phân lập và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus amyloliquefaciens t3 nội sinh có khả năng kháng vi nấm corynespora cassiicola gây bệnh rụng lá cây cao su hevea brasiliensis

--- ∞0∞--- HUỲNH XUÂN THƯƠNG PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM Corynespora cassii

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian: từ tháng 10/2019 - 7/2020 Địa điểm:

• PTN Công nghệ Vi sinh trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh, cơ sở 3 Bình Dương, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương

• Viện Công nghệ Hóa học, Thạnh Lộc 29, Thạnh Lộc, Quận 12, TP Hồ Chí Minh.

ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens T3 được chứng minh có khả năng kiểm soát sinh học in vitro nấm C cassiicola Được cung cấp bởi PTN Công nghệ Vi sinh - Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

Chủng nấm C cassiicola gây bệnh trên cây cao su phân lập tại Thị xã Đồng

Xoài, tỉnh Bình Phước, được cung cấp bởi PTN Công nghệ vi sinh - Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh

− Thuốc nhuộm crystal violet, safranin O, lugol

− Các muối khoáng: Glucose, MgSO 4 , K 2 HPO 4 , NH 4 Cl, NaCl, nước cất, nước muối sinh lý 0,85 %

− Các dung môi : n-hexane, chloroform, dichloromethane và nước

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH

SVTH: HUỲNH XUÂN THƯƠNG Trang 27

− Cỏc loại micropipette và đầu tớp tương ứng (100 - 1000 àL, 20 - 200 àL)

− Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy vòng, que cấy trang, que cấy mốc

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dựa vào mục tiêu của nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau: Bố trí thí nghiệm

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Thu cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3

Khảo sát khả năng kháng C casiicola từ dịch ngoại bào

Nuôi cấy và thu dịch

Chiết dịch vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens T3 với các hệ dung môi n-hexane, chloroform, dichloromethane, methanol và nước

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng

Khảo sát khả năng kháng Corynespora casiicola bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kirby – Bauer

Khảo sát phân đoạn của cao chiết bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)

Thu nhận phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính sinh học kháng C casiicola bằng phương pháp sắc ký cột cao chiết

Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng kháng C casiicola

Khảo sát khả năng kháng vi nấm của các cao chiết thu được bằng phương pháp tự sinh đồ

2.3.1 Hoạt hóa chủng Bacillus amyloliquefaciens T3

Sau khi nhận giống B amyloliquefaciens T3, tiến hành cấy ria trên đĩa môi trường NA, ủ 37 o C / 24 giờ để kiểm tra hình thái đại thể, thử catalase và nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi thể

Sự khác biệt trong thành phần vách tế bào của vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm dẫn đến sự khác biệt trong khả năng hấp thụ thuốc nhuộm của chúng Dựa trên đặc điểm này, các vi khuẩn được chia thành hai nhóm chính, gồm vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2003).

− Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch Tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm, hơ nóng nhẹ phiến kính cho đến khô

− Phủ hoàn toàn vết bôi với crystal violet Để yên 1 - 2 phút rồi nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước

− Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây rồi lại rửa nhẹ nhàng với nước

− Tẩy cồn 96 o từ 15 - 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi với safrarin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước

− Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100

− Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

− Tế bào vi khuẩn gram (-) bắt màu hồng

− Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzym này là một trong những enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tính

Vi khuẩn kỵ khí tùy ý sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử cuối cùng trong hô hấp, tạo ra hydrogen peroside (H2O2) H2O2 là một phân tử có độc tính cao với tế bào, vì vậy vi khuẩn cần có cơ chế để khử độc chúng Catalase là một loại enzym giúp vi khuẩn thủy phân H2O2 thành nước (H2O) và oxy (O2), ngăn ngừa sự tích tụ của H2O2 trong tế bào, bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương.

