TỔNG QUAN
Tổng quan về lá ổi
2.1.1 Nguồn gốc Ổi (Psidium guajava) thuộc họ Myrtaceae cùng với đinh hương, tiêu và bạch đàn
Ổi, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, hiện được trồng rộng rãi ở nhiều khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới để lấy quả Các giống ổi thường cao khoảng 10m và bắt đầu cho quả sau 4 năm, trong khi cây ổi rừng có thể cao tới 20m và có nhiều nhánh Loại cây này phát triển tốt nhất ở nơi có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 23-28°C và lượng mưa từ 1000 đến 2000 mm Ổi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới có khả năng chịu hạn tốt và có thể phát triển trên nhiều loại đất khác nhau.
Lá cây ổi chứa nhiều hợp chất thực vật quan trọng như quercetin, avicularin, apigenin và kaempferol, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ lá ổi có hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm chống ung thư, điều trị đái tháo đường, chống oxy hóa, trị tiêu chảy, kháng khuẩn, hạ lipid máu và bảo vệ gan (Kumar và cộng sự, 2021).
Lá ổi có kích thước trung bình, dài từ 10-13 cm và rộng từ 2-6 cm, với cấu trúc đơn giản Các lá mọc đối nhau dọc theo thân cây, trên cuống dài từ 4-10 mm Phiến lá có hình dạng hơi bầu dục, dài từ 7-15 cm và rộng từ 3-7 cm, với đầu lá có thể tròn hoặc nhọn Mỗi lá có một gân giữa nổi bật và từ 10-20 cặp gân bên rõ ràng.
Hình 2.1 Đặc điểm của lá ổi (Kaneria và cộng sự, 2011)
Quả và lá ổi được mô tả chi tiết trong hình 2.2, với (A) là hình ảnh của quả và lá ổi, (B) thể hiện chùm lá ổi với mặt lưng bên trái và mặt bụng bên phải, và (C) là hình ảnh lá ổi với mặt lưng bên trái và mặt bụng bên phải (Kumar và cộng sự, 2021).
Lá ổi (Psidium guajava L.) là nguồn cung cấp phong phú các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng, cùng với nhiều hợp chất sinh học có lợi cho sức khỏe Cụ thể, trong lá ổi có chứa 3,64% tro, 0,62% chất béo, 18,53% protein, 12,74% carbohydrate, 103 mg axit ascorbic và 1717 mg đương lượng axit gallic (GAE)/g tổng số hợp chất phenolic (Shabbir và cộng sự, 2020).
Tổng quan về kháng oxy hóa và kháng viêm
2.2.1 Tổng quan về oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa
2.2.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa
Các phản ứng oxy hóa khử phức tạp diễn ra liên tục trong tế bào, xác định trạng thái oxy hóa khử của chúng Những phản ứng này bao gồm việc chuyển electron giữa các nguyên tử trong các phân tử sinh học, dẫn đến quá trình khử và oxy hóa các phân tử.
Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng trong trạng thái oxy hóa khử của tế bào, do các phản ứng tiền oxy hóa được xúc tác bởi các chất kích thích điện tử Những phản ứng này gây ra sự mất ổn định cấu trúc và kích hoạt tự phát của electron, dẫn đến tổn thương DNA, carboxyl hóa protein và oxy hóa lipid Kết quả là, stress oxy hóa gây tổn thương tế bào và thúc đẩy quá trình lão hóa cũng như sự phát triển của nhiều bệnh lý khác nhau.
Stress oxy hóa được xác định là nguyên nhân gây ra sự thay đổi hồng cầu trong bệnh đái tháo đường và bệnh tim mạch, đồng thời cũng là yếu tố góp phần vào thoái hóa tế bào thần kinh ở bệnh Alzheimer và Parkinson Ngoài ra, stress oxy hóa còn thúc đẩy tiến triển của các bệnh ung thư và di căn.
Trong các tế bào sống, các phản ứng tiền oxy hóa có nguồn gốc từ oxy (ROS) và nitơ phản ứng (RNS) đóng vai trò quan trọng ROS bao gồm gốc hydroxyl (OH-), anion superoxide (O2-) và hydro peroxide (H2O2), trong khi RNS chủ yếu là oxit nitơ (NO-) Những phản ứng này có thể tạo ra một loạt các phản ứng thứ cấp thông qua tương tác giữa ROS, RNS và các ion kim loại tự do, dẫn đến nguy cơ mất cân bằng trạng thái oxy hóa khử trong tế bào Việc sản xuất quá mức ROS và RNS gây rối loạn chức năng hệ thống chống oxy hóa, làm tăng stress oxy hóa Để duy trì trạng thái oxy hóa khử, tế bào sử dụng các enzyme như superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase và peroxiredoxin để bảo vệ khỏi các phản ứng tiền oxy.
Vitamin C, vitamin E và polyphenol là những chất chống oxy hóa quan trọng, giúp tiêu diệt các gốc tự do (ROS) và các dẫn xuất nguy hiểm của chúng, theo nghiên cứu của Landete JM và cộng sự (2013) cùng với Littarru GP và cộng sự (2011).
2.2.1.2 Tác dụng kháng oxy hóa của cao chiết lá ổi
Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2021), lá ổi ở New Delhi, Ấn Độ, được biết đến như một nguồn thuốc truyền thống nhờ vào khả năng chống oxy hóa và hạ đường huyết Lá ổi chứa nhiều chất chuyển hóa thứ cấp như phenolic acid, flavonoid, triterpenoids, sesquiterpenes, glycosides, alkaloids và saponin, trong đó hợp chất polyphenol là thành phần quan trọng cung cấp chất chống oxy hóa Khoảng bảy mươi hai hợp chất phenolic đã được xác định trong lá ổi ở Granada, Tây Ban Nha, với quercetin là hợp chất polyphenol có hoạt tính sinh học chính (Díaz-de-Cerio và cộng sự, 2016).
Hình 2.3 Cấu trúc các hợp chất polyphenol có trong lá ổi (Kumar và cộng sự, 2021)
Các gốc tự do được sinh ra trong quá trình trao đổi chất có thể gây ra nhiều bệnh lý nghiêm trọng ở con người, bao gồm viêm, thiếu máu cục bộ, rối loạn thần kinh, hemochromatosis, thủng phế quản, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải và nhiều bệnh khác (Stefanis và cộng sự, 1997) Sự hiện diện của các hợp chất phenolic có thể đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại những tác động tiêu cực của các gốc tự do này.
Guava leaves, particularly from Taichung, Taiwan, contain compounds such as gallic acid, pyrocatechol, taxifolin, ellagic acid, and ferulic acid, which contribute to their antioxidant properties (Farag et al., 2020; Chen et al., 2007) Additionally, liquid chromatography analysis of guava leaf extracts from Ash Sharqia, Egypt, revealed the presence of flavonoids including quercetin, hesperetin, kaempferol, rutin, catechin, and apigenin, as well as kaempfertin and isoquinoline, all of which play a significant role in the antioxidant characteristics of guava leaves (Taha et al., 2019).
