Đang tải... (xem toàn văn)
HỒ CHÍ MINH--- Ốpaâtì ^Ké*---Tên đề tài:KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN Catharanthusroseus L.. 39
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH - Ốpaâtì ^Ké* -
Tên đề tài:
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN (Catharanthus
roseus (L.) G Don) VÃ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betỉe L.)
KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH -SINH HỌC PHÂN TỦ
GVHD: ThS.NguyễnVăn MinhGVDHD: ThS. Dương Nhật LinhSVTH: HồQúi Đăng
MSSV:1253012080Niên khoá:2012 - 2016
TP Hồ ChíMinh, tháng 5 năm 2016
Trang 2BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
roseus (L.) G Don) VÀ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betle L.)
KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ
GVHD: ThS Nguyễn Văn Minh GVDHD: ThS Dương Nhật Linh SVTH: Hồ Qúi Đăng
MSSV: 1253012080 Niên khoá: 2012 - 2016
TP Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016
Trang 3Bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị và các bạn Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Mở - thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức trong thời gian thực tập tại trường làm cơ sở để em
thực hiện đề tài nghiên cứu Thầy Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh, đã tận tình
hướng dẫn, truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành đề tài trong suốt thời gian thực hiện Cảm ơn chị Trần Thị Á Ni đã luôn giúp đỡ, động viên em những lúc khó khăn nhất Cảm ơn các bạn, các em sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Các bạn lớp DH12SH02, các bạn lớp DH12VS01 đã quan tâm và chia sẻ cùng tôi quãng đời sinh viên nhiều kỉ niệm đẹp và đáng nhớ Cuối cùng, con xin
cảm ơn Ba Mẹ, cảm ơn gia đình, người thân và các anh chị luôn chăm lo, ủng hộ, tin
tưởng, khích lệ con những lúc khó khăn và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để con được yên tâm học hành, nghiên cứu Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến các Thầy Cô khoa CNSH, chúc các Thầy Cô gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống và trên con đường giảng dạy
Xin chân thành cảm ơn !
Bình Dương, ngày … tháng … năm 2016
Hồ Qúi Đăng Tháng 5 năm 2016
Trang 41.1.1 Khái quát về cây Trầu Không (Piper betle L.) 5
1.1.2 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của Trầu Không (Piper betle L.) 7
1.1.3 Khái quát về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) 8
1.1.4 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) 10
1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 10
1.2.1 Vi sinh vật nội sinh 10
1.2.2 Vi khuẩn nội sinh 10
1.3 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 11
1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter spp 11
1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 12
1.3.3Vi khuẩn Klebsiella spp 13
Trang 51.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU 15
1.4.1 Các loại cao dược liệu 16
1.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet 16
1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 18
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18
1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19
PHẦN 2: 20
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1 VẬT LIỆU 21
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường 21
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
Trang 62.2.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây
bệnh 29
2.2.8 Định danh vi khuẩn nội sinh bằng test sinh hóa 31
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1 Kết quả tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh từ bộ chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn và lá Trầu Không đã phân lập trước đó 38
3.1.1 Kết quả tái phân lập vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không 38
3.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn 39
3.2 Kết quả thử nghiệm đối kháng của các chủng vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase với các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu 43
3.3 Kết quả thử nghiệm đối kháng các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase của dịch lọc các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu 46
3.4 Kết quả định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn cao nhất của vi khuẩn nội sinh cây dược liệu 50
3.5 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không và rễ dừa Cạn 52
3.5.1 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá Trầu Không 52
3.5.2 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết rễ cây Dừa Cạn 54
3.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn gây bệnh 55 3.7 THẢO LUẬN 56
Trang 8DANH MỤC VIẾT TẮT
CDC Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Mĩ
CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc
CLSI Viện tiêu chuẩn lâm sang và thí nghiệm
Cs Cộng sự
E coli Escherichia coli
ESBL Men beta-lactamase phổ rộng
Gram (-) Gram âm
Gram (+) Gram dương NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
MHB Mueller-Hinton Broth
MHA Mueller-Hinton Agar
TSA Trypticase Soy Agar
WHO Tổ chức y tế thế giới