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc đặt trên một phiến kính Nhỏ một giọt H 2 O 2

3 % lên sinh khối của khuẩn lạc trên phiến kính

Thử nghiệm: dương tính (+) có bọt khí do O 2 tạo ra âm tính (-) không có sủi bọt khí

Thử nghiệm đối chứng: (+) Staphylococcus aureus

2.3.4 Hoạt hóа củng Bacillus amyloliquefaciens T3

Chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens T3 được hoạt hóa bằng cách lấy một ít sinh khối từ thạch nghiêng trên môi trường NA vào bình serum chứa 20 mL môi trường NB, nuôi lắc ở 37 ℃/18 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút

Nhân giống: Bổ sung 10 % thể tích dịch khuẩn B amyloliquefaciens T3 sau khi hoạt hóa vào 100 mL môi trường tối ưu hóa tương ứng với vi khuẩn (glucose: 19,49g/L, NH 4 Cl: 8g/L, MgSO 4 : 0,76g/L, K 2 HPO 4 : 6,33g/L (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014) Nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở 30 o C trong 54 giờ

Lên men: Bổ sung 10 % thể tích dịch khuẩn giống cấp 2 vào môi trường tối ưu hóa tương ứng ở 30 ℃/54 giờ, độ pH được điều chỉnh ở mức pH bằng 7 (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014).

2.3.5 Xác định khả năng kháng Corynespora casiicola từ dịch ngoại bào chủng Bacillus amyloliquefaciens T3

Tiến hành khảo sát khả năng kháng C casiicola của dịch nuôi cấy chủng

B amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ingroff và cs.,

2.3.5.1 Cһuẩn bị dịcһ ngoạі bào vі kһuẩn

Chủng vi khuẩn sau khi được lên men, tiến hành ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phỳt thu dịch nổi, lọc qua màng lọc 0.2 àm Tiến hành thử hoạt tớnh khỏng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Shrivastava và cs., 2013)

− Môi trường NB, môi trường tối ưu và môi trường Potato dextrose agar (PDA) thử nghiệm được hấp vô trùng ở 121 ℃ trong 20 phút

− Môi trường được đổ đĩa Petri (đường kính 90 mm) với thể tích 15 mL

❖ Chuẩn bị dịch vi nấm C casiicola:

− Chủng vi nấm được cấy vào đĩa thạch PDA, ủ 4 - 5 ngày ở 37 ℃

− Đem hòa bào tử vào nước muối NaCl 0,85 % có bổ sung 0,05 % Tween 80 so cho đạt mật độ bào tử 1 - 2 × 10 6 CFU/mL (xác định bằng buồng đếm hồng cầu)

Công thức xác định mật độ bào tử vi nấm bằng buồng đếm hồng cầu:

Số tế bào / 1 mL mẫu = × ×

− a: Số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V mm 3 )

− 4000: Số qui đổi từ 1 ⁄4000 mm 3 thành 1 mm 3

− 1000: Số qui đổi từ 1 mm 3 thành 1 mL (1mL = 1000 mm 3 )

Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch vi nấm đã chuẩn bị, ép que vào thành ống cho ráo nước Sau đó, trải đều dịch trên mặt thạch, mỗi lần xoay hộp 60 độ Tiến hành trải dịch cho đến khi bề mặt thạch khô.

− Dùng dụng cụ đục lỗ, đục 4 lỗ thạch có đường kính 6 mm trong đĩa thạch (Balouiri và cs., 2016)

− Dựng micropipet hỳt 70 àL dịch chiết vi khuẩn bơm vào mỗi giếng

− Để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch

− Ủ 3 - 5 ngày ở 37 ℃, đọc kết quả vòng kháng

− Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0

⮚ Kết quả: Dịch ngoại bào, chủng B amyloliquefaciens T3 có khả năng kháng vi nấm thử nghiệm khi xung quanh lỗ xuất hiện vòng kháng (vòng trong không có sự hiện diện của vi nấm)

Hình 2.1 Kết quả vòng kháng nấm 2.3.6 Khảo sát khả năng kháng Corynespora cassiicola từ cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 qua các hệ dung môi khác nhau

