Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong

Mục đích của nghiên cứu Tuyển chọn và nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β- galactosidase từ sáp ong là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic sinh βgalactosidase cao, dùng trong các chế phẩm probiotics, góp phần sản xuất ra sản phẩm sữa có hàm lượng lactose thấp sao cho mọi người đều có thể sử dụng được.

KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN LACTIC SINH β- GALACTOSIDASE TỪ SÁP ONG Nguyễn Thị Vân, Lớp K60B, Khoa Sinh học GVHD: TS Trần Thị Thúy Tóm tắt: Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn hữu ích, dùng chủ yếu chế phẩm probiotics để cải tạo khu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật ni Nhằm mục đích tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme β- galactosidase ứng dụng tạo chế phẩm probiotics, chủng vi khuẩn lactic LT12 phân lập tuyển chọn từ sáp ong ruồi (Apis andreniformis) tự nhiên tỉnh Điện Biên Chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả sinh enzyme β-galactosidase cao ổn định, phổ kháng khuẩn rộng, ức chế vi khuẩn G+ (Bacillus sp.), vi khuẩn G(Salmonella sp and E coli) Chủng LT12 sinh enzyme β- galactosidase nội bào, hiệu suất sinh enzyme cao sau 36 nuôi cấy tĩnh (đạt 0,45 IU/mL) 30ºC môi trường MRS dịch thể Enzyme β-galactosidase từ chủng có hoạt tính tối ưu 30°C, pH Nghiên cứu thay 25 – 50% (v/v) môi trường MRS dịch thể nước chiết bắp cải, thu hoạt tính enzyme khả quan (0,3 – 0,37 IU/mL) Do vậy, nước chiết bắp cải sử dụng để thay phần môi trường MRS để giảm chi phí sản xuất Từ khóa: β-galactosidase, vi khuẩn lactic, sáp ong, probiotics, lactose I MỞ ĐẦU Sữa loại thực phẩm giàu protein khoáng chất, đóng vai trị quan trọng chế độ dinh dƣỡng lứa tuổi Khoảng 75% dân số giới, có khoảng 46% ngƣời độ tuổi 50 trở lên, gặp tình trạng bất dung nạp lactose hay cịn gọi thiểu chuyển hóa lactose (khi uống sữa, xuất hiện tƣợng đầy hơi, chƣớng bụng, nôn, tiêu chảy) Lactose (β-D-galactopyranosyl-(1-4)-α-D-glucopyranose) loại đƣờng đôi (disaccharide) có sữa hầu hết động vật có vú Sau sử dụng sữa, lactose đƣợc enzyme  -galactosidase ruột non ngƣời xúc tác thủy phân thành glucose galactose Khả tổng hợp β-galactosidase ngƣời bị dần qua tuổi cai sữa Kết đại đa số ngƣời trƣởng thành ngƣời già giới mắc bệnh thiểu chuyển hóa lactose Vì vậy, sản phẩm sữa cho ngƣời khơng hấp thụ đƣợc lactose thƣờng phải đƣợc xử lí với enzyme β-galactosidase β-galactosidase enzyme đƣợc ứng dụng nhiều ngành công nghiệp chế biến nhƣ nghiên cứu sinh học phân tử, đặc biệt cơng nghiệp sữa Enzyme β-galactosidase đƣợc thu nhận từ động vật, thực vật nhƣ vi sinh vật Trong đó, β-galactosidase đƣợc sản xuất từ vi khuẩn lactic có suất hoạt tính cao, ổn định hẳn so với enzyme từ động vật thực vật Xuất phát từ thực tế trên, vào khả nghiên cứu sở đề xuất thực đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase từ sáp ong” Mục đích nghiên cứu tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic sinh βgalactosidase cao, dùng chế phẩm probiotics, góp phần sản xuất sản phẩm sữa có hàm lƣợng lactose thấp cho ngƣời sử dụng đƣợc 147 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 II NỘI DUNG Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sáp ong - Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh β-galactosidase cao - Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh tổng hợp β-galactosidase từ chủng vi sinh vật tuyển chọn Kết nghiên cứu 2.1 Kết phân lập Từ mẫu sáp ong đƣợc thu địa điểm khác nhau, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic, 17 chủng nấm men chủng vi khuẩn có bào