Các hợp chất chống oxy hóa từ lá ổi vùng Pulau Pinang, Malaysia, đã được chứng minh có tác dụng giảm thiểu tổn hại do gốc tự do Theo nghiên cứu của Lee và cộng sự (2012), tinh dầu chiết xuất từ lá ổi này cho thấy hoạt tính chống oxy hóa với giá trị IC50 khoảng 460,37± 1,33 àg/mL thông qua thử nghiệm DPPH Ngoài ra, Chen và cộng sự (2007) cũng chỉ ra mối liên hệ tuyến tính mạnh mẽ giữa hoạt tính chống oxy hóa, khả năng loại bỏ gốc tự do và hàm lượng polyphenol trong dịch chiết lá ổi từ Đài Trung, Đài Loan, với hệ số tương quan cao từ 0,921 đến 0,991.
Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2016) đã chỉ ra rằng polysaccharide trong lá ổi từ Jeju, Hàn Quốc có khả năng chống lại stress oxy hóa, đặc biệt là trong mô hình cá ngựa vằn Tác dụng bảo vệ này của polysaccharide góp phần quan trọng vào việc giảm thiểu tác động tiêu cực của stress oxy hóa.
H2O2 ức chế sự hình thành ROS, giảm quá trình peroxy hóa lipid và dẫn đến chết tế bào (Kim và cộng sự, 2016) Nghiên cứu của Trần và cộng sự (2020) cho thấy, dịch chiết lá ổi trồng tại Trà Ôn, Vĩnh Long với nồng độ từ 4000ppm trở lên có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa trong xúc xích thịt lợn tươi.
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào đánh giá khả năng kháng oxy hóa của lá ổi rừng tại tỉnh Đắk Lắk, mặc dù có sự khác biệt về địa lý, thổ nhưỡng và phương pháp thu nhận so với các nghiên cứu về giống ổi khác.
2.2.1.3 Mô hình đánh giá hoạt động kháng oxy hóa a Đánh giá năng lực khử (Reducing Power: RP)
Năng lực khử liên quan đến hoạt động chống oxy hóa và phản ánh khả năng chống oxy hóa của các hợp chất chiết xuất (Oktay và cộng sự, 2003) Các hợp chất có năng lực khử đóng vai trò là chất cho điện tử, giúp khử các chất trung gian bị oxy hóa trong quá trình này.
Peroxy hóa lipid có khả năng hoạt động như chất chống oxy hóa sơ cấp và thứ cấp (Chanda và cộng sự, 2009) Trong thí nghiệm, màu vàng của dung dịch thử biến đổi thành màu xanh lá cây tùy thuộc vào năng lực khử của từng hợp chất Các chất khử làm chuyển đổi phức hợp Fe 3+/ ferricyanide sang dạng Fe 2+/ ferrous (màu xanh) Bằng cách đo sự hình thành màu xanh ở bước sóng 700nm, năng lực khử của hợp chất có thể được xác định (Jayanthi và Lalitha, 2011) Mô hình đánh giá khả năng kháng oxy hóa dựa trên mức độ tạo phức với ion kim loại đồng.
Các hợp chất phenolic có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác nhân oxy hóa, do đó được xem là chất chống oxy hóa (Dusek và cộng sự, 2015) Chất chống oxy hóa hoạt động thông qua ba cơ chế chính: chuyển electron, chuyển nguyên tử hydro và trung hòa các kim loại chuyển tiếp như Fe 2+, Cu 2+ và Zn 2+ (Wu, & Schaich, 2005).
Tổng quan về mô hình cá ngựa vằn
Zebrafish (Danio rerio) is a freshwater fish species belonging to the minnow family (Cyprinidae) within the Cypriniformes order These fish are commonly found in streams, canals, ditches, ponds, and rice fields (Arunachalam M et al., 2013; Engeszer RE et al., 2007).
Cá ngựa vằn (Zebrafish) có thân hình thoi với năm sọc màu xanh kéo dài từ đầu đến cuối vây đuôi, tạo nên hình ảnh giống như sọc của ngựa vằn Kích thước của chúng dao động từ 1,8 đến 3,7 cm, với miệng hướng lên trên Con đực có hình dạng giống ngư lôi và có sọc vàng giữa các sọc xanh, trong khi con cái có bụng lớn hơn, màu trắng và sọc bạc thay vì vàng.
Cá ngựa vằn có tuổi thọ trung bình từ hai đến ba năm trong môi trường nuôi nhốt, nhưng nếu được chăm sóc trong điều kiện lý tưởng, tuổi thọ của chúng có thể kéo dài hơn năm năm.
Cá ngựa vằn là loài ăn tạp, chủ yếu tiêu thụ động vật phù du, thực vật phù du, côn trùng và ấu trùng Khi nguồn thức ăn ưa thích không có sẵn, chúng có thể ăn giun và động vật giáp xác nhỏ Trong các nghiên cứu, cá ngựa vằn trưởng thành thường được cho ăn bằng tôm nước muối (artemia) hoặc paramecia.
Cá ngựa vằn có thời gian sinh sản gần đúng là ba tháng và có khả năng sinh sản không đồng bộ, thậm chí hàng ngày trong điều kiện tối ưu (Alestrửm P và cộng sự, 2020) Trứng của chúng được thụ tinh ngay lập tức, tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu, khiến cá ngựa vằn trở thành một loài mô hình lý tưởng.
Hình 1.4 Cá ngựa vằn cái (ở trên ) và đực (ở dưới) (Tohru Murakami/ Flickr, 2014)
Hình 1.5Các giai đoạn phát triển của cá ngựa vằn (Ed Hendel, 2014)
2.3.2 Mô hình cá ngựa vằn
Mô hình cá ngựa vằn (Danio rerio) là một trong những mô hình sinh vật có xương sống quan trọng trong nghiên cứu khoa học, đặc biệt là trong phát triển thuốc và nghiên cứu tiền lâm sàng (Van W và cộng sự, 2017) Mặc dù chuột là mô hình nghiên cứu phổ biến nhất, nhưng việc sử dụng cá ngựa vằn đã gia tăng đáng kể trong cộng đồng khoa học trong những thập kỷ gần đây Lý do cho sự gia tăng này bao gồm việc giảm thời gian và chi phí so với các mô hình động vật truyền thống, đồng thời cung cấp thông tin và đánh giá tốt hơn so với các kết quả in vitro (MacRae CA, 2015).
Cá ngựa vằn nổi bật với khả năng sinh sản cao và dễ dàng, kích thước nhỏ, cùng với sự đa dạng của các dòng chuyển gen, giúp thao tác in vivo trở nên đơn giản (García-Moreno D, 2019; MacRae CA và cộng sự, 2015; Dooley K, 2000) Độ trong suốt của ấu trùng và các dòng cá ngựa vằn biến đổi gen cho phép theo dõi hiệu quả các quá trình viêm và hành vi tế bào in vivo (Lee SH và cộng sự, 2013) So với bộ gen tham chiếu của người, cá ngựa vằn có khoảng 70% sự tương đồng (Vilella và cộng sự, 2009) Đặc biệt, hệ thống miễn dịch của cá ngựa vằn có nhiều điểm tương đồng với con người, với hầu hết các hệ thống tế bào miễn dịch của con người đều hiện diện trong cá ngựa vằn (Meeker ND và cộng sự, 2008).