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet 18 Bảng 2.1: Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh của chất thử (MIC) 30 Bảng 3.1: Bảng kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không 38 Bảng 3.2: Bảng kết quả kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn nội sinh từ cây Dừa Cạn 41 Bảng 3.3: Bảng kết quả đối kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của vi khuẩn nội sinh 44 Bảng 3.4: Bảng kết quả đối kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của dịch lọc vi khuẩn nội sinh 47 Bảng 3.5: Kết quả định danh sinh hóa chủng nội sinh 51 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết lá Trầu Không 52 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh của cao chiết rễ cây Dừa Cạn 54 Bảng 3.8: kết quả nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trầu Không kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh (μg/ mL) 55
Trang 10DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây Trầu Không (Piper betle L.) 5
Hình 1.3: Cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) 8
Hình 2.1: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn 26
Hình 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn trên môi trường TSA 39
Hình 3.2: Kết quả làm thuần vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn 40
Hình 3.3: Kết quả quan sát đại thể và vi thể của vi khuẩn TBD1 nội sinh cây Dừa Cạn 40
Hình 3.4: TK8 kháng E coli : 49e 45
Hình 3.5: Kết quả vòng kháng vi khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội sinh đối với vi khuẩn thử nghiệm 49
Hình 3.6: Kết quả nhuộm gram của chủng RBD11, RBD14 50
Hình 3.7: Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không 53
Hình 3.8: Kết quả khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây Dừa Cạn 54
Hình 3.9: kết quả MIC của mẫu cao chiết từ lá trầu không với vi khuẩn gây bệnh 86p 55
Trang 11DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Quy trình thí nghiệm 22 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn 23 Sơ đồ 2.3: Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu 27 Biểu đồ 3.1: So sánh khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh cây dược liệu 48 Biểu đồ 3.2: Kết quả kháng khuẩn của cao chiết từ lá Trầu Không 53
Trang 12ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay việc sử dụng các bài thuốc từ thực vật để chữa bệnh ngày càng phổ biến Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có những tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hóa sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới (Võ Thị Mai Hương, 2009) Bên cạnh đó, một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi khuẩn nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008) Với những công dụng to lớn của các cây dược liệu, để tận dụng và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, nhằm đem đến nhiều lựa chọn hơn cho vấn đề sức khỏe của con người và động vật
Thời gian gần đây, thế giới đang rất lo ngại trước sự gia tăngkhông ngừng của hiện tượng đề kháng kháng sinh của nhiều loài vi khuẩn Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này; như sử dụng thuốc kháng sinh một cách bừa bãi, không đúng cách, không sử dụng đúng liều lượng và thời gian trị liệu Các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày càng nhiều, trong môi trường bệnh viện và cộng đồng (Conly J., 2002)
Vì vậy, hướng đi mới trong điều chế thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nội sinh thực vật có tác dụng tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn ngày càng được quan tâm
Ở Việt Nam, Trầu Không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trầu Không có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009) Một số bệnh viện nước ta dùng cao nước Trầu Không thí nghiệm điều trị bệnh viêm cận răng (paradentose)
Trang 13có hiệu quả (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Trầu Không có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Như trong nghiên cứu của Nalina T và Rahim Z H A đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên
vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans (Nalina T và
cs., 2006; Nalina T và cs., 2007)
Theo Đông y, Dừa Cạn có tác dụng làm săn, chống viêm, hạ áp, được sử dụng để điều trị một số bệnh: viêm đại tràng, khí hư bạch đới, tăng huyết áp, viêm nhiễm phần phụ, kinh bế, zona, phong ngứa, đái tháo đường, vàng da Ngoài ra, người ta thường dùng Dừa Cạn là thuốc kìm tế bào và được chỉ dẫn trong điều trị bệnh Hodgkin Trong dân gian, người ta dùng lá giã nát đắp lên những vết bỏng làm mát da thịt, giảm đau, chống bội nhiễm (Thanh Ngọc, 2014)
Việc nghiên cứu các nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu có khả năng kháng lại với một số vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase là rất cần thiết nhằm tìm ra những loại hợp chất sinh học mới trong tương lai, hỗ trợ thiết thực cho việc điều trị nhiễm trùng
Vì vậy, nhằm phát huy và phát triển nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước, kết hợp
giữa y học cổ truyền và y học hiện đại tôi tiến hành đề tài: “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN (Catharanthus roseus
(L.) G Don) VÀ LÁ TRẦU KHÔNG (Piper betle L.)”
Mục tiêu: Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi khuẩn kháng thuốc sinh Carbapenemase vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.)”