2.3.6.1 Thu cao chiết chủng Bacillus amyloliquefaciens T3

Hoạt hóa chủng như mục 2.3.4, sau thời gian lên men tiến hành ly tâm ở

10000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch nổi Thu 100 ml dịch khuẩn tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi: n-hexane, dichloromethane, chloroform, methanol với tỉ lệ 1 : 1 Sau đó thu dung môi kèm với các thành phần kháng vi nấm

SVTH: HUỲNH XUÂN THƯƠNG Trang 33 có trong đó Đối với dung môi là nước, bổ sung dịch khuẩn và nước tỉ lệ 1 : 1, tiến hành cô quay và thu cao chiết

Tiến hành cô quay dịch chiết và dung môi ta thu được cao chiết thô Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi: n-hexane (69 o C) dichloromethane (39,6 o C), chloroform (61,2 o C), nước (100 o C) (Nguyễn Kim Phi Phụng., 2007)

Quy trình điều chế cao phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2.2

Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cаo chiết vi khuẩn B amyloliquefaciens T3 2.3.7 Thử khả năng kháng Corynespora cassiicola từ cao chiết Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Cao chiết thô sau khi được thu nhận ở mục 2.3.6.1 được hòa tan vào DMSO với tỉ lệ 10 mL DMSO 1 % và 1 mg cao chiết

Tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.5.3

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0

2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết chủng

Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp phа loãng

Dựa vào phương pháp MIC (Zhi - Kuan Xia và cs., 2016) Pha loãng dịch vi nấm ở các nồng độ khác nhau, thử nghiệm ở nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết với vi nấm gây bệnh

Dịch khuẩn sau khi lọc

Chiết lỏng - lỏng với n-hexane, dichloromethane,chloroform, methanol

Thu nhận cao chiết n-hexane, dichloromethane, chloroform, methanol

● Pha loãng dịch vi nấm với nước muối sinh lý 0,85 % có bổ sung 0,05

% Tween 80 sao cho đạt mật độ bào tử 1 - 2 × 10 6 CFU/mL (xác định bằng buồng đếm hồng cầu)

● Pha môi trường nuôi cấy vi nấm (PDA) hấp ở điều kiện 121 °C, 20 phút

● Để nguội ở nhiệt độ khoảng 45 – 50 °C, trộn cao chiết với môi trường nuôi cấy nấm (PDA) ở nhiều nồng độ khác nhau 0, 1/2 , 1/4, 1/8, 1/n,… rồi đỗ vào đĩa petri (90 × 15 mm)

● Sau đú bơm 20 àL dịch nấm đó pha loóng lần lượt vào giữa đĩa petri ở môi trường đã pha với các nồng độ khác nhau ở trên

⮚ Kết quả: Quan sát khả năng phát triển của vi nấm trên từng nồng độ pha loãng của cao chiết và môi trường PDA trong 4 - 5 ngày Kết luận nồng độ tối thiểu có khả năng ức chế vi nấm

2.3.9 Khảo sát phân đoạn của cao chiết từ chủng Bacillus amyloliquefaciens T3 bằng phương pháp sắc ký bản mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên tấm silica gel 60F254 (0,25 mm), (Merck., Đức) (Tabbene và cs., 2009)

Cao chiết thô sau khi thu được hòa tan với dung môi tương ứng 1/10

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

HOẠT HÓA CHỦNG

Kết quả hoạt hóa chủng B amyloliquefaciens T3 cho thấy: có khuẩn lạc điển hình của nhóm Bacillus, Gram dương có bào tử, catalase dương tính, kết quả trùng khớp với nghiên cứu trước của Nguyễn Văn Minh và cs, (2014) Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Kết quả hoạt hóа

Chủng Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể Khả năng sinh catalase

Khuẩn lạc trắng đục, bờ răng cưa, bề mặt bóng ướt, tâm nhô

Hình trực, xếp riêng lẻ, Gram +, có bào tử +

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể (A) và vi thể (B) của vi khuẩn B amyloliquefaciens