Giai đoạn đầu đời của cá ngựa vằn, bao gồm phôi và ấu trùng không ăn, rất nhạy cảm với các hợp chất hóa học, khiến chúng trở thành công cụ sàng lọc lý tưởng trong nghiên cứu khoa học Quá trình tạo phôi hoàn thành trong 72 giờ sau khi thụ tinh, và sự phát triển của các cơ quan và mô chính diễn ra trong vòng 120 giờ, cho phép theo dõi tác động của các yếu tố khác nhau trong các giai đoạn phát triển khác nhau (Qian L và cộng sự, 2019; Yang).
Mô hình cá ngựa vằn đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu để đánh giá khả năng kháng viêm và kháng oxy hóa của chiết xuất từ các loài thực vật Một ví dụ điển hình là nghiên cứu của Thu Hang Nguyen và cộng sự (2020), trong đó họ đã khảo sát hoạt tính chống viêm và chống oxy hóa của chiết xuất Ethanol từ Clerodendrum Cyrtophyllum Turcz do đồng sunfat gây ra ở cá ngựa vằn Ngoài ra, nghiên cứu cũng đề cập đến hoạt động chống oxy hóa của polysaccharide được phân lập từ chiết xuất thực vật.
Nghiên cứu của Lei Wang và cộng sự (2019) đã chỉ ra rằng Sargassum fulvellum, một loại rong biển màu nâu có thể ăn được, có tác dụng tích cực trong các thí nghiệm in vitro và in vivo Đồng thời, nghiên cứu của Peng Zhang và cộng sự (2023) đã xác định đặc tính chống viêm và chống oxy hóa của Squalene trong việc điều trị viêm do đồng sunfat gây ra ở cá ngựa vằn.
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây, cao chiết từ các hợp chất tự nhiên được chiết xuất từ thực vật, động vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến Lá ổi, một nguyên liệu thực vật quen thuộc tại Việt Nam, đã được sử dụng để sản xuất cao chiết chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe người tiêu dùng.
Nhiều nghiên cứu trong nước đã chỉ ra rằng lá ổi có thể được chiết xuất thành các dạng cao chiết khác nhau, bao gồm hạt bao và cao khô, với nhiều đặc tính và hoạt tính sinh học tích cực Trương Thị Ý Nhi và Nguyễn Minh Chơn (2021) báo cáo rằng cao chiết lá ổi/ethanol có khả năng kháng oxy hóa cao nhất, với giá trị IC50 là 0,113 μg/ml khi sử dụng phương pháp ức chế gốc tự do DPPH Tương tự, nghiên cứu của Hồ Bá Vương và cộng sự (2015) cho thấy dịch chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,1 μg/ml Ngoài ra, nghiên cứu của Nguyễn Quang Vinh và cộng sự (2022) về lá ổi rừng cho thấy khả năng kháng oxy hóa của chúng với IC50 là 178,90 μg/ml.
Nghiên cứu trong nước đã chỉ ra rằng lá ổi có hoạt tính kháng oxy hóa in vitro, nhưng chưa có bài báo nào đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vivo và khả năng kháng viêm của cao chiết lá ổi rừng.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Nghiên cứu quốc tế đã chỉ ra khả năng kháng oxy hóa và kháng viêm của lá ổi Một bài báo của Fernandes và cộng sự (2014) cho thấy rằng chiết xuất lá ổi (Psidium guajava L.) qua phương pháp sấy phun có hoạt động chống oxy hóa và kháng khuẩn đáng chú ý, với giá trị IC 50 nằm trong khoảng từ 7,96 đến 8,11 μg/mL.
Trong nghiên cứu của Fernandes và cộng sự (2014), hoạt động chống oxy hóa đã được đánh giá thông qua phương pháp DPPH Một nghiên cứu khác của You Luo và cộng sự (2019) về polysaccharide từ lá ổi cho thấy giá trị IC50 lần lượt là 46,49 μg/mL, 175,52 μg/mL và 102,82 μg/mL đối với các phương pháp DPPH, OH và ABTS của chiết xuất nước Tất cả các giá trị này đều cao hơn so với ascorbic acid và trolox, cho thấy tiềm năng chống oxy hóa đáng kể của chiết xuất lá ổi.
Nghiên cứu về đặc tính kháng viêm của lá ổi cho thấy chiết xuất ethanol có tác dụng đáng kể trong việc ức chế sản xuất oxit nitric và prostaglandin E2 do lipopolysaccharide (LPS) gây ra, theo Mi Jang và cộng sự (2014) Hơn nữa, chiết xuất lá ổi đã thể hiện hoạt động chống viêm hiệu quả trong hai mô hình động vật khác nhau, bao gồm triệu chứng đau do tá dược Freund và sốc nội độc tố do LPS ở chuột Nghiên cứu của Linda Weni và cộng sự (2011) cũng khẳng định chiết xuất lá ổi giúp giảm mức độ phù nề ở chân chuột do carrageenan, chứng minh đặc tính chống viêm của nó.
Nghiên cứu cho thấy cao chiết lá ổi có tiềm năng kháng oxy hóa và kháng viêm Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu chỉ được thực hiện trong mô hình in vitro, và còn thiếu các nghiên cứu in vivo cụ thể trên mô hình cá ngựa vằn.
Vật liệu và hóa chất
Cao chiết lá ổi rừng bao gồm cao thô (Crude Extract: CE), cao phân đoạn nước (Water Fraction: WF) và cao phân đoạn ethyl acetate (Ethyl Acetate Fraction: EAF), được chiết xuất từ lá ổi rừng thu hái tại Khu bảo tồn thiên nhiên Ea So, huyện M'đrắk, Đắk Lắk, Việt Nam.
Sản phẩm vi bao sấy thăng hoa và vi bao sấy phun được phát triển từ mẫu cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường thuộc trường Đại học Tây Nguyên tại Tp Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk.
- Trứng gà tươi: trứng QLEgg hộp 10 quả mua tại cửa hàng bách hóa xanh
Hệ thống cá ngựa vằn được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường, được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn thí nghiệm với nhiệt độ môi trường 28 ± 1°C, chu kỳ sáng 14 giờ và tối 10 giờ Oxy được cung cấp đầy đủ bằng máy bơm không khí, với mật độ kiểm soát là 15 con trưởng thành trong mỗi bể 4 L.
Hình 2.1 Hệ thống cá ngựa vằn tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường
Nước lọc vô trùng là nước máy đã được khử clo và lọc qua hệ thống lọc cùng bộ lọc tia cực tím, nhằm giảm thiểu các chất gây ô nhiễm, đáp ứng tiêu chuẩn phòng thí nghiệm cho cá ngựa vằn (Westerfield, 2000).