Nội dung nghiên cứu:
- Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh từ cây Dừa Cạn và lá Trầu Không
- Xác định khả năng đối kháng và hoạt tính kháng khuẩn một số vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase của vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn và lá Trầu Không
- Định danh vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao
Trang 14- Chiết xuất cao dược liệu từ cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.)”
- Xác định nồng độ thấp nhất (MIC) của chiết xuất cao dược liệu từ cây Dừa Cạn và lá Trầu Không ức chế sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc sinh carbapenemase trong môi trường nuôi cấy
Trang 15PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trang 161.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT
1.1.1 Khái quát về cây Trầu Không (Piper betle L.)
1.1.1.1 Phân loại thực vật Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnoliophyta
Lớp (class) : Magnoliopsida
Bộ (ordo) : Piperales Họ (familia) : Piperaceae Chi (genus) : Piper
Loài (species): P betle (Pradhan L D., 2013)
Hình 1.1: Cây Trầu Không (Piper betle L.)
1.1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây Trầu Không hay Trầu, Thược Tương, Hruề Êhang (Buôn Mê Thuột) có tên
khoa học là Piper betle L (Piper siriboa L.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) Là một loại
cây mọc leo, thân nhẵn, lá mọc so le, cuống có bẹ, dài 1,5 – 3,5 cm; phiến lá hình trái xoan, dài 10 – 13 cm; rộng 4,5 – 9 cm; phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc),
Trang 17đầu lá nhọn, khi soi lên thấy nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường 5; hoa khác
gốc mọc thành bông, quả mọng không có vòi sót lại
Hình 1.2: Đặc điểm cây Trầu Không (Piper betle L.)
1.1.1.3 Nguồn gốc
Trầu Không có nguồn gốc ở miền trung và đông Malaysia, được trồng từ 2500 năm trước, sau đó lan sang Madagasca và Đông Phi Ở Trung Quốc, Trầu không được ghi chép từ đời nhà Tần năm 618 – 907 sau công nguyên Đầu thế kỷ XV, cây bắt đầu được đưa sang Châu Âu Ngày nay Trầu Không được trồng phổ biến ở khắp các nước nhiệt đới vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Srilanka, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, Philipine, Việt Nam, Trung Quốc,… (Đỗ Huy Bích và cs., 2003)
Năm 1999, Theo Kumar, Trầu Không trong tự nhiên có ở trung và đông Malaysia, đã được đưa vào trồng hơn trong suốt 2500 trước ở Châu Á Ngoài ra còn được tìm thấy ở Madagasca và phía đông Châu Phi nhiều năm sau đó và cũng đã được đưa đến phía tây Ấn Độ Với dược tính được biết thì loài cây này được sử dụng rộng rãi tại Ấn Độ, Indonesia và nhiều quốc gia như Malaysia, Việt Nam, Lào, Camphuchia, Thái Lan, Myanmar, Singapore (Kumar N., 1999)
Trang 181.1.2 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của Trầu Không (Piper betle L.)
Trầu Không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh, phế tỳ, vị, có tác dụng trừ phong thấp, chứng lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng Y học dân gian nhiều nước có kinh nghiệm dùng nước sắc lá trầu để rửa vết thương và những chỗ lở loét ngoài da, mẫn ngứa, viêm mạch hạch huyết Ở Indonesia, dân gian dùng trầu làm thuốc kháng sinh, kháng khuẩn, diệt nấm
Ở Việt Nam, Trầu Không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi, đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sâu kiến đốt, viêm quanh răng, viêm tai, viêm họng Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Trầu Không có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009) Một số bệnh viện nước ta dùng cao nước Trầu Không thí nghiệm điều trị bệnh viêm cận răng (paradentose) có hiệu quả (Đỗ Tất Lợi, 2004) Trong Trầu Không có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Như trong nghiên cứu của Nalina T và Rahim Z H A đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên vi khuẩn gây sâu
răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans (Nalina T và cs., 2006; Nalina T và cs., 2007) Cao lá và tinh dầu Trầu Không có hoạt tính ức chế in vitro các chủng vi khuẩn: tụ cầu vàng, phế cầu, Staphylococcus albus, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, liên cầu tan máu, E coli, S typhi, phẩy khuẩn tả, Shigella flexneri, Shigella shigae, Proteus vulgaris, Sarcina lutea và Erwinia carotovona, các chủng nấm: C albicans, Candida stellatoides, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum và Rhizopus cans Nước cất lá có tác dụng ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với nồng độ ức
chế thấp nhất 1 : 5000 (Panuwat Suppakul và cs., 2006)
Trang 191.1.3 Khái quát về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)
