Nội dung chính của bài viết trình bày kết quả nghiên cứu vi nấm nội sinh cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) có khả năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase. Để hiểu rõ hơn, mời các bạn tham khảo chi tiết nội dung bài viết này.
Nghiên cứu vi nấm nội sinh Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) có khả sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase Lê Thị Minh Thành 1,*, Hoàng Thị Hồng Anh1, ng nh ùng 1, ồng hư c1 n hị hị uy n1, uy n2 Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội ọ ệ ọ ộ TÓM TẮT Enzyme β-galactosidase khai thác công nghiệp ch i i si h h gd g l h v c hác hau hư y t th c phẩm c g ghệ si h h c T o g ghi l t c y th o dược Thạch tù g ă g cưa h c u ố Việt s g l c h ă g si h tổng hợp enzyme β-galactosidase K t qu ch ng c kh ă g tổng hợp β-galactosidase t o g đ ch đạt l cao h U ch Aspergillus niger T g T gT v 0,36 IU/ml) Hai ch y, ch ch g vi a được c hoạt tính enzyme g đ d h da h l Fungal sp Tsp5v Từ khóa: Vi n m n i sinh, Thạch tù g ă g cưa β-galactosidase * Tác gi chính: Lê Th Minh Thành a chỉ: Viện Cơng nghệ sinh h c, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà N i iện thoại: 0979769703 Email: minhthanh.ibt@gmail.com I ẶT VẤN Ề Theo thống kê có kho ng 70% dân số th giới gặp tình trạng b t dung nạp lactose hay g i thi u ă g chuy n hóa lactose s thi t h t enzyme β-galactosidase niêm mạc ru t non l h hư g h g h tới s c h e gư i d lactase m t enzyme chính, có tiề [1] β-galactosidase g i ă g đá g ngành công nghiệp ch bi n th c phẩm t liệu β-galactosidase l enzyme xúc tác cho ph n ng th y phân lactose thành β-D-galactose v α-D-glucose ph n ng galactosyl chuy n hóa gốc βD-galactosyl c a lactose tạo galacto-oligosaccharides (GOS) [2] GOS m t loại oligosaccharides ổ su g t o g ch ă g có tác d ng nâng cao s c kh e g h i gi th c hẩ gư i d h th c hẩ ch c g chố g lại t số ệ h d ch Việc bổ sung GOS với oligosaccharides khác làm gi guy c ắc bệ h u g thư nh t l u g thư u t k t, b o vệ hệ tiêu hóa giúp c i thiện bệnh đư ng ru t GOS giúp gi lượng cholesterol máu, nh th c đẩy s phát tri n c a vi khuẩn axit lactic, lượng cholesterol gi m làm gi guy c mắc bệnh tim mạch x vữa đ ng mạch Enzyme β-galactosidase t nhiên c loại trái t số hiều hạ h h đ o i tạ g đ ng v t khác [3] Tuy nhiên việc chi t xu t enzyme t nguồn không hiều đ c th cung c p nguyên liệu t hi cho ngành công nghiệ dược th c phẩm, bên cạ h đ chi hí s n xu t cũ g đ i h i cao Do đ hướng nghiên c u tr gt đ chuy n sang s n xu t enzyme chi phí th p t vi sinh v t vi huẩn, n m men vi n m So với n m men vi khuẩn, β-galactosidase chi t xu t t vi t hi thư thư g l e zy goại bào ch u nhiệt g c hoạt tính cao v nguồn nguyên liệu dễ ki m sốt, có th thu lượng lớn với th i gia chi t xu t t g ưa thích v thư h h t v t số ch g vi thu t đ gi β-galactosidase thư g hư Aspergillus fonsecaeus, A oryzae, A niger, Rhizomucor pusillus, Chaetomium