- Dụng cụ: đĩa 6 giếng, đĩa 96 giếng, erlen, beacher, ống nghiệm, ống falcon
+Thiết bị cô quay IKA RV10 digital
+Thiết bị đọc khay Elisa (96 giếng) Hidex
+Thiết bị đo UV Vis
Viện Công nghệ Sinh học & Môi trường tại Đại học Tây Nguyên, tp Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk cung cấp các loại thuốc kháng viêm như Ibuprofen và Methylprednisolone, cùng với Quercetin, CuSO4 khan, H2O2 30%, Kali ferricyanide K3Fe(CN)6, trichloroacetic acid CCl3COOH, sắt (III) Clorua FeCl3, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, và lidocaine 2%.
+ Thuốc nhuộm huỳnh quang 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate được mua từ Sigma-Aldrich
Phương pháp nghiên cứu
- Tổng quan về lá ổi: nguồn gốc, đặc điểm sinh thái, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học.
- Tổng quan về stress oxy hóa, viêm: định nghĩa, quá trình, mô hình kháng oxy hóa, kháng viêm
- Tổng quan về mô hình cá ngựa vằn
- Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.
- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
Năng lực khử và khả năng trung hòa ion đồng Cu 2+ được đánh giá qua các thí nghiệm in vitro Trong khi đó, khả năng kháng oxy hóa đối với H 2 O 2 được kiểm tra in vivo trên ấu trùng cá ngựa vằn, với tiêu chí là tỉ lệ ấu trùng tử vong.
- Đánh giá khả năng kháng viêm của cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
+ In vitro: khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà;
Nghiên cứu in vivo cho thấy CuSO4 có khả năng kháng viêm trên ấu trùng cá ngựa vằn, được đánh giá qua tỷ lệ ấu trùng bị viêm Đồng thời, mức độ tạo gốc tự do được xác định thông qua phương pháp nhuộm huỳnh quang, cung cấp cái nhìn sâu sắc về tác động của CuSO4 đối với sức khỏe của ấu trùng.
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm và kháng oxy hóa
-Xử lý thống kê ANOVA 1 chiều bằng phần mềm SPSS.
-Tính toán, phân tính dữ liệu bằng excel.
Xử lí số liệu & biện luận
- Trích ly các cao chiết: Cao thô (CE), cao phân đoạn ethyl acetate (EAF), cao phân đoạn nước (WF).
Phương pháp thu nhận đối tượng nghiên cứu
3.2.2 Phương pháp trích ly, thu nhận các cao chiết lá ổi
*Mục đích: chuẩn bị các mẫu cao ở các phân đoạn khác nhau để tiến hành đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm
*Sơ đồ quy trình công nghệ t = 50⁰C t= 30⁰C, = 20’ w/v=1/10 (g/ml); f= 28 kHz, đầu dò: 10mm
Trích ly hỗ trợ siêu âm
Phân đoạn nước Đông khô
Phương pháp trích ly cao chiết lá ổi rừng được thực hiện theo nghiên cứu của Quang-Vinh Nguyen và cộng sự (2022) Nguyên liệu lá ổi rừng được lựa chọn cẩn thận, loại bỏ lá sâu, hư hỏng và sau đó được sấy đối lưu ở nhiệt độ 50⁰C cho đến khi độ ẩm còn lại dưới 8% Tiếp theo, lá được nghiền nhỏ và rây qua lưới có đường kính 2mm Bột lá ổi rừng sau đó được trích ly bằng ethanol 50% với sự hỗ trợ của sóng siêu âm ở nhiệt độ 30⁰C trong 20 phút, với tỉ lệ bột và dung môi là 1/10 (w/v), tần số 28 kHz và đầu dò 10mm Cuối cùng, dịch trích ly được ly tâm để thu được chiết xuất.
Quá trình chiết xuất cao ổi bao gồm việc ly tâm với tốc độ 15000 × g trong 15 phút để loại bỏ cặn Sau đó, dịch trích được cô quay bằng thiết bị IKA RV10 digital, tiếp theo là đông khô và nghiền thành bột Cuối cùng, cao ổi thô được bảo quản ở nhiệt độ -30⁰C để đảm bảo chất lượng.
Phương pháp thu nhận các phân đoạn cao chiết được thực hiện theo nghiên cứu của Quang-Vinh Nguyen và cộng sự (2021) Dịch chiết cao ổi thô được trích ly lần lượt bằng n-hexan và chloroform để loại bỏ các hợp chất tan trong hai dung môi này Sau đó, dịch cao còn lại được trích ly bằng ethyl acetate, và phần tan trong ethyl acetate được cô quay để thu được cao phân đoạn ethyl acetate Cuối cùng, dịch còn lại chủ yếu là nước và các hợp chất tan trong nước được đông khô để thu được cao chiết phân đoạn nước.
Các cao chiết được bảo quản ở nhiệt độ -30⁰C để dự trữ cho các thí nghiệm đánh giá hoạt tính tiếp theo
Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa trên các mô hình in vitro và in vivo
3.3.1.1 Xác định năng lực khử của cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng (Reducing power)
*Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của các cao chiết và sản phẩm bột vi bao lá ổi rừng
Phương pháp đánh giá năng lực khử được thực hiện theo phương pháp Athukorala và cộng sự, (2006)
Để chuẩn bị đệm phosphate với pH 6,6, cần pha hai dung dịch: dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M bằng cách hòa tan 27,8 g NaH2PO4 và định mức đến 1000 ml Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M được tạo ra bằng cách hòa tan 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O và định mức đến 1000 ml.
1000 ml Thêm từ từ dung dịch b(b) vào dung dịch (a) và hiệu chỉnh pH đến 6,6
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Ủ 50 o C trong 20 phút
Ly tâm 3000 vòng/phút trong
Hút mẫu cho phản ứng màu Đo OD tại bước sóng 700nm
Thu & xử lý số liệu- đánh giá
Dung dịch mẫu: quercetin (đối chứng dương), CE, EAF, WF nồng độ 500 mg/L; FDM và SDM nồng độ 10000 mg/L
Dung dịch Trichloroacetic acid (TCA) 10%: cân 10g Trichloroacetic acid định mức trong 100ml nước cất
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1ml dung dịch mẫu, 2,5ml dung dịch đệm phosphate và 2,5ml dung dịch K3Fe(CN)6 Sau khi ủ ấm ở 50ºC trong 20 phút, thêm 2,5ml TCA 10% và ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm, rút 2,5ml dịch và hòa với 2,5ml nước cất và 0,5ml FeCl3 0,1%, sau đó lắc đều Cuối cùng, đo độ hấp thụ ở bước sóng 700nm để thu thập số liệu và đánh giá, với quercetin được sử dụng làm đối chứng dương.
3.3.1.2 Đánh giá khả năng kháng oxy hóa dựa trên mức độ tạo phức với ion kim loại đồng
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết và sản phẩm bột vi bao lá ổi rừng, thông qua việc tạo phức và trung hòa kim loại đồng.