1.1.3.1 Giới thiệu về cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Tên khoa học: Catharanthus roseus L., Vinca rosea L., Lochnera rosea Reich Tên thường gọi: Bông Dừa, Dừa Cạn, Hoa Hải Đằng, Trường Xuân, Dương Giác
1.1.3.2 Vị trí phân loại cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Giới : Plantae
Ngành : MagnoliophytaLớp : Magnoliopsida Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Chi : Catharanthus
Loài : Catharanthus roceus L (Đỗ Tất Lợi, 2004)
Hình 1.3: Cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)
Tiếng Anh từ Catharanthus nghĩa là “pure flower”: hoa tinh khiết, hoa tinh khôi và roceus có nghĩa là “rose coloured flower”: hoa có màu sắc hồng (Nguyễn Hoàng Lộc, 1999)
Trang 201.1.3.3 Đặc điểm thực vật
Cây Dừa Cạn là cây thân thảo sống lâu năm, mọc đứng, phân nhiều cành, cây cao 0,4 – 0,8 m Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lông trắng, thân non màu xanh lục nhạt, chuyển dần sang màu hồng tím theo thời gian phát triển của cây Bộ rễ rất phát triển, thân gỗ phía gốc và phần trên mềm Cây mọc thành bụi dày, có cành đứng Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông Cuống lá ngắn dài 3-5 mm Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên Rễ thường chỉ có một rễ chính và nhiều rễ phụ Rễ chính đâm thẳng xuống đất, có thể đạt chiều dài 30-40 cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa, ngắn, phát triển theo chiều ngang Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp Hoa có màu tím (Đỗ Tất Lợi, 1991; Đào Hùng Cường, 2011)
1.1.3.4 Nguồn gốc
Chi Dừa Cạn Catharanthus rosesus có nguồn gốc từ đảo Madagasca Châu Phi
Nhưng nó đã mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới như Ấn Ðộ, Indonesia, Philippine, châu Phi, châu Úc, Braxin Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây được trồng quanh năm, những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh Cây Dừa Cạn là loài cây chịu được các điều kiện khô hạn và thiếu chất dinh dưỡng, nó khá phổ biến trong các khu vườn cận nhiệt đới (Huxley A., 1992).
Tại Việt Nam, Dừa Cạn là cây hoang dại, có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển Dừa Cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên -Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, …( Đỗ Tất Lợi, 1991) Trước đây, Dừa Cạn chỉ được trồng làm cảnh, nhưng gần đây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá và rễ để chế thuốc
Trang 211.1.4 Công dụng trong y học và hoạt tính sinh học của cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)
Theo Đông y, Dừa Cạn có tác dụng làm săn, chống viêm, hạ áp, được sử dụng để điều trị một số bệnh: viêm đại tràng, khí hư bạch đới, tăng huyết áp, viêm nhiễm phần phụ, kinh bế, zona, phong ngứa, đái tháo đường, vàng da Ngoài ra, người ta thường dùng Dừa Cạn là thuốc kìm tế bào và được chỉ dẫn trong điều trị bệnh Hodgkin Trong dân gian, người ta dùng lá giã nát đắp lên những vết bỏng làm mát da thịt, giảm đau, chống bội nhiễm (Thanh Ngọc, 2014)
1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH
1.2.1 Vi sinh vật nội sinh
Vi sinh vật nội sinh là những những vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô thực vật khỏe mạnh, không gây ra các tác động tiêu cực đến kí chủ (Sturz và cs., 2000; Wellington và Marcela, 2004) Để tự bảo vệ mình trước những tác động của môi trường, vi khuẩn nội sinh thực vật tạo thành những ổ vi khuẩn, xâm chiếm và nội sinh trên đốt cây Những vi khuẩn này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs., 2005) Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật sống trên Trái đất, giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh,… ( Strobel và cs., 2003) 1.2.2 Vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học (He và cs., 2009) Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh như một chất "kích hoạt sinh học" (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs., 2006; Strobel và Daisy, 2003) Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các chất chuyển hóa thứ cấp tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp Vi khuẩn
Trang 22nội sinh có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới Một số nghiên cứu tìm thấy thuốc kháng sinh mới, các hợp chất ức chế miễn dịch và các hợp chất chống ung thư sau khi phân lập, làm thuần và khảo sát hoạt tính đặc tính của một số vi sinh vật nội sinh trong thời gian qua (Schutz, 2001) Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi khuẩn nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel, 1993)
1.3 GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU