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG Corynespora casiicola TỪ DỊCH NGOẠI BÀO CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3

Dịch ngoại bào và nội bào của chủng B amyloliquefaciens T3 sau khi qua xử lý, tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng kháng C casiicola bằng cách đo đường kính vòng kháng Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.2

Bảng 3.2 Khả năng kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

B amyloliquefaciens T3 Đường kính vòng kháng vi nấm

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý ngһĩa

Hình 3.2 Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm bằng khuếch tán giếng thạch từ dịch ngoại bào chủng B amyloliquefaciens T3 (A) mặt trên của nấm, (B) mặt dưới của nấm

Dựa vào kết quả bảng 3.2 cho thấy dịch ngoại bào chủng

B amyloliquefaciens T3 tạo vòng kháng vi nấm C casiicola với đường kính 31,27 ± 0,16 Kết quả này tương tự với công trình nghiên cứu trước (Nguyễn Văn Minh và cs., 2014).

THU NHẬN CAO CHIẾT Bacillus amyloliquefaciens T3 TỪ CÁC HỆ

CÁC HỆ DUNG MÔI KHÁC NHAU Độ phân cực của các dung môi khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất khác nhau Để xác định được dung môi thích hợp cho việc tách chiết hợp chất kháng vi nấm của vi khuẩn B amyloliquefaciens T3, tiến hành nuôi vi khuẩn thử nghiệm trên môi trường lên men tối ưu và đem lọc lấy dịch vi khuẩn thử nghiệm Dịch vi khuẩn thử nghiệm được chiết bằng phương pháp chiết lỏng lỏng với 3 loại dung theo tỉ lệ 1:1: n-hexane, chloroform , dichloromethane, methanol và nước

Tiến hành cô quay thu lấy cao chiết Kết quả cao thu được với từng loại dung môi được trình bày trong bảng 3.3 và biểu đồ 3.1

Bảng 3.3 Kết quả khối lượng và hiệu suất thu hồi củа cаo chiết thu được với 5 loại dung môi Dung môi Thể tích

Số gam cao thu được sau cô quay

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý ngһĩa 5% qua phép thử Duncan

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng củа dung môi đến khối lượng cao chiết

Từ kết quả bảng 3.3 và biểu đồ 3.1, so sánh về khối lượng dung môi thu được với các dung môi khác nhau nhận ra rằng: dung môi cho lượng cao chiết cao nhất là

Me, Clo (m = 1,52 g, H = 1,52 %), dung môi cho lượng cao chiết thấp nhất là He ( m = 1,02 g, H = 1,02 %) Dựa vào kết quả trên tiến hành chọn dung môi Me để tiếp tục thực hiện chiết các hợp chất có trong dịch vi khuẩn B amyloliquefaciens T3.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG Corynespora cassiicola TỪ CAO CHIẾT Bacillus amyloliquefaciens T3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY - BAUER

CAO CHIẾT Bacillus amyloliquefaciens T3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY - BAUER

Từ 5 loại cao chiết B amyloliquefaciens T3 của 5 loại dung môi khác nhau được tiến hành khảo sát khả năng kháng C cassiicola bằng cách đo đường kính vòng vô trùng Kết quả được trình bày ở hình 3.4 và bảng 3.4

DichloromethaneChloroformMethanol n-HexanNước

Hình 3.4 Kết quả cao chiết B amyloliquefaciens T3 kháng C cassiicola

Chú thích: (A) mặt trên và mặt dưới của cao chiết vi khuẩn từ dung môi chloroform; (B) mặt trên và mặt dưới của cao chiết vi khuẩn từ dung môi dichloromethane; (C) mặt trên và mặt dưới của cao chiết vi khuẩn từ nước; (D) mặt trên và mặt dưới của cao chiết vi khuẩn từ dung môi n-hexan; (E) mặt trên và mặt dưới của cao chiết vi khuẩn từ dung môi methanol

