Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ex murray) trevis) thu tại lào cai và lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Thị Bích Thủy GS TS Nguyễn Đức Thành Hà Nội – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án công trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với số cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành, hội nghị nước quốc tế với đồng ý sử dụng số liệu đồng tác giả Những kết lại luận án chưa tác giả cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến GS TS Nguyễn Đức Thành TS Lê Thị Bích Thủy, phịng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn khoa học định hướng nghiên cứu cho suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học giảng dạy, cung cấp kiến thức để tơi hồn thành học phần chun đề chương trình đào tạo Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành nội dung chương trình đào tạo Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, thầy cô Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô Khoa, Phịng, Ban nơi tơi cơng tác tạo điều kiện tốt nhất, hỗ trợ giúp đỡ hồn thành nhiệm vụ chun mơn trường suốt thời gian học Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công Nghệ sinh học, tập thể cán thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên Viện Sinh học Tây Nguyên tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm Học viện Khoa học Cơng nghệ tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành hồ sơ q trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn hỗ trợ tài điều kiện làm việc khuôn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học Công nghệ: “Khai thác phát triển nguồn gen loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) Sapa Đà Lạt” Cuối cùng, với tất lòng biết ơn tơi xin gửi đến gia đình, người thân bạn bè tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập công tác chuyên môn Tôi xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu .2 Những đóng góp đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm loài Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) 1.1.1 Phân loại .5 1.1.2 Đặc điểm hình thái học Thạch tùng cưa 1.1.3 Đặc điểm sinh thái, sinh học Thạch tùng cưa 1.1.4 Đặc điểm sinh sản .10 1.1.5 Đặc điểm hóa sinh 11 1.1.6 Các nghiên cứu đa dạng di truyền loài Thạch tùng cưa 14 1.2 Huperzine A, hoạt chất Thạch tùng cưa 15 1.2.1 Các nguồn tự nhiên có chứa HupA 15 1.2.2 Thành phần, cấu tạo tính chất vật lý, hóa học HupA 18 1.2.3 Các nghiên cứu tách chiết xác định hàm lượng HupA 20 1.2.4 Vai trò HupA y học 22 1.2.5 Dược động học HupA 23 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa giới Việt Nam 25 iv 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa giới 25 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa Việt Nam .30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .31 2.1.2 Hóa chất thiết bị 32 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 33 2.1.4 Thời gian địa điểm thí nghiệm .33 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học nguồn gen loài Thạch tùng cưa 34 2.2.2 Phương pháp nhân giống Thạch tùng cưa 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Đánh giá đặc điểm sinh học nguồn gen loài Thạch tùng cưa 46 3.1.1 Đánh giá đặc điểm hình thái Thạch tùng cưa 46 3.1.2 Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng cưa .49 3.1.3 Đánh giá đặc điểm sinh thái học Thạch tùng cưa 51 3.1.4 Đánh giá mức độ đa dạng di truyền Thạch tùng cưa thị phân tử RAPD .53 3.1.5 Xác định hàm lượng HupA Thạch tùng cưa thu Lào Cai Lâm Đồng 59 3.2 Nhân giống Thạch tùng cưa 68 3.2.1 Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa giâm hom thân 68 3.2.2 Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa nuôi cấy mô .88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACh Acetylcholine Axetylcholin AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesteraza AD Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer AFLP Amplified fragment