1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter spp
– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
Acinetobacter spp được phân loại như sau (Dworkin M., 2006):
Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Moraxellaceae Chi: Acinetobacter
– Hình thái
Acinetobacter spp là những vi khuẩn Gram (-), đa hình, rất dễ nhầm giống
Neisseria Trên phết nhuộm Gram trực tiếp từ các bệnh phẩm, Acinetobacter spp là
những song cầu nhỏ
Khả năng gây bệnh
Vi khuẩn Acinetobacter spp có thể gây nhiễm khuẩn bệnh viện với những bệnh
nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết có khuynh hướng ngày càng gia tăng (Nguyễn Thanh Bảo, 2011)
Trang 23– Tình hình đề kháng kháng sinh :
Ở Mĩ, dữ liệu nhiễm khuẩn bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter đa
kháng thuốc và không nhạy với carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong năm 2008 (WHO, 2011)
Ở Việt Nam, trong những nghiên cứu gần đây cho thấy, tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh, các vi khuẩn Gram (-) là căn nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% trong năm 2000-2001 lên đến 42% trong năm 2009 (GARP - VN, 2010)
1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli (E coli)
– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
Escherichia coli được phân loại như sau (Dworkin M., 2006):
Trực khuẩn Gram (-), dài hay ngắn tùy thuộc môi trường nuôi cấy Một số di
động, một số lại bất động Một số có nang Vi khuẩn không sinh bào tử E coli có kích
thước trung bình 2 – 3 µm x 0,5 µm
Trang 24– Khả năng gây bệnh
Viêm màng não: E coli chiếm khoảng 40 % trường hợp gây viêm màng não ở trẻ
sơ sinh, 75 % trong số đó có kháng nguyên K1 (Nguyễn Thanh Bảo, 2011) – Tình hình đề kháng kháng sinh
Theo một báo cáo tổng kết về tình hình đề kháng kháng sinh ghi nhận từ 15 bệnh
viện của GARP – VN cho thấy tỷ lệ E coli kháng với cephalosporin thế hệ 3 khá cao và
có tỷ lệ kháng cao với cotrimoxazole dao động từ 60 %– 80 % tại hầu hết các bệnh viện
Tuy nhiên, tỷ lệ E coli kháng với carbapenems thấp hơn 2 % (GARP – VN, 2010)
1.3.3 Vi khuẩn Klebsiella spp
Klebsiella spp là vi khuẩn thường trú ở đường ruột, chúng có mặt khắp nơi trong
tự nhiên như ở đất, nước, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao, các sản phẩm thực vật Ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương (Podschun và cs, 1998; Dworkin M., 2006)
– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
Klebsiella được phân loại như sau (Buchanan R E và Gibbons N E., 1994; Dworkin M., 2006):
Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Klebsiella
Trong chi Klebsiella, K pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và
là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây (Podschun và cs, 1998)
Trang 25– Hình thái
Klebsiella spp là trực khuẩn Gram (-), không di động, có vỏ polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ (Podschun và cs, 1998)
Klebsiella spp có kích thước 0,3-1,5 µm × 0,6-6,0 µm, hình que, thường đứng
thành từng đôi, không sinh bào tử (Buchanan R E và Gibbons N E., 1994) – Khả năng gây bệnh
Klebsiella spp có thể gây tổn thương ở hầu hết các cơ quan của cơ thể như: viêm
xoang, viêm họng, viêm màng não, viêm phúc mạc, đáng chú ý là trẻ con có thể bị viêm
ruột do loài vi khuẩn này Tuy nhiên, nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella tăng cao chủ
yếu do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý nên làm gia tăng những chủng kháng thuốc (Podschun và cs, 1998; Dworkin M., 2006)
– Tình hình đề kháng kháng sinh
Tính đề kháng kháng sinh của các loài Klebsiella rất cao Tất cả đã đề kháng với ampicillin do sự có mặt của gen mã hóa sản xuất β - lactamase đặc hiệu cho penicillin
Carbapenem (imipenem, ertapenem, meropenem, doripenem) được coi là kháng sinh có
tác dụng nhất trong việc điều trị các ca nhiễm ESBL Tuy nhiên, “siêu vi khuẩn” K pneumoniae có khả năng kháng carbapenem với một số cơ chế khác nhau đang bùng phát
và trở thành mối nguy cho sức khỏe cộng đồng (Podschun và cs, 1998)
1.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa thường được thấy hiện diện trong đường tiêu hóa với số
lượng ít và một số nơi ẩm ướt trên cơ thể của người như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thường xuất hiện trong môi trường ẩm thấp ở bệnh viện và là một tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng cơ hội (Dworkin M và cs, 2006; Jawetz E và cs, 1989)
– Phân loại theo khóa phân loại quốc tế
P aeruginosa được phân loại như sau (Buchanan R E và Gibbons N E., 1994): Giới: Bacteria
Trang 26Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas
Loài: Pseudomonas aeruginosa