thermophile, Thermomyces lanuginosus [3-5] Vi n m n i sinh Thạch tù g ă g cưa Huperzia serrata) đ c tổ g hợ hoạt ch t h ă g há g u e zi e h tợ h gt g ốl c ệ h ối loạ t í hớ v h lzhei e v c t số vi si h v t g y ệ h cho gư i hư E coli, S.aureus S typhimurium [6] Tại Việt Nam, Thạch tù g ă g cưa (TTRC) phát Cai) v ạt g) v thu c da h sách "đ " t o g Chư tồn phát tri n nguồn gen quý hi m thuốc c a Việt a gt hoạt tính β-galactosidase thu nh ƯƠNG h ghi Sapa (Lào c ub o hư g chưa quan tâm nghiên c u khai thác ng d ng Nghiên c u ước đ u n ch II ă g si h v đá h giá được t ch ng vi n m n i sinh TTRC Việt Nam Á NG IÊN CỨU 2.1 Vật liệu Các ch ng vi n m n i si h phân l p t TTRC phân bố ồng - Việt Nam B sưu t p Vi n m c a Trung tâm Giống B o tồn nguồn gen Vi sinh v t - Viện Công nghệ sinh h c - Viện Hàn lâm Khoa h c Công nghệ Việt Nam 2.2 hư ng pháp 2.2.1 Phương pháp hoạt hóa thu g y tùy ch g i t ng thạch D i o g giữ t o g glyce ol Ho t hóa chủng: Các ch sa g đ a peptri ch a h hi t nấm t a đ thu C c y chuy n sợi n m otato dext ose aga ) v hi t c a ch to g - l g y tùy ch c y chuy n sang bình 28oC i t ng PDB (potato dextrose broth), nuôi lắc 150 rpm, g yt - g Nhân ni thu dịch trích sinh kh i nấm: Các sợi n m thu tam giác ch a 28oC t u i 6000 vịng/phút, thu d ch trích sinh khối ni m 2.2.2 Phương pháp sàng lọc chủng nấm có hoạt tính enzyme β-galactosidase X-gal hịa tan DMSO nồ g đ 20 mg/mL (b o qu n tối 20ᵒC) Gạt 50µl ch t th X-gal bề mặt đ a thạch m ch ng vi n m n i si h đ gal, nuôi t h l t i t ng PDA C y ch m i t ng thạch đ a c th X- m 28ᵒC 3-10 ngày, ch ng n m n i sinh tạo th ch ng có kh nhiệt đ - u xa h t đ a ă g si h tổng hợ e zy e β-galactosidase 2.2.3 Phương pháp xác đ nh hoạt độ enzyme β-gala tosi ase hất ONPG (Ortho-nitrophenyl-β-d-galctopyranoside) Hoạt tính β-galactosidase xác đ h theo hư Tr n 0,2 ml d ch trích sinh khối n m với g há c a Reczey v c l c ch t O d ch đệm sodium acetate 0,1M, pH 4,5 H n hợ nm M t đ G chuẩn b dung 50oC phút D ng y ph n ng lại cách bổ sung ml dung d ch Na2CO3 g s [7] đo h p th ước sóng 420 v hoạt tí h đ h gh a l lượng enzyme c n thi t đ gi i phóng µmol ONP (O- nitrophenol) m t phút điều kiện phân tích xác 2.2.4 Phương pháp ph n loại vi nấm ền th ng: Theo khóa phân loại vi n m [8, 9] - định danh sinh học phân tử: Nghiề sợi D g tách tổ g số ằng kit G-spin Total DNA extraction (INTRON, Hàn quốc) Vùng gen ITS1-5,8S- TS khu ch đại ph n CCGTAGGTGAACCTGCGG– ’) v phư to g it l TS it The o Scie tific) TS ’– ’–CCTCCGCTTATTGATATGC– ’) theo g há c a White v c ng s [10] S n phẩ CR u ificatio ng PCR với cặp mồi oạ ge CR tinh bằ g Ge e ET TS -5,8S- TS phân tích t đ ng bằ g áy đ c trình t đ ng AEI PRISM@ 3700 Genetic Analyzer gen t TS phân tích ph n mềm BioEdit so (ThermoFisher Scientific, M ) Trình t sánh với liệu NCBI bằ g chư EG ph n mề Các t l y t c s liệu Ge Ba gt hB h t ge tư ằ g ST C y hát si h xây d g đồ g với t h t ge c a ch ng n h h ClustalW t