Bảng 3.4 Kết quả vòng kháng C cassiicola củа 5 loại cаo chiết

Cao chiết Vòng kháng nấm (mm)

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý ngһĩa

Cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 thu được từ 5 loại dung môi, trong đó 4 dung môi có khả năng kháng C cassiicola Cao chiết từ dung môi Me có vòng kháng C cassiicola mạnh nhất (19,87 ± 0,11mm), cao chiết với Clo (19,76 ± 0,55 mm), cao chiết với Di (18,16 ± 1.19 mm) và W (15,43 ± 0,50 mm), He (0 mm) Theo Trịnh Thành Trung và cs., (2017) cao chiết vi khuẩn Bacillus velezensis cp

1604 không có hoạt tính kháng nấm khi được tách chiết bằng dung môi chloroform và hexane Tuy nhiên, theo nghiên cứu đã chứng minh cao chiết vi khuẩn từ dung môi Methanol có khả năng kháng C cassiicola, từ đó chọn cao chiết vi khuẩn từ dung môi Methanol để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT

Từ kết quả thí nghiệm thử khả năng kháng C cassiicola của cao chiết chủng

B amyloliquefaciens T3 từ 5 loại dung môi bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 được chiết từ 2 dung môi Clo, Me là có khả năng kháng C cassiicola mạnh nhất Do đó, tiến hành thực hiện phương pháp MIC để kiểm tra lại khả năng kiềm hãm sự phát triển C cassiicola của 2 cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 Kết quả thể hiện ở hình 3.5, 3.6 và bảng 3.5

Hình 3.5 Kết quả MIC củа cаo chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ dung môi chloroform

Hình 3.6 Kết quả MIC của cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ dung môi methanol

Bảng 3.5 Kết quả MIC củа cаo chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ dung môi chloroform, methanol

Chú thích: (-) vi nấm không mọc trên môі trường PDA

(+) vi nấm mọc trên môі trường PDA

Từ kết quả hình 3.5, 3.6 và bảng 3.5, nhận thấy cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 được tách từ các dung môi chloroform, methanol đều có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm C cassiicola

Qua kết quả của thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 2 mẫu cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 từ 2 dung môi khác nhau Mẫu cao chiết với chloroform ức chế 100 % nấm ở nồng độ 1/16, mẫu cao chiết với methanol ức chế

Trong nghiên cứu chiết xuất chất chống vi khuẩn từ nấm, nồng độ 1/32 cho hiệu quả cao nhất Dung môi methanol mang lại hiệu suất thu hồi cao hơn so với các dung môi còn lại, với tỷ lệ 1,52% Từ đó, nghiên cứu đã chọn chiết xuất vi khuẩn từ dung môi methanol để sử dụng trong sắc ký cột nhằm thu được đoạn chứa hoạt chất kháng nấm C cassiicola.

KHẢO SÁT PHÂN ĐOẠN CỦA CAO CHIẾT TỪ CHỦNG Bacillus

Bacillus amyloliquefaciens T3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC)

Cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 thu được từ mục 3.3, tiến hành thực hiện phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC), giải ly với hệ dung môi chloroform : methanol (60 : 40) Đọc kết quả dưới tia UV với bước sóng 254 nm hoặc phun dung dịch H2SO 4 10 % trong EtOH Kết quả thể hiện ở hình 3.7 và bảng 3.6

Hình 3.7 Sắc ký bản mỏng (TLC) cao chiết chủng B amyloliquefaciens T3 thông qua các dung môi dưới tia UV với bước sóng 254 nm

Bảng 3.6 Kết quả sắc ký bản mỏng (TLC) Dung môi

Số vết Hình dạng vết R f (cm)

Clo 2 Bầu dục, kéo dài có tâm 0,14

*Khi Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di chuyển bằng tốc độ của dung môi (Nguyễn Mạnһ Cường, 2011)

Dựa vào kết quả hình 3.7 và bảng 3.6 các chất trong cao chiết hiện lên trên bản mỏng của các cao chiết dung môi có vết tương đối khác nhau