– Hình thái
P aeruginosa là trực khuẩn Gram (-) thẳng hoặc hơi cong, không có bào tử, có
kích thước 0,6 × 2 µm, có khả năng di động nhờ đơn mao ở một đầu (Dworkin M và cs, 2006; Jawetz E và cs, 1989)
– Khả năng gây bệnh
Nguồn lây vi khuẩn P.aeruginosa cho người là môi trường ẩm thấp ở bệnh viện
Người mang mầm bệnh tiềm ẩn là nguồn lây quan trọng từ người này sang người khác (Luvsansharav U O., 2011; MacKenzie F.M., 1997)
– Tình hình đề kháng kháng sinh
Tỉ lệ P aeruginosa gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng dần trong những năm
gần đây trên thế giới và cả Việt Nam Theo một công bố mới nhất của CDC ước tính rằng ở Hoa Kì, hơn hai triệu người bị bệnh mỗi năm với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng
sinh thì có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa có hơn 6000 (13%) là
đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (CDC, 2014)
1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU
Theo dược điển Việt Nam IV năm 2009, cao dược liệu là chế phẩm được chế bằng cách cô đặc hoặc sấy đến thể chất qui định các dịch chiết thu được từ cao dược liệu thực vật hay động vật với dung môi thích hợp Các dược liệu khi chiết xuất được sử lý sơ bộ (sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp)
Trang 271.4.1 Các loại cao dược liệu
Cao lỏng: là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong đó có cồn và nước đóng vai trò dung môi chính Nếu không có chỉ dẫn khác, qui ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để điều chế
Cao đặc: là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi còn lại trong cao không quá 20%
Cao khô: là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%
Có nhiều phương pháp để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây thuốc Các kỹ thuật đề xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng Trong thực nghiệm, việc chiết rắn – lỏng được áp dụng nhiều hơn, chiết rắn – lỏng gồm: ngấm kiệt (percolation), ngâm dầm (maceration), chiết với máy Soxhlet,… chiết bằng cách nấu nguyên liệu cây với nước còn được gọi là nước sắc Ngoài ra còn có chiết với phương pháp lôi cuống bằng hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluidmethod),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; Từ Minh Koóng, 2007) 1.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet
Bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong túi vải trắng hay giấy lọc dày rồi cho vào trụ chiết (đặc vài viên bi thủy tinh dưới đáy để tránh làm nghẹt ống thông nhau), không được để lượng bột cây cao hơn mức thông nhau của trụ chiết
Rót dung môi vào bình cầu cho thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu (không được để lượng thể tích trong bình cầu nhiều hơn hai phần ba thể tích hình cầu)
Kiểm tra hệ thống kín Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt dung môi và thử lên mặt kiếng, nếu thấy không có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt Sau khi hoàn tất lấy dung môi ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi thu được cao chiết
Trang 28Đối với dung môi chiết 100 ml, chiết liên tục 10 g bột dược liệu ở 60 - 80℃ trong 3 h, dịch chiết đem sấy khô 40℃, ly tâm 5000 vòng/ 10 phút, lọc với giấy lọc, cô quay cho bay hơi dung môi
Trang 29Bảng 1.1: Ưu và nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet
- Tiết kiệm dung môi, không tốn công lọc và châm thêm dung môi
- Dung môi chiết nóng dễ hòa tan - Chiết kiệt hợp chất do dung môi
luôn đổi mới
- Kích thước trụ làm giới hạn khối lượng chiết
- Chất chiết trong bình bị đun nóng lâu dễ phân hủy
- Thiết bị phức tạp khó sản xuất qui mô lớn
1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI
1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trầu Không có các tác động dược lý khác nhau như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm,…(Singh và cs., 2009) Nó cũng hoạt động như một chất kích thích, làm tươi mát hơi thở, thuốc tống hơi, thuốc bổ tim, thuốc giảm đau trong đau khớp, chất sát khuẩn, kích thích tiêu hóa và tuyến tụy sản xuất lipase (Prabhu và cs., 1995), sử dụng như một tác nhân kháng nấm đặc biệt để điều trị nhiễm trùng tại chỗ, cũng như
dùng trong nước súc miệng chống lại nhiễm trùng Candida miệng (Intzar Ali và cs.,
2010) Trong nghiên cứu của Nalina T và Rahim Z H A đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia lên vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người
là Streptococcus mutans (Nalina T và cs., 2006; Nalina T và cs., 2007) kết quả là dịch
chiết thô ức chế hoạt động của enzym glucosyltransferase (GTF), đó là enzym cần thiết
