HỒ CHÍ MINH--- Ốpaâtì ^Ké*---Tên đề tài:KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT SỐ VI KHUẨN SINH CARBAPENEMASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU DỪA CẠN Catharanthusroseus L.. 39
VẬT LIỆU
2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện trong thời gian từ ngày 19 tháng 10 năm 2015 đến ngày 16 tháng 05 năm 2016 tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở –
10 chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không do phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh cung cấp 9 mẫu cây Dừa Cạn được thu nhận ở tỉnh Bình Dương 3 mẫu lá cây Trầu Không và 3 mẫu rễ cây Dừa Cạn (thực hiện cao chiết dược liệu) được thu nhận ở tỉnh Bình Dương
Chủng vi khuẩnkháng thuốc sinh carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường
2.1.3.1 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lò viba, bộ lọc,…
Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, que cấy trang, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt,…
2.1.3.2 Hóa chất và môi trường
Ethanol 70°, ethanol 96°, Sodium hypochlorite 5%, NaCl, NaOH 2M, HCl 2M, KOH 40%,…
Thuốc nhuộm: tím kết tinh (Crystal Violet), Lugol, Safranin O
Môi trường: NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), TSA (Trypticase Soya Agar), MHA (Muller Hinton Agar)
Lá Trầu Không và rễ cây Dừa Cạn khỏe mạnh
Thuốc thử: Catalase (H2O2 5%), Tricloroacetic acid (TCA), Gress A, Gress B,
Methyl Red, Phenol Red, ∝ - naphtop,…
Dung môi để chiết cao: Chloroform (CHCl3)
Dung môi hòa tan cao chiết: Dimethyl sulfoxid (DMSO).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa theo mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm như sau:
Sơ đồ 2.1: Quy trình thí nghiệm
Quan sát đại thể, vi thể
Phơi khô và xay thành bột dược liệu
Chiết xuất với dung môi
Cô thành cao dược liệu
Thử nghệm hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase
Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết với vi khuẩn
Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh lá Trầu Không và cây Dừa Cạn trên môi trường TSA Định danh chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh
2.2.2 Tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ bộ chủng vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn ( Catharanthus roseus (L.) G Don) và lá Trầu Không ( Piper betle L.) đã phân lập trước đó
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tái phân lập vi khuẩn nội sinh từ lá Trầu Không và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Dừa Cạn
Chủng vi khuẩn nội sinh lá Trầu
Tái kiểm tra vi khuẩn nội sinh trên môi trường TSA
Quan sát đại thể, vi thể
Tái kiểm tra: Bước đầu nhận dạng các loại vi khuẩn khác nhau dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, kích thước của khuẩn lạc Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn, đánh giá khả năng sinh trưởng và mô tả đặc điểm của từng chủng vi khuẩn nội sinh mọc lên từ các mẫu phân lập trên môi trường TSA Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc
Quan sát đại thể, vi thể
- Quan sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc…của khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh
- Quan sát vi thể: tiến hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X
- Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch và kính hiển vi (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006)
- Làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn: nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến) Là phương pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn thuộc Gram (+) hoặc Gram (-) do Han Christian Gram người Đan Mạch lần đầu tên mô tả vào năm 1844 Khi cùng nhuộm màu tế bào theo cùng phương pháp, vi khuẩn Gram (+) vẫn giữ được màu tím, còn vi khuẩn Gram (-) bị mất màu tím
Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần
Bước 2: Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 – 2 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 3: Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 4: Tẩy màu bằng cồn 96°, khoảng 15 – 30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô
Bước 5: Nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 6: Quan sát bằng vật kính dầu 100X Kết quả: vi khuẩn G (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn G (-) bắt màu hồng safranin
Chú ý: trước mỗi lần nhỏ thuốc nhuộm lên tiêu bản, phải đặt miếng giấy lọc phủ lên vết bôi Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm khô tiêu bản Trả lời tiêu bản nhuộm gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, ách bắt màu của vi khuẩn
2.2.3 Thử nghiệm khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu với vi khuẩn sinh enzym carbapenemase
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase với các chủng vi khuẩn nội sinh cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán (Ingroff và cs., 1995; Kumar A và cs., 2009)
Chuẩn bị môi trường thử nghiệm :
– Môi trường NB thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121℃ trong 20 phút – NA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml
– MHA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm:
– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃
– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày
– Tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase
– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha loãng đưa về nồng đồ 10 6 CFU/ ml – Tiến hành thí nghiệm
– Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA
– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng – Dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl
– Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
– Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vòng kháng
• Đọc kết quả: vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vòng – mm)
Hình 2.1: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn
2.2.4 Thử nghiệm đối kháng các chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase của dịch lọc các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây dược liệu bằng phương pháp giếng khuếch tán
• Chuẩn bị môi trường thử nghiệm :
– Môi trường NB thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121℃ trong 20 phút – NA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml
– MHA được đổ vào đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 ml
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm:
– Chuẩn bị vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ 24 giờ ở 37℃
– Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi khuẩn nội sinh vào 30 ml môi trường NB, ủ ở 37℃ trong 5 ngày
– Tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 8 phút ở 4℃ và thu dịch nổi vi khuẩn
– Lọc dịch vi khuẩn qua màng lọc 0,2 μm thu dịch lọc
• Chuẩn bị dịch vi khuẩn sinh carbapenemase
– Sử dụng vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18-24 giờ, pha dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lí 0,85%, tiến hành pha loãng đưa về nồng đồ 10 6 CFU/ ml – Tiến hành thí nghiệm
– Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước, trải đều trên mặt thạch MHA
– Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch MHA bằng dụng cụ tiệt trùng – Dịch lọc vi khuẩn nội sinh thử nghiệm được nhỏ vào trong lỗ khoảng 70 μl – Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch
– Sau đó ủ 24 giờ rồi xem kết quả vòng kháng
• Đọc kết quả: dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn kháng thuốc sinh enzyme Carbapenemase khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vòng – mm)
2.2.5 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ lá Trầu Không ( Piper betle L.) và rễ Dừa Cạn ( Catharanthus roseus (L.) G Don)
Dung môi trích ly: Chloroform (CHCl3) vì dung môi có khả năng chiết nhiều hợp chất và giá thành hợp lý
Yếu tố cố định: tỷ lệ khối lượng nguyên liệu và thể tích dung môi là 1:8; nhiệt độ chiết xuất là ở nhiệt độ phòng, thời gian trích ly là 3 giờ (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)
Lá Trầu Không sấy trong tủ sấy nhiệt độ là 60℃ cho đến khi khối lượng không đổi rồi đi xay thành bột Xử lý rễ cây Dừa Cạn tương tự như trên