Hút mẫu vào đĩa 96 giếng
Thờm 8,5 àL dd PV 2 mM Ủ 10 phút Đo OD ở 632nm
Thu & xử lý số liệu-Đánh giá
Phương pháp được thực hiện theo nghiên cứu của Santos và cộng sự (2017)
Dung dịch đệm natri acetat pH 6,0: Hòa tan 0,287 ml acetic acid trong 37,5 ml nước cất Điều chỉnh pH đến 6,0 bằng NaOH 1N
Dung dịch pyrocatechol violet (PV) 2 mM:
Dung dịch mẫu: pha các mẫu thử theo nồng độ dưới đây
+ Các cao chiết lá ổi rừng: 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024 mg/L
+ Sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng: 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 mg/L
Khả năng trung hòa ion Cu 2+ của cao chiết và bột vi bao lá ổi rừng được đánh giá theo phương pháp của Santos và cộng sự (2017), sử dụng PV làm tác nhân tạo màu Mỗi giếng thí nghiệm chứa 30 µL dung dịch mẫu với các nồng độ khác nhau cùng với mẫu nước cất (đối chứng), được trộn với 200 µL dung dịch đệm natri axetat (50 mmol/L, pH 6,0).
Trong nghiên cứu này, 30 µL dung dịch CuSO4.5H2O với nồng độ 100 mg/L được thêm vào mỗi giếng và để phản ứng trong 2 phút Sau đó, 8,5 µL dung dịch PV 2mM được thêm vào để khởi động phản ứng Tất cả các hỗn hợp phản ứng được lắc và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ 25°C Mẫu được đo tại bước sóng 632 nm bằng máy quang phổ UV-Vis, và khả năng chelate đồng của mẫu được tính toán theo công thức đã định.
% tạo phức với ion đồng = OD control −OD mẫu
OD control : Độ hấp thụ của ống nghiệm control
OD mẫu : Độ hấp thụ của ống nghiệm mẫu
3.3.1.3 Đánh giá khả năng kháng stress oxy hóa trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn
*Mục đích: đánh giá khả năng kháng stress oxy hóa trên mô hình in vivo của các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
Phương pháp được thực hiện theo phương pháp của Long Binh Vong và cộng sự
(2016) với một số sửa đổi
Dung dịch H2O2: Hỳt 200 àM dung dịch H2O2 30% định mức trong 1 lớt mụi trường nước nuôi cá
Dung dịch cao chiết: pha các nồng độ cao
+ Quercetin: 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3 mg/L Ấu trùng cá
Thay môi trường nuôi cá
Xác định số lượng cá tử vong
Chuẩn bị ấu trùng cá ngựa vằn:
Phối giống cá với tỷ lệ cá thể cái và đực là 2:1 Phương pháp lựa chọn giới tính dựa trên phương pháp thủ công nhận biết bằng mắt thường
Thực hiện phối giống ở lồng ấp.
Cung cấp Oxy, thức ăn và ánh sáng đủ 12 giờ
Thu phôi, làm sạch phôi, loại bỏ phôi hỏng
Phân phối phôi vào đĩa 6 giếng với mật độ 30 phôi/đĩa
Ngâm và bổ sung xanh methylen vào phôi với nồng độ 500àl/l Thay xanh methylen sau 12 giờ.
Xác định đúng ngày tuổi của cá, chọn cá thí nghiệm vào ngày tuổi thứ 4 của cá, tiếp tục lọc bỏ phôi hỏng, cá dị tật.
Xác định lại mật độ chính xác với 30 cá thể/đĩa Sắp xếp các đĩa chuẩn bị cho lô thí nghiệm.
Trong thí nghiệm, ấu trùng cá ngựa vằn 4 ngày tuổi được ngâm trong dung dịch mẫu trong 24 giờ, sau đó chuyển sang dung dịch H2O2 để gây oxy hóa Sau 24 giờ tiếp theo, môi trường nước nuôi được thay đổi và theo dõi thêm 24 giờ để xác định số lượng ấu trùng cá tử vong Các ấu trùng chết có dấu hiệu màu trắng đục, mắt lồi và cơ thể đang bị phân hủy.
Công thức tính: % tỷ lệ ấu trùng tử vong = Số lượng ấu trùng tử vong
Hình 2.3 Ấu trùng tử vong
3.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng viêm trên các mô hình in vitro và in vivo
3.3.2.1 Đánh giá khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà
*Mục đích: đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết và sản phẩm bột vi bao lá ổi rừng
*Sơ đồ thí nghiệm chung:
Phương pháp thí nghiệm được được thực hiện theo phương pháp của Sakat S và cộng sự, 2010
Dung dịch đệm phosphate pH 6,4 được chuẩn bị bằng cách từ từ thêm dung dịch B (chứa 3.967g Na2HPO4 hòa tan trong 200ml nước cất) vào dung dịch A (chứa 1.9448g NaH2PO4.2H2O hòa tan trong 800ml nước cất) và điều chỉnh cho đến khi đạt pH 6,4.
Để dịch albumin trứng gà, bạn cần pha từ từ dung dịch B (NaCl 0,5%) vào dung dịch A (lòng trắng trứng gà) theo tỉ lệ 1:3 (v/v) Sau đó, khuấy đều hỗn hợp và lọc qua giấy lọc để thu được albumin trứng gà ở phần dưới giấy lọc.
Chuẩn bị dung dịch phản ứng
Làm nguội Đo UV VIS = 660nm t = 70⁰C, = 3’ t = 37⁰C, = 20’
Dung dịch mẫu:Quercetin/ thuốc kháng viêm/ cao chiết/ vi bao a Các chất đã được công bố hoạt tính kháng viêm
+ Thuốc Ibuprofen / Methylprednisolone: 1000; 800; 600; 400; 200 mg/L b Các cao chiết: 1024; 512; 256; 128; 64; 32; 16 mg/L c Sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng: 8192; 4096; 2048; 1024; 512; 256; 128 mg/L
Hỗn hợp phản ứng 5ml bao gồm 2ml dịch hoặc đệm (control), 2,8ml đệm phosphate và 0,2ml albumin trứng gà được lắc đều và ủ ở 37⁰C trong 20 phút Sau đó, tiến hành gây biến tính ở 70⁰C trong 3 phút và làm nguội ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút Cuối cùng, đo UV-VIS ở bước sóng λ 660nm.
% ức chế = OD control −OD mẫu
OD control : Độ hấp thụ của mẫu control (đệm)
OD mẫu : Độ hấp thụ của dịch mẫu thử
3.3.2.2 Đánh giá khả năng kháng viêm trên mô hình ấu cá ngựa vằn
*Mục đích: đánh giá khả năng kháng viêm trên mô hình in vivo của các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
Chuẩn bị Ấu trùng cá ngựa vằn 4 ngày tuổi: chọn lọc ấu trùng khỏe mạnh, không dị tật phân phối vào đĩa 6 giếng với mật độ 30 cá thể/đĩa
Dung dịch CuSO4 20 mM được tạo ra bằng cách hòa tan 0,08 g CuSO4 khan trong 100 ml nước cất, tạo thành dung dịch A với nồng độ 5000 mM Tiếp theo, pha loãng 1 ml dung dịch A với 100 ml nước cất để có dung dịch B với nồng độ 50 mM Cuối cùng, pha loãng dung dịch B với nước cất theo tỷ lệ 2:3 (v:v) để đạt được dung dịch CuSO4 20 mM.