Cao chiết với 2 loại dung môi trên đều hiện vết trên bản mỏng TLC Giá trị

R f cho thấy rằng các chất trong các cao chiết đều di chuyển được trong hệ dung môi giải ly chloroform : methanol tỉ lệ (60 : 40) Nên hệ dung môi chloroform : methanol phù hợp để tiến hành sắc ký cột cao chiết thu nhận phân đoạn các hợp chất có khả năng kháng C cassiicola ở bước kế tiếp

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI NẤM CỦA CÁC CAO CHIẾT THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP TỰ SINH ĐỒ

Từ kết quả của sắc kí lớp mỏng tiến hành khảo sát khả năng kháng vi nấm bằng phương pháp đặt tự sinh đồ Kết quả thể hiện ở hình 3.8

Hình 3.8 Kết quả tự sinh đồ (A) cao chiết vi khuẩn với dung môi methanol; (B) cao chiết vi khuẩn với dung môi chloroform

Dựa vào hình 3.8, các phân đoạn tách trên TLC có khả năng kháng vi nấm

C cassiicola, các tế bào tơ nấm không có khả năng mọc trên tất cả bề mặt thạch Từ kết quả tự sinh đồ tiếp tục khảo sát và thu nhận phân đoạn chứa các hợp chất có khả năng kháng C cassiicola ở các bước kế tiếp.

SẮC KÝ CỘT CAO CHIẾT

Từ kết quả kháng C cassiicola, MIC và TLC trên, cao chiết methanol được chọn là cao chiết để tiến hành sắc ký cột thu nhận phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng C cassiicola Sắc ký cột cao chiết methanol với các hệ dung môi sau:

- Hệ dung môi ethyl acetate : methanol với các tỉ lệ: (95 : 5), (90 : 10), (85 : 15), (80 : 20), (75 : 25) Để kiểm tra và thăm dò các chất trong từng phân đoạn thu được, tiến hành chấm sắc ký bản mỏng (TLC), thu được kết quả như sau:

Hình 3.9 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (95 : 5)

Sau khi phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi ethyl acetate : methanol (95 : 5), quan sát thấy sự xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Dựa vào đặc điểm hình dạng của các vết trên TLC, các phân đoạn 14, 15, 16 được gom thành một phân đoạn, trong khi phân đoạn 17, 18, 19 hợp thành một phân đoạn riêng biệt Tiếp đó, sắc ký cột được tiến hành để tách các chất có trong từng phân đoạn này.

Qua kết quả TLC từ phân đoạn hệ dung môi ethyl acetate : methanol (90 : 10) thấy có xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Dựa vào hình dạng vết trên TLC, tiến hành gom các phân đoạn từ 23, 24 26, 27, 28 thành một phân

SVTH: HUỲNH XUÂN THƯƠNG Trang 54 đoạn, phân đoạn 22 thành một phân đoạn Sau đó, tiến hành sắc ký cột để tách các chất có trong từng phân đoạn trên

Hình 3.11 Sắc ký bản mỏng (TLC) phân đoạn khảo sát thu được từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (85 : 15)

Qua kiểm tra phân đoạn bằng TLC, ta nhận thấy phân đoạn thu được từ hệ ethyl acetate : methanol (85 : 15) có xuất hiện các vết đẹp, rõ ràng thích hợp cho việc khảo sát các chất Dựa vào hình dạng vết trên TLC, tiến hành gom các phân đoạn từ 15,16,17,18,19,20,21 thành một phân đoạn Tiến hành khảo sát phân đoạn này qua sắc ký cột phân đoạn lần 2, để kiểm tra và thu nhận các chất riêng biệt từ phân đoạn trên

Qua kết quả TLC từ phân đoạn hệ dung môi ethyl acetate : methanol (80 : 20) thấy có xuất hiện các vết đậm nhạt và màu sắc khác nhau Phân đoạn 2, 3 các vết tương đương nhau nên gom thành một phân đoạn, phân đoạn 4, 5, 6, 7 gom lại thành một phân đoạn, phân đoạn 1 thành một phân đoạn riêng Sau đó, tiến hành sắc ký cột để tách các chất có trong từng phân đoạn trên