length Đa hình chiều dài đoạn polymorphism khuếch đại BA 6-benzyladenin 6-benzyladenin BuChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesteraza CTAB Cetyltrimethyl Xetyltrimethyl amoniumbromit amoniumbromide CYP Cytochrome P450 Xytochrom P450 DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleoside Deoxyribonucleosit triphosphat triphosphate EDTA Ethylene diamin tetra acetate Ethylene diamin tetra axetat HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography HupA Huperzine A Huperzin A H serrata Huperzia serrata Thạch tùng cưa IAA β-indole acetic acid Axit β-indole acetic IBA Indole-3-butyric acid Axit indole-3-butyric IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa nửa concentration Kb Kilobase Kilo bazơ LC-MS Liquid chromatography-mass Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry MS Murashige and Skoog medium Môi trường Murashige Skoog NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic vi Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza Phy Physostigmine Physostigmin RAPD Random amplified Đa hình phân đoạn DNA polymorphic DNA nhân ngẫu nhiên Rf Rentention factor Hệ số di chuyển RNase Ribonuclease Enzim ribonucleaza SD Standard deviation Độ lệch tiêu chuẩn TE Tris EDTA Tris EDTA THA Tetrahydroaminoacridine Tetrahydroaminoacridin TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng UPLC - MS Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu chromatography - mass dò khối phổ Spectrometry UPLC-PDA Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò chromatography- photodiode PDA array UPLC-Q/TOF/ Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp/ phương MS chromatography/ quadrupole pháp quang phổi khối thời gian time of flight/ mass chạy tứ cực spectrometry UV Ultra violet Tia tử ngoại vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Địa điểm lấy mẫu sử dụng nghiên cứu……………………… …32 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide 16 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu …36 Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy mô sẹo………………………………………43 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái Thạch tùng cưa thu Lâm Đồng Lào Cai…………………………………………………………… …46 Bảng 3.2 Tổng hợp kết phân tích mẫu Thạch tùng cưa với 16 mồi RAPD………………………………………………………… …55 Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền mẫu Thạch tùng cưa……….…56 Bảng 3.4 Kết xác định hàm lượng HupA từ toàn mẫu Thạch tùng cưa thu hái vào tháng (mùa thu).……… …64 Bảng 3.5 Hàm lượng HupA rễ, thân Thạch tùng cưa………….…66 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiều dài hom thân đến sinh trưởng Thạch tùng cưa Lâm Đồng Lào Cai sau tháng giâm hom………………………………………………………………69 Bảng 3.7 Ảnh hưởng loại giá thể đến sinh trưởng Thạch tùng cưa sau tháng giâm Lâm Đồng Lào Cai….…71 Bảng 3.8 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến phát triển Thạch tùng cưa sau tháng giâm hom thân Lâm Đồng……………………………………………………………… …74 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến phát triển Thạch tùng cưa sau tháng giâm hom thân Lào Cai….…76 Bảng 3.10 So sánh hiệu chất điều hòa sinh trưởng đến phát triển hom thân Thạch tùng cưa hai vùng nghiên cứu…… 78 Bảng 3.11 Ảnh hưởng độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng Thạch tùng cưa Lâm Đồng Lào Cai sau tháng……….…80 Bảng 3.12 So sánh hiệu giâm hom thân Thạch tùng cưa Lào Cai Lâm Đồng sau tháng………………………………… … 81 Bảng 3.13 Sự sinh trưởng sau tháng bón phân Lâm Đồng….…83 Bảng 3.14 Sự tăng trưởng bầu ươm thời gian khác nhau………………………………………………………………… …84 viii Bảng 3.15 Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng Thạch tùng cưa……………………………………………….… 85 Bảng 3.16 Ảnh hưởng chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng cưa sau 30 ngày nuôi cấy……………………………………………….