Theo dõi & ghi nhận số liệu đến
Thay môi trường nước nuôi cá Ngâm cao chiết lá ổi Gây viêm bằng CuSO4
Chọn lọc ấu trùng cá ngựa vằn 4 ngày tuổi
Xử lý số liệu và chụp hình thái ấu trùng
+ Thuốc kháng viêm Ibuprofen: 0; 1; 2; 4; 5; 6; 8; 10 mg/L
Trong thí nghiệm, ấu trùng cỏ ngựa vằn được xử lý viêm bằng CuSO4 20µM trong 2 giờ, sau đó thay dung dịch mẫu và tiếp tục ngâm trong 2 giờ nữa Nước nuôi các giếng ấu trùng được thay đổi để theo dõi thí nghiệm trong 24 giờ Số lượng ấu trùng viêm và tử vong được xác định và ghi nhận tại các thời điểm 0, 2, 4 và 24 giờ Các dấu hiệu của ấu trùng bị viêm bao gồm: nằm ngửa bụng, mất khả năng bơi, bụng phình to và thân bị cong.
Công thức tính: % tỉ lệ viêm = Số ấu trùng viêm
Số ấu trùng còn sống× 100
Hình 2.4 Ấu trùng bị viêm
3.3.2.3 Đánh giá mức độ tạo ROS do ion đồng gây ra trong cơ thể ấu trùng cá ngựa vằn
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá mức độ hình thành ROS (Reactive Oxygen Species) ở ấu trùng cá ngựa vằn khi được xử lý bằng các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết từ lá ổi rừng tối ưu.
Phương pháp nhuộm huỳnh quang được thực hiện theo phương pháp của Nguyen, T.H và cộng sự (2020) với một số sửa đổi
Dung dịch H2DCFDA 20 àM/ml: Cõn 0,006g H2DCFDA trong 3 ml DMSO làm dung dịch stock Sau đó pha loãng dung dịch này 100 lần để được dung dịch yêu cầu
Dung dịch gây mê: Hút 12 ml dung dịch lidocain 2% vào 100 ml nước vô trùng
Dịch mẫu: Chọn nồng độ tối ưu của cao thô, cao phân đoạn, sản phẩm vi bao tối ưu nhất
Xử lý dịch mẫu (cao, sản phẩm vi bao), 2h
Chụp ảnh dưới kính hiển vi Ấu trùng cá ngựa vằn 4 ngày
Thí nghiệm được thực hiện trên ấu trùng cá ngựa vằn 4 ngày tuổi bằng cách xử lý với dung dịch CuSO4 20μM trong 2 giờ để tạo ra stress oxy hóa Sau đó, ấu trùng được ủ với dung dịch H2DCFDA trong 1 giờ trong điều kiện bóng tối ở nhiệt độ 28 ± 1 o C Cuối cùng, ấu trùng được rửa sạch bằng nước vô trùng, gây mê bằng dung dịch lidocain và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ba lần để thu thập dữ liệu và được phân tích bằng phần mềm SPSS 2020 Phương pháp One-way ANOVA được áp dụng để xác định sự khác biệt có ý nghĩa với mức p < 0,05 theo tiêu chuẩn Tukey Bên cạnh đó, các số liệu và đồ thị được trình bày thông qua phần mềm Excel.
KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN
Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết và sản phẩm bột vi bao lá ổi rừng trên các mô hình in vitro và in vivo
4.1.1 Năng lực khử của các cao chiết và sản phẩm bột vi bao lá ổi rừng
4.1.1.1 Năng lực khử của các cao chiết lá ổi rừng
Chất chống oxy hóa có tính chất oxy hóa khử, đóng vai trò là chất khử và có khả năng khử các kim loại chuyển tiếp như Fe 3+ Thí nghiệm đánh giá năng lượng khử dựa trên phản ứng giữa các chất khử và kali fericyanid (Fe 3+) để tạo thành kali ferocyanid (Fe 2+), sau đó phản ứng với sắt clorua để hình thành phức hợp FeCl 2 - FeCl 3 có độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm Khả năng khử của các mẫu được đánh giá thông qua độ hấp thụ ở 700 nm (Huang D và cộng sự, 2005).
Để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các loại cao chiết lá ổi rừng trên các phân đoạn khác nhau, kết quả về năng lực khử sắt được trình bày trong biểu đồ hình 4.1.
Hình 4.1 Năng lực khử của các mẫu nồng độ 500mg/L tại bước sóng 700nm
(EAF-cao phân đoạn ethyl acetate; CE – cao thô; WF: cao phân đoạn nước) c a b d e
Trolox Quercetin EAF CE WF Đ ộ hấp t hụ t ại 700nm
Trong thí nghiệm đánh giá năng lực khử sắt, chúng tôi sử dụng Trolox, một chất tương tự ưa nước của α-tocopherol, dạng tocopherol hoạt động mạnh nhất trong cơ thể (Lúcio M và cộng sự, 2009) Trolox có hoạt tính chống oxy hóa tương tự như α-tocopherol (Massey K.D và cộng sự, 1990) và được biết đến với khả năng thu dọn gốc tự do cao của các gốc peroxyl và alkoxyl (Huang D và cộng sự, 2005) Nó đã được chứng minh là một chất chống oxy hóa mạnh trong nhiều hệ thống mô hình tế bào (Distelmaier F và cộng sự, 2012).
So sánh với trolox, quercetin và cao chiết lá ổi rừng cho thấy khả năng khử mạnh mẽ ở nồng độ 500 mg/L Cụ thể, quercetin và cao phân đoạn ethyl acetate có khả năng khử sắt cao hơn trolox, với giá trị năng lực khử tại 700nm lần lượt là 1,677; 2,223 và 2,181 Mặc dù WF và CE có năng lực khử kém hơn, nhưng chúng vẫn thể hiện khả năng khử sắt với độ hấp thụ không thấp hơn một nửa so với trolox, đạt trên 0,85, với độ hấp thụ của cao phân đoạn nước và cao thô lần lượt là 0,922 và 0,882.
Nghiên cứu của Yokozawa và cộng sự (1998) cho thấy các hợp chất polyphenol với nhóm hydroxyl ở vị trí C-3 có khả năng nhặt gốc tự do và tiếp nhận điện tử Cao chiết ổi rừng, chứa nhiều hợp chất polyphenol như axit gallic, catechin, epicatechin, rutin, axit ellagic, quercetin, apigenin, quercitrin, vitexin, apigenin-7-O-D-glucopyranoside và axit chlorogenic (Nguyễn Quang Vinh và cộng sự, 2022), cũng có khả năng tiếp nhận điện tử cao và khả năng khử Fe 3+.