Sau khi phân đoạn TLC, mẫu lấy từ hệ dung môi ethyl acetate : methanol (75 : 25) ở phân đoạn 5, 6, 7 có các vết giống nhau nên được gom lại thành một phân đoạn Tiếp theo, sắc ký cột được sử dụng để tách riêng các hợp chất có trong phân đoạn gom đó.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG Corynespora cassiicola TỪ CÁC PHÂN ĐOẠN THU ĐƯỢC CỦA CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus amyloliquefaciens T3 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH KIRBY –

amyloliquefaciens T3 NỘI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN

Phân đoạn các hệ dung môi ethyl acetate: methanol được phân tách từ sắc ký cột Dựa trên hình dạng vệt TLC khác nhau của từng phân đoạn hệ dung môi, tiến hành kiểm tra khả năng ức chế C cassiicola Kết quả cho thấy rõ ở các hình 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18.

Hình 3.14 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 15, 17 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (95 : 5)

Hình 3.16 Khả năng kháng C cassiicola của các phân đoạn 18 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (85 : 15)

SVTH: HUỲNH XUÂN THƯƠNG Trang 57 ĐC

Hình 3.18 Khả năng kháng C cassiicola của phân đoạn 6 trong hệ dung môi ethyl acetate : methanol (75 : 25)

Cao chiết hệ dung môi ethyl acetate: methanol tỉ lệ (95 : 5) và (85 : 15) có phân đoạn 15, 17, 18 kháng C cassiicola cao nhất (18, 20 và 24 mm), cao chiết hệ

SVTH: HUỲNH XUÂN THƯƠNG Trang 59 dung môi ethyl acetate : methanol tỉ lệ (90 : 10) và (80 : 20), (75 : 25) có phân đoạn

22, 26, 2, 7 kháng C cassiicola nhưng không thể hiện rõ vòng kháng, phân đoạn 6 không có khả năng kháng C cassiicola Từ kết quả trên tiến hành chọn phân đoạn

15, 17, 18 tiếp tục tinh sạch chất có hoạt tính kháng C cassiicola.

PHÂN LẬP, TINH CHẾ HỢP CHẤT THU ĐƯỢC

Dựa vào kết quả kháng C cassiicola của các phân đoạn thu được, tiếp tục tiến hành phân lập và tinh chế hợp chất thu được bằng phương pháp sắc ký cột Kết luận như sau:

Sắc ký cột cao A thu được cao A1 Tiếp tục sắc ký cột cao A1 với hệ dung môi choloroform : methanol tỉ lệ (80 : 20) thu được phân đoạn A1’ và A2’

Sắc ký cột cao C thu được cao C1 Tiếp tục sắc ký cột cao C1 với hệ dung môi choloroform : methanol tỉ lệ ( 70 : 30) thu được phân đoạn C1’,C2’,C3’

Hình 3.19 Sắc ký bản mỏng (TLC) các phân đoạn thu được A1’, A2’, C1’, C2’ và C3’

Từ kết quả sắc ký bản mỏng (TLC) trên, tiến hành gom các phân đoạn giống nhau thành một phân đoạn và chọn ra phân đoạn phù hợp để thực hiện các bước phân lập và tinh chế hợp chất

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG Corynespora cassiicola

Sắc ký cột thu được chất BA01, BA02, BA03, BA04 dưới dạng bột màu trắng Hấp thu UV cho vết chất BA01 màu tím và BA02, BA03, BA04 màu đen ở

Hình 3.20 Các chất BA01, BA02, BA03, BA04 dưới dạng bột

Hình 3.21 Các chất BA01, BA02, BA03, BA04 được soi dưới UV 254 nm

Sau quá trình giải phổ kết quả cho thấy các chất BA01, BA02, BA03 lẫn tạp chất, chất BA04 xác định được phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm), Phổ

Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 13 C và 1 H–NMR củа BA04 và hợp chất so sánh đo trong

Vị trí C BA04 N-(indol-3-ylacetyl)-DL- aspartic acid

1 H–NMR δ ppm (Số H, dạng mũi, J =

1 H–NMR δ ppm (Số H, dạng mũi, J

Chất BA04 được xác định cấu trúc như sau:

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm) của BA04 cho các tín hiệu: 4 proton methin vòng thơm ở δH 7,56 (1H, d, J = 7,5, H-4), 6,98 (1H, ddd, J = 1,0, 7,0 và 8,0, H-5), 7,06 (1H, ddd, J = 1,0, 7,0 và 8,0, H-6), 7,34 (1H, d, J = 8,0, H-7), giúp xác định BA04 có vòng thơm thế 1,2; 1 proton methin vòng thơm ở δH 7,20 (1H, d, J = 2,5, H-2), giúp xác định BA04 có 2 vòng thơm Ngoài ra, còn có 1 proton methin kề nitơ ở δ H 3,43 (1H, dd, J = 4,0 và 9,0, H-α), 2 proton methylen ở δH 2,95 (1H, dd, J = 9,0 và 15,0, H-βa) và 3,30 (1H, dd, J = 3,5 và 15,0, H-βb), 1 proton amid bậc 2 ở δ H 10,87 (1H, s, NH)

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm) cho thấy BA04 có 11 carbon, trong đó có 8 carbon của 2 vòng thơm: 4 carbon methin vòng thơm, 1 carbon bậc bốn vòng thơm kề nitơ ở δ C 136,3 (C-8), 1 carbon methin vòng thơm kề nitơ ở δ C 123,9 (C-2), 2 carbon bậc bốn vòng thơm ở δ C 109,7 (C-3), 127,2 (C-9), giúp xác định BA04 có khung indole-3-yl và dây nhánh 3 carbon gồm: 1 carbon methylen ở δ C 27,1 (C-β), 1 carbon methin kề nitơ ở δ C 54,8 (C-α) và 1 carbon carbonyl ở δ C 169,8 (COOH)

Từ các dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR và so sánh với tài liệu (Antolíc et al., 2001), cho thấy rằng BA04 là 3-(2-aminopropanoic acid-3-yl)indole [3-(indole-3- yl)-2-aminopropanoic acid] Đây là báo cáo đầu tiên về khả năng chống nấm C cassiicola của hợp chất 3- (2-aminopropanoic acid-3-yl)indole có nguồn gốc từ sinh học Theo nghiên cứu (Cui và cs., 2017) hợp chất chất 3-(2-aminopropanoic acid-3-yl)indole hiển thị hoạt tính kháng nấm, chống lại T viride, Colletotrichum gloeosporioides, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Alternaria longipes, Rhizoctonia solani Kühn và Paecilomyces variotii Hợp chất này cũng được tìm thấy ở chủng Bacillus subtilis (Elkahoui và cs., 2013)

Các hợp chất khung sườn indole cũng được báo cáo như 2 amino-3-(1H- indol-2-yl)propanoic acid đã được phân lập từ loài B amyloliquefaciens (Cui và cs., 2017), bacilsubteramide A và N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]acetamide phân lập từ loài

Hình 3.22 Cấu trúc củа hợp chất BA04

Hình 3.23 Vòng kháng C cassiicola củа hợp chất BA04 ĐC

Tiêu đề	Phân Lập Và Tinh Chế Các Hợp Chất Có Hoạt Tính Sinh Học Từ Cao Chiết Chủng Bacillus Amyloliquefaciens T3 Nội Sinh Có Khả Năng Kháng Vi Nấm Corynespora Cassiicola Gây Bệnh Rụng Lá Cây Cao Su (Hevea Brasiliensis)
Tác giả	Huỳnh Xuân Thương
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Văn Minh, TS. Nguyễn Tấn Phát
Trường học	Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	106
Dung lượng	3,14 MB