, Han Y.F, Chen x.p, Zhu X.D (1986) Effects of Hupcrzine A on learning and the retrieval process of discrimination performance in rats Zhongguo Yao Li Xue Bao (7), 507-511 42 T.Taechowisan, s.lumyong (2003), Activity! of endophyte actinomycetes from roots of Zingiber oficinale and Alpinia galang against phytopathogenic fungi, Annals of Microbiology, 53 (3), pp 291 - 298 55 43 Xiaoquiang Ma, ChangHen Tan, Dayuan Zhu, David G.Rang and Xiao Peigen (2007) Huperzine A from Huperzia species - An elhnopharmacolgical review Journal of Ethnopharmacolgical 44 Yin Lu, Chuan Chen, Hong Chen, Jianfen Zhang and Weiqin Chen Isolation (2012) macrosperma and and identification investigation fungi from Actinidia bioactivities Evidence-Based of endophytic of their Complementary and Alternative Medicine (vol.2012), pages 45 Zhu.D , Wang.J Zeng.Q, Zhang.Z, Yan.z (2010) A novel endophytic Huperzine A - producing fungus, Shiraia sp Slf 14, isolated from Huperzia serrata Journal of Applied Microbiology (109), 1469 -1478 46 Zabalgogeazcoa.I (2008) Review Fungal endophytes and their interaction with plant pathogens Spanish Journal of Agricultural Research (6), 138-146 47 Zhu X.D, Tang x.c (1987) Facilitatory effects of huperzine A and B on learn- ing amd memory of spatial discrimination in mice Yao Xue Xue Bao (22), 812-817 Trang web 48 http://hcalthplus.vn/thach-tung-rang-cua-duoc-licu-quy-chua-bcnhalzheimer- d26775.html/ 49 rvnvallet.org/wpcontent/uploads/rvn2015/tom tat de tai nghien cuu-ngoc my.doc 56 PHỤ LỤC Tdl 14 Seỉỉơỉdnơe HEttDowJoi<.lASEJliKa.CSyjJ.ITS’O^l 10 20 » 40 50 w 70 s: GTGC A G A ĨCĨGACGG TTGĨTGCTGGCCGTCACCG GCAĨGTGCAC GCCCTG ATCATTAĨCCATCTCACACACCTG ĨGCA< ỉete»iw :iíst3i.cs?:_33j.iBi Fỉrữ3«^-.ii_ĩA2jiíK33.cj?2.33j.iTr.ti:^: 8Ũ M 100 110 120 130 1W 1» 140 PJ 11} IGCACACAC TG ĨAGGICGGTITGĨ GGC7GGAGĨGGGCGCIC7G TG7C7GCTTĨGGT7GTAGGCCGICCTAĨGTĨTĨAĨIACAAACTACTĨCAG Ĩ7ĨAAAGAATGT1 Ha Nọi Tdl5 OOOOTAT TCA TA TT7 TO OCTĨO TCÍATCAT TAĨCTAT r TAC T TO AATCO TAT TAT ĨAT ĩ OAC oc 770 AO OOATOT TC< 57 oriw !9N X xo X VYJ □ V1YJ V OI o X □□ 33 V V 33 X X vx X or Of oz 01 XVK'IX X X X £1 X Rđl1.2 Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội 59 ... tâm nghiên cứu khai thác ứng dụng điều trị bệnh Vi? ??t Nam Mặt khác, nghiên cứu nấm nội sinh Thạch tùng cưa Vi? ??t Nam chưa có cơng bố Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu đa dạng vi nấm nội sinh Thạch tùng. .. danh chủng nấm phân lập theo phương pháp sinh học phân tử Đ - ánh giá đa dạng vi nam nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt - Vi? ??t Nam PHÀN 1: TÓNG QUAN 1.1 Các nghiên cứu Thạch tùng cưa ( Huperzia... loạn trí nhớ Vi? ??t Nam M ục tiêu cùa đề tài Phân lập, phân loại đánh giá đa dạng vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa phân bố Đà Lạt - Vi? ??t Nam làm tiền đề cho vi? ??c tuyển chọn chúng nấm sán sinh hoạt chất