Fe 2+ với số lượng lớn
Nghiên cứu về khả năng khử của các cao chiết phân đoạn khác nhau đã được công bố, trong đó Nakamura và cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng các dung môi phân đoạn khác nhau ảnh hưởng đến thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cao chiết lá.
Cao phân đoạn ethyl axetat của Sasa quelpaertensis Nakai (SQN) cho thấy khả năng khử đặc biệt mạnh mẽ ở tất cả các nồng độ (100, 200 và 300 µg/L), tương tự như kết quả đánh giá năng lực khử từ cao chiết lá ổi rừng Các nghiên cứu chỉ ra rằng cao phân đoạn ethyl acetate chứa tổng hàm lượng polyphenol cao nhất trong số các phân đoạn, dựa trên độ phân cực của dung môi, dẫn đến kết quả cao nhất trong thí nghiệm đánh giá năng lực khử (Nakamura và cộng sự).
Cao phân đoạn ethyl acetate từ lá ổi rừng có độ phân cực dung môi thích hợp, giúp hòa tan polyphenol hiệu quả Điều này dẫn đến việc cao này chứa tổng hàm lượng polyphenol cao nhất trong các phân đoạn và thể hiện khả năng khử mạnh mẽ nhất.
Theo nghiên cứu của Yang và cộng sự (2012), các phân tử có độ phân cực khác nhau sẽ hòa tan trong các dung môi có độ phân cực khác nhau Điều này dẫn đến việc các phân đoạn cao chiết từ lá ổi rừng sẽ chứa hàm lượng polyphenol khác nhau, từ đó thể hiện năng lực khử và khả năng kháng oxy hóa khác nhau.
Nghiên cứu này sẽ minh chứng rõ ràng về khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá ổi rừng thông qua việc đánh giá hiệu quả chống stress oxy hóa trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn.
4.1.1.2 Năng lực khử sắt của các sản phẩm vi bao Để đánh khả năng ứng dụng của sản phẩm vi bao khi so sánh với cao thô, thí nghiệm đánh giá năng lực khử trên các sản phẩm vi bao được tiến hành Từ đó, có thể đưa ra nhận xét sự khác biệt về khả năng chống oxy hóa của chúng so với cao thô cũng như tính ứng dụng khả thi của các mẫu cao chiết sau khi được vi bao Kết quả được thể hiện ở hình 4.2
Hình 4.2 Năng lực khử sắt của các sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
CE-cao thô (nồng độ 500mg/L); FDM-Sản phẩm vi bao sấy thăng hoa (nồng độ 10000 mg/L); SDM-sản phẩm vi bao sấy phun (nồng độ 10000 mg/L) c b a
CE SDM FDM Đ ộ hấp t hụ t ại 700nm (abs)
Kết quả nghiên cứu cho thấy năng lực khử của sản phẩm vi bao sấy thăng hoa và sấy phun cao hơn so với cao thô ở cùng nồng độ 500mg/L Cụ thể, tại bước sóng 700nm, năng lực khử của sản phẩm vi bao sấy thăng hoa, sấy phun và cao thô lần lượt là 1,085; 1,033 và 0,882, cho thấy khả năng chống oxy hóa vượt trội của sản phẩm vi bao cao chiết.
Nghiên cứu gần đây của Keerthana và cộng sự (2021) đã chỉ ra rằng sản phẩm vi bao chiết xuất từ lá cây bách hợp có khả năng khử cao hơn so với cao thô ở cùng nồng độ 1000mg/L Các tác giả nhận định rằng lớp vỏ bao bên ngoài của sản phẩm vi bao giúp bảo vệ các thành phần dễ bay hơi trong cao chiết, từ đó nâng cao hoạt tính khử sắt.
Các sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng của chúng tôi có khả năng khử mạnh mẽ hơn so với cao thô, giúp bảo quản tốt hơn các thành phần hoạt tính sinh học Điều này cho phép chúng có khả năng nhường điện tử cho các gốc tự do cao hơn và thể hiện hoạt tính chống oxy hóa vượt trội.
4.1.2 Khả năng kháng oxy hóa dựa trên mức độ tạo phức với ion đồng của các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
4.1.2.1 Khả năng tạo phức với ion đồng của các cao chiết lá ổi rừng
Tích tụ quá nhiều ion kim loại trong cơ thể có thể gây ra stress oxy hóa, dẫn đến sự gia tăng các gốc tự do (ROS) và tổn thương DNA, cùng với các triệu chứng viêm Quá trình trung hòa ion kim loại là cần thiết để ngăn chặn chúng tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử, từ đó bảo vệ cơ thể khỏi những tác hại này (Jomova và Valko, 2011).
Hoạt tính kháng viêm của các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng trên các mô hình in vitro và in vivo
4.2.1 Khả năng kháng viêm dựa trên hoạt tính ức chế biến tính albumin trứng gà
Ibuprofen (IBU) là một loại thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) thường được kê toa để giảm đau và viêm, hoạt động bằng cách ngăn ngừa sự biến tính protein, từ đó có thể thúc đẩy các bệnh tự miễn (Insel PA., 1996) Ngoài ra, quercetin, một flavonol, được biết đến như một chất chống viêm mạnh với khả năng chống viêm lâu dài (Read M.A., 1995; Orsolic N., 2004) Do đó, hai hợp chất này có thể được sử dụng làm đối chứng dương để tham chiếu kết quả và kiểm soát quy trình thí nghiệm.
4.2.1.1 Khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà của các cao chiết lá ổi rừng
Do sự đa dạng của các hợp chất hoạt tính sinh học trong nguyên liệu thực vật và tính chất hòa tan khác nhau của chúng trong các dung môi, nghiên cứu này tập trung vào lá ổi rừng Chúng tôi tiến hành sàng lọc và xác định các hợp chất hoạt tính sinh học, đồng thời đánh giá khả năng ức chế biến tính protein của cao chiết lá ổi rừng thô (ethanol) và các cao phân đoạn từ ethyl acetate và nước Mục tiêu là tìm hiểu sự thay đổi hoạt tính kháng viêm của các loại cao này trong các dung môi khác nhau.
Hình 4.7 Khả năng kháng viêm thông qua ức chế biến tính albumin trứng gà của các cao chiết lá ổi rừng
Khả năng ức chế biến tính của cao chiết lá ổi rừng được thể hiện rõ trong biểu đồ hình 4.7 Ở nồng độ 128 mg/L, khả năng ức chế biến tính albumin trứng giảm dần theo thứ tự từ cao phân đoạn ethyl acetate (31,407%), cao thô (26,884%) đến cao nước (18,719%) Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khả năng ức chế albumin trứng của các cao chiết lá ổi rừng so với đối chứng dương là thuốc Ibuprofen 600 mg/L (33,074%) và quercetin.