o g chư hát si h ge xây d ng bằ g việc s d g h h giá tr Bootstrap lặp lại 1000 l n Mơ hình tham số (K2+G+I) s d g ằ g gt h axi u eg lig C y i ehood ) với i u a v giá t t bi n g đ ước tính kho ng cách ti n hóa lồi III KẾT QUẢ 3.1 Sàng lọc chủng vi nấm có hoạt tính enzyme β-galactosidase oạt h a v h u i si h hối c a 45 ch ng vi đại diện cho nhóm hình thái khuẩn lạc B sưu t p vi n m n i sinh phân l p t TTRC phân bố a Việt ch galactosidase t g ti itư h h xác đ nh h u it h ch gT v T 5v c th có kh i t ng X-gal có sắc tố màu xanh v phân l p t thân TTRC Khi i t ng có ch t th X-gal, ch ch ng T enzyme β- g thạch c X-gal K t qu t o g đ xác đ h ch ng sinh tổng hợp β-galactosidase khuẩn lạc nuôi c y t da tr i (Hình 1) c ă g sinh tổ g hợ g gT c đ bắt u đ m v đồ g ă g si h tổng hợ β-galactosidase cao h Hình Khuẩn lạc chủng L28.1 v L5v nuôi cấy tr n môi trường thạch L 28.1 T L5v có bổ sung chất thị X-gal 3.2 Xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase tr n c chất ONPG Xác đ nh hoạt đ enzyme β-galactosidase c a d ch chi t ch ng n t c ch t ONPG cho th y, ch gT 1,92 IU/ml cao g p 5,3 l n so với ch ng T T v T 5v 28.1 cho hoạt tính enzyme β-galactosidase đạt 5v đạt 0,36 IU/ml (B ng 1) Bảng Hoạt tính enzyme β-galactosidase chủng vi nấm nghi n cứu TT Chủng T T Hoạt tính enzyme (IU/ml) 1,92 5v 0,36 3.3 ịnh danh chủng nấm có khả sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase Bằ g hư g há h n g theo đặc màu sắc, hình thái, s T c huẩn lạc h u sắc đặc m hình thái ni c y; há h vách gă c a khuẩn ty, bào t … cho th y, ch ng u đe ề mặt dạng xốp; khuẩn ty phân há h c vách gă ; t i bào t có cuống, chu i bào t tr n tạo thành t th bình hợp thành hình bơng n m 5v khuẩn lạc m c h Ch ng T gă v h g si h gc đối, màu vàng, khuẩ ty ích thước to có vách o t T k t qu nh n g s ch gT thu c chi Aspergillus ch ng Tsp5v thu c nhóm n m b t th khơng sinh bào t (Hình 2) a b Hình Hình ảnh khuẩn lạc vi hình thái chủng Bằ g hư g há CR h mồi ITS1 ITS4 đ thước ho g c tích t h t vùng rADN - ITS c a ch ng vi n m với cặp hu ch đại đoạn gen ITS1-5,8S-ITS4 c a ch ng c hư tí h tố theo l thuy t (Hình 3) t o g đ ch - ích thước vù g ITS1-5,8S-ITS4 l 608 bp ch ng T chi u liệu nguồn gen g c a ch gT c đ tư 5v có m c tư t ge c a ch S h g ge CB gT ích 28.1 5v 630 bp So sá h đối t u cho th y vù g ITS1-5,8S-ITS4 g đồng cao so với ch ng Aspergillus niger SF58 đ dài đoạn so sánh 100%, m c đ tư t ch ng T L28.1 (a) T L5v (b) g đồng 99% nên xác đ nh thu c g đồ g ≤ v c đ d i đoạ so sá h ≤ A niger Trình so với trình g đối chi u GenBank Fungal sp., Fungal endophyte s v Fungal sp CMU27 xác đ h thu c Fungal sp Cây phát sinh phân loại lo i xây d ng thông qua s so sánh phân tích trình t nucleotide ch ng vi n m với lo i tư ngân hàng GenBank (Hình 4) Ch ch ng A niger; ch ng T đạt Theo đ Fungal sp T ch gT g đồng loài n t c s liệu 28.1 có hệ số Boost a đạt 100% nhóm với 5v thu c nhóm với ch ng Fungal sp có hệ số Boostrap