…89 Bảng 3.17 Ảnh hưởng môi trường khống đến ni cấy chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy……………………………………91 Bảng 3.18 Ảnh hưởng BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng cưa sau 120 ngày nuôi cấy………………………………………………… …93 Bảng 3.19 Ảnh hưởng Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng cưa sau 120 ngày nuôi cấy……………………………………………94 Bảng 3.20 So sánh hiệu BA kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng cưa sau 120 ngày nuôi cấy…………………………………… …95 Bảng 3.21 Ảnh hưởng IBA đến rễ chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy…………………………………………………….…96 Bảng 3.22 Ảnh hưởng α - NAA đến rễ chồi Thạch tùng cưa sau 60 ngày nuôi cấy.………………………………………… …97 Bảng 3.23 So sánh hiệu qủa α - NAA IBA đến phát triển rễ sau 60 ngày nuôi cấy………………………………………………… …97 Bảng 3.24 Kết nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng cưa sau tháng……… 100 Bảng 3.25 Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng cưa mơi trường ¼ MS + mg/l kinetin sau tháng…………………………… .102 Sản phẩm PCR ADN genome mẫu Thạch tùng cưa với mồi OPB13 (1 băng, khơng đa hình) 3.8 Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC1 Sản phẩm PCR ADN genome mẫu Thạch tùng cưa với mồi OPC1 (5 băng, đa hình) (Chú thích tất sản phẩm RAPD-PCR: M: marker kb (Fermentas); 1-3: Mẫu DL1- DL3; - 8: Mẫu SP1 - SP5 Phụ lục Một số hình ảnh nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa Hình ảnh Thạch tùng cưa ngồi tự nhiên Hình ảnh Thạch tùng cưa thu hái Đà Lạt A B C Hình ảnh (A) bào tử (B, C) Thạch tùng cưa Cây Thạch tùng cưa tự nhiên bị cắt phần thân phía Ảnh thực địa rừng Lâm Đồng nhóm nghiên cứu C A B Đo hình thái Thạch tùng cưa ngồi tự nhiên Lào Cai (A, B) Lâm Đồng (C) Một số hình ảnh Thạch tùng cưa q trình nghiên cứu phịng thí nghiệm A B Một số hình ảnh đo đạc phịng thí nghiệm C D Một số hình ảnh đo đạc phịng thí nghiệm Một số hình ảnh đo Thạch tùng cưa Mẫu bào tử thu Lào Cai đưa vào khử trùng Một số hình ảnh nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa hình thức giâm hom thân Hom thân Thạch tùng cưa lựa chọn thí nghiệm ảnh hưởng chiều cao hom thân đến sinh trưởng Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng α-NAA nồng độ cao Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng IBA Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng α - NAA nồng độ thấp Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng IAA nồng độ thấp Giâm hom thân Thạch tùng cưa Lào Cai (hom thân dài cm, sử dụng chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm giá thể CT2, độ sâu hom thân giâm xuống đất 3,5 cm) Giâm hom thân Thạch tùng cưa Lâm Đồng (hom thân dài cm, sử dụng chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm giá thể CT2, độ sâu hom thân giâm xuống đất 3,5 cm) Một số hom thân giâm Thạch tùng cưa thử nghiệm xuất vườn ươm sau tháng giâm hom thân Lâm Đồng Vườn ươm Thạch tùng cưa Lâm Đồng Vườn ươm Thạch tùng cưa Lào Cai Một số hình ảnh nghiên cứu nhân giống Thạch tùng cưa hình thức ni cấy mơ Hình ảnh Thạch tùng cưa bắt đầu nuôi cấy mô Hình ảnh Thạch tùng cưa tạo đa chồi A B Mô sẹo chuyển từ mầu trắng đục sang màu xanh xám xuất đa chồi Hình ảnh đa chồi Thạch tùng cưa nuôi cấy mô năm 2020 Cây Thạch tùng cưa nuôi cấy mô năm 2020 C Phụ lục Một số hình ảnh TLC HPLC Hình ảnh chạy sắc kí mỏng Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng cưa thu SP1A HupA chuẩn, Mẫu mùa xuân, Mẫu mùa thu Đường chuẩn định lượng HupA Một số hình ảnh sắc kí đồ định lượng HupA từ mẫu Thạch tùng cưa từ điểm lấy mẫu Lào Cai Lâm Đồng A Sắc kí đồ định lượng HupA từ mẫu Thạch tùng cưa từ điểm lấy mẫu vò mùa thu Ghi chú: A: Mẫu chất chuẩn, B - F: Mẫu SP1A - Mẫu SP5A, G - I: Mẫu DL1A- Mẫu DL3A Sắc ký đồ định lượng HupA Thạch tùng cưa DL3A năm 2016 A Mẫu thu hái vào mùa thu, B Mẫu thu hái vào mùa xuân A HupA B HupA C HupA D HupA Sắc ký đồ định lượng HupA Thạch tùng cưa Lào Cai năm 2017 A Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A HupA A B HupA C HupA D HupA Sắc ký đồ định lượng HupA Thạch tùng cưa Lào Cai năm 2016 A Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A