để tổng hợp glucan của các vi khuẩn Streptococcus mutans Trong khi các loài thực vật
đã được nghiên cứu như là nguồn chất có hoạt tính sinh học thì các vi sinh vật nội sinh cư trú trong các mô giữa tế bào cây sống chưa được nghiên cứu rộng rãi (Strobel G., 2004) Chúng đại diện cho một nguồn hóa chất mới phong phú có khả năng khai thác trong một loạt các lĩnh vực y tế, nông nghiệp và công nghiệp (Strobel G., 2003)
Một vài công trình có thể kể đến như: năm 2014, Maria Bintang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn nội sinh BS1 từ lá Trầu Không có khả năng chống lại một
Trang 30số vi khuẩn gây bệnh như: E coli, Bacillus cereus và S aureus, kết quả sự ức chế lớn nhất đối với S aureus và phân tích trình tự 16S rRNA cho thấy chủng vi khuẩn BS1 tương đồng 98 % với Pseudomonas sp (Maria Bintang và cs., 2014)
Rajendran Srinivasan và cs (2012) đã tiến hành chiết xuất cao chiết từ gỗ cây Tô Mộc bằng hệ thống Soxhlet và thử nghiệm cho kết quả đường kính vòng kháng khuẩn đối
với S.aureus là 28,00 ± 2,30 mm, S.typhi là 20,00 ± 1,30 mm, E.coli là 9,00 ± 0,7
mm,…
1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về Trầu Không như: Nghiên cứu về tinh dầu
và cao chiết từ lá Trầu Không Việt Nam (Piper betle L – họ Piperaceae) có tác động kháng Candida spp (Nguyễn Đinh Nga và Nguyễn Văn Thanh, 2010), nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu, Nguyễn Thành Văn (2011) cho thấy dịch chiết lá Trầu Không (Piper betle) còn có khả năng kháng khuẩn như Edwardsiella tarda, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (Huỳnh Kim Diệu, Nguyễn Thành Văn, 2011) Trầu Không có tác dụng kháng Entamoeba histolytica phân lập từ bệnh phẩm Tinh dầu diệt động vật nguyên sinh Paramaecium caudatum với độ pha loãng đến 1 : 10000, diệt nấm mạnh đối với 24 chủng T rubrum, 3 chủng T mentagrophytes, 3 chủng Trichophyton tosurans, 1 chủng Trichophyton verrucosum, 4 chủng M canis, 2 chủng M gypseum và 2 chủng Epidermophyton floccosum (Đỗ Huy Bích và cs., 2003)
Hiện nay có sản phẩm từ lá Trầu Không được sản xuất như chế phẩm sinh học Bokashi – trầu, do tiến sĩ Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế nghiên cứu và vừa được đưa vào sản xuất Chế phẩm có khả năng
phòng trị một số bệnh cho động vật thủy sản, ức chế và tiêu diệt 2 loài vi khuẩn Vibrio parahaemoliticus và Aeromonas hydrophyla, đây là hai loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến
trên thủy sản nước ngọt và nước lợ, chế phẩm an toàn sinh học và thân thiện với môi trường (Nguyễn Quang Linh và cs., 2010) Tuy nhiên vẫn chưa có công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh cây Trầu Không được công bố trong nước
Trang 31PHẦN 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 322.1 VẬT LIỆU
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ ngày 19 tháng 10 năm 2015 đến ngày 16 tháng 05 năm 2016 tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở – Tp Hồ Chí Minh
2.1.2 Đối tượng nghiên cứu
10 chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không do phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh cung cấp 9 mẫu cây Dừa Cạn được thu nhận ở tỉnh Bình Dương 3 mẫu lá cây Trầu Không và 3 mẫu rễ cây Dừa Cạn (thực hiện cao chiết dược liệu) được thu nhận ở tỉnh Bình Dương
Chủng vi khuẩnkháng thuốc sinh carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường
Thuốc nhuộm: tím kết tinh (Crystal Violet), Lugol, Safranin O
Môi trường: NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), TSA (Trypticase Soya Agar), MHA (Muller Hinton Agar)
Trang 33Lá Trầu Không và rễ cây Dừa Cạn khỏe mạnh
Thuốc thử: Catalase (H2O2 5%), Tricloroacetic acid (TCA), Gress A, Gress B, Methyl Red, Phenol Red, ∝ - naphtop,…
Dung môi để chiết cao: Chloroform (CHCl3)
Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO)
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Bố trí thí nghiệm
Dựa theo mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Sơ đồ 2.1: Quy trình thí nghiệm
Quan sát đại thể, vi thể Phơi khô và xay thành bột dược
liệu
Làm thuần Chiết xuất với dung môi
Chloroform
Cô thành cao dược liệu
Thử nghệm hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase
Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết với vi khuẩn
Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không và cây Dừa Cạn trên môi trường TSA
Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh
Trang 342.2.2 Tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ bộ chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) và lá Trầu Không (Piper betle L.) đã phân lập
trước đó
❖ Tái phân lập Bố trí thí nghiệm:
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn
Chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không
Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh trên môi trường TSA
Làm thuần
Quan sát đại thể, vi thể
Trang 35Tái kiểm tra: Bước đầu nhận dạng các loại vi khuẩn khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn, đánh giá khả năng sinh trưởng và mô tả đặc điểm của từng chủng vi khuẩn nội sinh mọc lên từ các mẫu phân lập trên môi trường TSA Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc
Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần
Bước 2: Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 – 2 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 3: Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 4: Tẩy màu bằng cồn 96°, khoảng 15 – 30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô
Bước 5: Nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 6: Quan sát bằng vật kính dầu 100X Kết quả: vi khuẩn G (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn G (-) bắt màu hồng safranin
Trang 36Chú ý: trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô tiêu bản Trả lời tiêu bản nhuộm gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, ách bắt màu của vi khuẩn
2.2.3 Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase với các chủng vi khuẩn nội sinh cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán (Ingroff và cs., 1995; Kumar A và cs., 2009)
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm :
– Môi trường NB thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121℃ trong 20 phút – NA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml – MHA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml • Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm:
– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃
– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày
– Tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase
– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha loãng đưa về nồng đồ 106 CFU/ ml – Tiến hành thí nghiệm
– Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA
– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng – Dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl
Trang 37– Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch – Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vòng kháng
• Đọc kết quả: vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vòng – mm)
Hình 2.1: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn
2.2.4 Thử nghiệm đối kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase của dịch lọc các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán
• Chuẩn bị môi trường thử nghiệm :
– Môi trường NB thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121℃ trong 20 phút – NA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml – MHA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml • Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm:
– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃
– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày
Trang 38– Tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn
– Lọc dịch vi khuẩn qua màng lọc 0,2 μm thu dịch lọc • Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase
– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha loãng đưa về nồng đồ 106 CFU/ ml – Tiến hành thí nghiệm
– Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA
– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng – Dịch lọc vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl – Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
– Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vòng kháng
• Đọc kết quả: dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vòng – mm)
2.2.5 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá Trầu Không (Piper betle L.) và rễ
Dừa Cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)
Dung môi trích ly: Chloroform (CHCl3) vì dung môi có khả năng chiết nhiều hợp chất và giá thành hợp lý
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:8; nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 3 giờ (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Trang 39giấy lọc Dịch chiết được cô đặc thành cao bằng cách đem thu hồi dung môi Đem cân số cao này bằng cân phân tích Cao dược liệu được hòa tan vào DMSO để khảo sát tác động kháng vi sinh vật Quy trình chiết xuất được trình bày qua sơ đồ sau:
Trang 40Phơi bóng râm, sấy 60℃
Rây qua rây (đường kính lỗ 0,5 mm)
Chiết Soxhlet
Thu hồi dung môi
Sơ đồ 2.3: Quy trình chuẩn bị và chiết xuất cao dược liệu
Lá Trầu Không (rễ Dừa Cạn)
chloroform 10 g dược liệu
Xay
3 lần chiết xuất
Cao dược liệu