gT đ nh danh A niger T v ch ng T 5v 5v M 600 bp Hình K t điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% (Gi ng M – Marker ADN, –T –T v) ình Cây phát sinh phân loại chủng vi nấm v i lo i tư ng đồng dựa phân tích trình tự vùng ITS1– 5,8S–ITS2 IV BÀN LUẬN Enzyme β-galactosidase thu nh n t nhiều nguồn vi sinh v t hác hau T o g đ nguồn enzyme cơng nghiệ tách chi t t lồi ch y u hư n m mốc Aspergillus sp n m men Kluyveromyces sp [1] Mặc dù loài vi sinh v t hác hau đ khai thác đ s n xu t β-galactosidase hư g β-galactosidase t n m mốc đặc biệt quan tâm enzyme tổng hợp ngoại bào có kh ă g ch u nhiệt [3] Việc l a ch n ch t phù hợp với vi sinh v t cho ă g su t e zy e cao h thu t x lý hiệu qu y u tố quy t đ nh chi phí s n xu t enzyme; enzyme ngoại oc gh a i h t chi phí s n xu t phát sinh t k thu t đ chi t xu t enzyme th p so với enzyme n i bào Trên th giới Việt Nam đ c β-galactosidase t số nghiên c u tách chi t thu nh t n m mốc theo đ ch ng R pusillus phân l p t nguồn ch t th i công nghiệp th c ă g si h tổng hợ β-galactosidase với hoạt tính enzyme đạt 2,14 IU/ml [3]; phẩm có kh ại h c Bách Khoa Hà N i ch ng Aspergiullus oryzae t phịng thí nghiệm Hóa sinh - cho hoạt tí h β-galactosidase cao t 70,3 - 307,5 mU/g [11] Các ghi si h th c v t si h β-galactosidase Việt a l chưa c c c u vi g ố Nghiên c u m t ph n trình nghiên c u tìm ki m liên t c c a t ch si h c y TTRC Việt hướ g tới c th a gd hằ t số hợp ch t sinh h c tiề tìm gto g t số g h i g vi i ă g c a ch g - công ghiệ v y dược Việt Việc xác đ h ch ng vi n m n i sinh t TTRC Việt Nam A niger T ch ng Fungal sp T ước đ u g h ổ su g nguồn nguyên liệu tiề g đồ g gi a 28.1 ă g si h tổng hợp enzyme β-galactosidase goại 5v có kh ă gto gs h g chố g o xu t guồ enzyme t nhiên h c v ngành công nghiệp dược v ch bi n th c phẩm t o g tư cao s c h e c g g lai hằ g t số ệ h t t V KẾT LUẬN T 45 ch ng vi n m n i si h phân l p t Thạch tù g ă g cưa h g Việt a đ n ch ch ng A niger T ă g si h tổng hợ e zy e β-galactosidase goại kh nguyên liệu cho nghiên c u ti ố 28.1 Fungal sp.T l 5v có o Các ch ng nguồn theo hướng tới nghiên c u tách chi t thu nh galactosidase có th ph c v ngành công nghiệ dược ch i β- th c phẩm v sữa Việt a Lời cảm n: Nghiên c u yl Chư B gt v Chư h gt C - t h t u c a đề t i hoa h c C h đ o tạo thạc s T C g ghệ Việ C - ) - g ghệ si h h c ch t g ại h c uốc t Glasgow Vư g uốc h TÀI LIỆU THAM KHẢO Husaim Q β-galactosidases and their potential applications: a review Critical Reviews in Biotechnology, 2010; 30 (1): 41-62 Toru N and Teruo A Beta Galactosidases, enzymology University Sendai and Tokyo; 199: 1291-1305 solatio a d sc ee i g of fu gal st fo β- Panesar PS, Kaur R, Singh RS Galactosidases production World Academy of Science, Engineering and Technology International Journal of Nutrition and Food Engineering, 2016; 10 (7) Sen S, Ray L, Chattopadhyay P Production, purification, immobilization, and cha acte izatio