Sự biến tính protein là một trong những nguyên nhân gây viêm (Tsutomu và cộng sự,
Nghiên cứu cho thấy một số loại thuốc chống viêm có khả năng ức chế sự biến tính protein do nhiệt (Theodore và cộng sự, 1970) Kết quả cho thấy cao chiết lá ổi có tác dụng ức chế protein, góp phần vào khả năng kháng viêm của nó, điều này có thể được giải thích bởi hàm lượng polyphenol và flavonoid cao trong lá ổi rừng (Quang-Vinh Nguyen và cộng sự, 2022) Ngoài ra, Pace và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng các nhóm phân cực và liên kết hydro của chúng đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc protein, với các liên kết hydro của nhóm hydroxyl góp phần vào sự ổn định này.
Nhóm hydroxyl trong các hợp chất sinh học có trong lá ổi đã giúp ổn định albumin và ngăn chặn sự biến tính của nó trong các điều kiện thử nghiệm.
128 mg/L Ức chế biế n tí nh al bu m in(% )
Kết quả này tương tự với kết quả của Huỳnh Anh Duy và Nguyễn Thị Tuyết Nhi,
Nghiên cứu năm 2018 cho thấy cao phân đoạn ethyl acetate từ lá khế có khả năng ức chế biến tính albumin của huyết thanh bò với tác dụng kháng viêm mạnh nhất, tiếp theo là cao thô (ethanol) và cuối cùng là cao phân đoạn nước Lá ổi rừng cũng cho thấy khả năng kháng viêm tốt, chủ yếu nhờ vào sự tập trung của các hợp chất hoạt tính trong phân đoạn ethyl acetate Phân đoạn này chứa nhiều hợp chất có lợi như polyphenol, flavonoid và saponin, đã được chứng minh có khả năng kháng viêm hiệu quả (Rice Evans và cộng sự, 1996).
4.2.1.2 Khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà của sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng
Cao chiết lá ổi chứa nhiều hợp chất sinh học có lợi cho sức khỏe, nhưng dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ và ánh sáng (Qianyu Ye và cộng sự, 2018) Vi bao (Microencapsulation) là công nghệ giúp bảo quản các hoạt chất trong nguyên liệu thô và thực phẩm trong quá trình chế biến và bảo quản (Nitamani C và cộng sự, 2021) Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và ghi nhận khả năng ức chế biến tính albumin trứng gà của sản phẩm vi bao so với cao thô lá ổi rừng, như được trình bày trong hình 4.8.
Hình 4.8 Khả năng kháng viêm thông qua ức chế biến tính albumin của sản phẩm vi bao so với cao thô lá ổi rừng c a b
2048 mg/L Ức chế biế n tí nh al bu m in(% )0
Khả năng ức chế biến tính protein của bột vi bao và bột sấy thăng hoa tăng theo nồng độ từ 128 đến 4096 mg/L, với nồng độ tối ưu cho hiệu quả ức chế tốt nhất.
Hai loại bột vi bao đều có nồng độ 4096 mg/L, trong đó bột vi bao sấy thăng hoa có khả năng ức chế biến tính protein đạt 37,796%, còn bột vi bao sấy phun đạt 45,361% (Phụ lục 4.2) Đồ thị cho thấy khả năng ức chế biến tính protein của cao thô nồng độ 128 mg/L là 26,884%, trong khi nồng độ 2048 mg/L của sản phẩm vi bao cho phần trăm ức chế biến tính albumin cao hơn: 34,269% đối với bột vi bao sấy thăng hoa và 31,489% đối với bột vi bao sấy phun (Phụ lục 4.2) Kết quả cho thấy hoạt tính kháng viêm của cao chiết lá ổi rừng cao hơn khi được vi bao bằng hai phương pháp sấy phun và sấy thăng hoa.
Kết quả nghiên cứu của Keerthana và Chitra (2021) cho thấy chiết xuất từ lá cây bách hợp vi bao gói có khả năng chống oxy hóa, chống viêm và kháng khuẩn in vitro Cụ thể, sản phẩm vi bao gói cho thấy khả năng ức chế biến tính albumin huyết thanh bò đạt 61,7% ± 1,59%, cao hơn so với cao chiết thô với tỷ lệ 57,7% ± 1,7% ở nồng độ 1000mg/L.
4.2.2 Hoạt tính kháng viêm trên mô hình ấu trùng cá ngựa vằn gây viêm bằng CuSO 4
Mô hình gây viêm có thể được thiết lập bằng cách thêm CuSO4 vào môi trường nuôi ấu trùng cá ngựa vằn, dẫn đến việc tiếp xúc với đồng gây hoại tử tế bào lông ở đường bên của cá Hơn nữa, CuSO4 còn thúc đẩy sự di chuyển và tích tụ bạch cầu trung tính tại vùng viêm, từ đó kích hoạt phản ứng viêm cấp tính (Wittmann và cộng sự, 2012; Claudia và cộng sự).
Nghiên cứu này đã chọn CuSO4 để kích thích stress oxy hóa và gây viêm, sau đó xử lý ấu trùng bằng các cao chiết và sản phẩm vi bao cao chiết lá ổi rừng nhằm đánh giá khả năng kháng viêm của chúng.
4.2.2.1 Hoạt tính kháng viêm của các cao chiết lá ổi rừng
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để đánh giá khả năng kháng viêm của các cao chiết trên ấu trùng cá ngựa vằn, nhằm lựa chọn và xác định những vật liệu có khả năng kháng viêm tối ưu Thí nghiệm được so sánh với các chất đã được công nhận có hoạt tính kháng viêm như quercetin và thuốc kháng viêm Ibuprofen Kết quả khả năng kháng viêm của các cao phân đoạn được trình bày trong hình 4.9.
Hình 4.9 Khả năng kháng viêm của các cao phân đoạn lá ổi rừng
CE-cao thô, EAF-cao phân đoạn Ethyl acetate; WF-cao phân đoạn nước
Kết quả từ đồ thị hình 4.9 chỉ ra rằng nhóm ấu trùng cá đối chứng không được bảo vệ bởi các loại cao chiết có tỷ lệ viêm tăng dần theo thời gian, với 46,67% ấu trùng bị viêm sau 24 giờ (Phụ lục 5.1) Ngược lại, các mẫu ấu trùng cá đã được ngâm trong quercetin, các cao chiết và thuốc kháng viêm chỉ ghi nhận tỷ lệ viêm tăng nhẹ ở các thời điểm đầu và giảm mạnh sau 24 giờ.
Các nhóm ấu trùng ngâm cao phân đoạn cho thấy tỷ lệ viêm tăng nhẹ trong những giờ đầu, nhưng sau 24 giờ, tỷ lệ viêm giảm mạnh, với các nồng độ cụ thể là 15mg/L cho cao thô và cao phân đoạn nước, và 4mg/L cho cao phân đoạn ethyl acetate, lần lượt là 3,58%; 6,9% và 3,33% Đặc biệt, nhóm ấu trùng cá ngâm Quercetin ở nồng độ 2mg/L cho thấy khả năng kháng viêm cao, với tỷ lệ viêm giảm dần qua các giờ và đạt mức giảm đến 4,44% sau 24 giờ.