of a the osta le β-galactosidase from Aspergillus alliaceus Appl Biochem Biotechnol, 2012; 167: 1938-1953 El-Gindy A, Ibrahim Z, Aziz H ove e t of ext acellula β- galactosidase production by thermophilic fungi Chaetomium thermophile and Thermomyces lanuginosus Australian J Basic Appl Sci, 2009; 3: 1925-1932 Yang YH, Yang DS, Li GH et al Antibacterial diketopiperazines from an endophytic fungus Bionetria sp Y1085 The Journal of Antibiotics, 2019 Reczey K, Stalbrand H, Hahn-Hegerdal B, Tijernal F yceliaassociated β- galactosidase activity in microbial pellets of Aspergillus and Penicillium st s” Appl Microbiol Biotechnol, 1992; 38: 393- 397 Bùi Xu ồng Nhóm n m Hyphomycetes Việt Nam Nhà xu t b n Khoa h c K thu t 1984, t p I Ainsworth GC et al Introduction and keys to higher taxa In The Fungi, An Advanced Treatise Academic Press Newyork and London, 1973; Vol IVA 10 White TJ, Bruns T, Lee S, Talor J Amplicfication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic In PCR Protocols: A guide to methods and applications ed, 1990; 315-322 11 ặng Th Thu, Nguyễ Vă Cách Bùi Th H i Hòa Tuy n ch n nghiên c u điều kiện lên men sinh tổng hợp β-galactosidase t ch ng n m mốc Aspergillus oryzae Tạp chí Khoa h c Công nghệ, 2007; 45(1): 23-31 Study on β-galactosidase production of endophytic fungi from Huperzia serrata in Vietnam Le Thi Minh Thanh1,*, Hoang Thi Hong Anh1, Duong Anh Tung1, Do Thi Tuyen1, Man Hong Phuoc1, Ha Thi Quyen2 Institute of Biotechnology University of Engineering and Technology The e zy e β-galactosidase has many applications in biotechnology, pharmaceuticals and food processing industries In the present study, 45 endophytic fungi isolated from H serrata plants in a Do g Viet a we e sc ee ed thei ote tial i β-galactosidases enzyme production Two strains TDL5v and TDL28.1 were capable of producing β-galactosidases enzyme Among, TDL28.1 strain was fou d to e the active st oduci g a co side a le a ou t of β- galactosidase (1,92 IU/ml), which was considerably higher than that of TDL5v strain (0,36 IU/ml) Based on their morphological characteristics and sequence analysis of the internal transcribed spacers (ITS1-5.8S-ITS2), strains were identified as Aspergillus niger TDL 28.1 Fungal sp Tsp5v Keywords: Endophytic fungi, Huperzia serrata, β-galactosidase ... enzyme β-galactosidase đạt 5v đạt 0,36 IU/ml (B ng 1) Bảng Hoạt tính enzyme β-galactosidase chủng vi nấm nghi n cứu TT Chủng T T Hoạt tính enzyme (IU/ml) 1,92 5v 0,36 3.3 ịnh danh chủng nấm có. .. tâm enzyme tổng hợp ngoại bào có kh ă g ch u nhiệt [3] Vi? ??c l a ch n ch t phù hợp với vi sinh v t cho ă g su t e zy e cao h thu t x lý hiệu qu y u tố quy t đ nh chi phí s n xu t enzyme; enzyme. .. lọc chủng vi nấm có hoạt tính enzyme β-galactosidase oạt h a v h u i si h hối c a 45 ch ng vi đại diện cho nhóm hình thái khuẩn lạc B sưu t p vi n m n i sinh phân l p t TTRC phân bố a Vi? ??t ch galactosidase