tử 2.2 Kết tuyển chọn Từ 61 chủng vi khuẩn lactic phân lập đƣợc, tiến hành tuyển chọn sơ chủng có khả sinh enzyme β-galactosidase thị X-gal Kết tuyển chọn đƣợc 12 chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme β-galactosidase: LT27, LT28, LT32, LT45, LT48, LT10, LT15, LT24 LT12, LT13, LT14, LT31 Căn vào thời gian xuất màu xanh khuẩn lạc, để tiến hành xác định hoạt độ enzyme -galactosidase chủng có hoạt tính cao chất ONPG (Bảng 1) Bảng Hoạt độ enzyme -galactosidase tổng số chủng tuyển chọn Tên chủng IU/mL LT10 0,04 LT12 0,26 LT13 0,13 LT14 0,13 LT31 0,23 LT24 0,08 Trong số chủng trên, chủng vi khuẩn lactic LT12 có hoạt tính enzyme βgalactosidase mạnh Vì vậy, chọn chủng cho nghiên cứu 2.3 Xác định vị trí enzyme β-galactosidase tế bào chủng vi khuẩn lactic LT12 Bảng Vị trí enzyme β- galactosidase tế bào chủng LT12 148 Vị trí enzyme Hoạt tính tổng số (IU/mL) Dịch ngoại bào 0% Xoang chu chất 0% Nội bào 67,96% Thành, màng tế bào 32,04% KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Kết Bảng cho thấy: enzyme β-galactosidase chủng LT12 đƣợc sinh tổng hợp nội bào, khơng có mặt xoang chu chất dịch ngoại bào Kết phù hợp với báo cáo tác giả khác enzyme β-galactosidase vi khuẩn lactic [5, 7, 9] 2.4 Một số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic LT12 đƣợc tuyển chọn Tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lí, sinh hóa chủng LT12 sau 24 nuôi cấy 30°C môi trƣờng MRS dịch thể thạch đĩa Kết thể Bảng Bảng Một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa chủng LT12 Các tiêu chủng LT12 Hình dạng Que, cặp Nhuộm Gram G+ Hình dạng Trịn, lồi Màu sắc Trắng sữa Kích thƣớc khuẩn lạc, sau 48 nuôi cấy môi trƣờng MRS Đƣờng kính khuẩn lạc (d): - 1,5 mm Tế bào Khuẩn lạc Đặc điểm Sinh bào tử - Hoạt tính catalase - Khả sinh khí từ glucose + Phổ ức chế với VSV kiểm định Bacillus subtilis + Escherichia coli + Salmonella typhimurium + Lactobacillus plantarum - Chú thích: - : khơng; + : có Hình Hình ảnh khuẩn lạc hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn lactic LT12 Kết Bảng cho thấy: Ở pH 4,5, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh Ở dải pH từ đến 8, chủng LT12 sinh axit mạnh (pH ban đầu đến pH cuối giảm từ 3,33 đến 1,02) Ở 149 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 pH 7, chủng LT12 cho hoạt tính enzyme lớn nhất, sau giảm dần Kết phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Hải Yến [2]: pH 7, hoạt tính enzyme chủng BK16 lớn nhất, đạt 360,69 mU/mL tác giả Nguyễn Thị Vân Linh cộng [1] nghiên cứu Thu nhận tinh β-galactosidase từ Lactobacillus acodophilus: Ở pH 7-7,5 hoạt tính enzyme cao nhất, enzyme thơ sau tinh đạt 1,534 IU/mL Theo Shaikh SA cộng sự, pH 7, nấm Rhizomucor sp cho hoạt tính enzyme cao 2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme β-galactosidase chủng LT12 Bảng Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme β-galactosidase chủng LT12 pH ban đầu pH cuối OD620 Số lƣợng tế bào tƣơng ứng (x109) Hoạt tính tổng số IU/mL 3,5 3,41 3,071 ±0,003 1,86 0,02 ±0,008 3,67 4,931 ±0,013 2,98 0,12 ±0,017 4,5 3,87 5,603 ±0,007 3,38 0,44 ±0,019 3,98 5,533±0,002 3,34 0,25 ±0,003 5,5 4,1 4,614±0,011 2,79 0,33 ±0,002 4,09 3,915±0,004 2,36 0,15 ±0,019 6,5 4,27 4,262 ±0,009 2,57 0,33 ±0,006 4,35 3,633 ±0,012 2,19 0,47 ±0,017 7,5 4,48 3,442 ±0,006 2,09 0,38 ±0,018 4,67 3,572 ±0,017 2,16 0,37 ±0,020 Hình Phổ ức chế chủng LT12 với VSV kiểm định 150 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme  -galactosidase chủng LT12 OD620, pH cuối Hoạt tính tổng số (IU/ml) 7.0 0.5 6.0 0.4 5.0 0.3 4.0 3.0 0.2 2.0 0.1 OD OD620620 pH cuối 1.0 0.0 0.0 20 30 40 50 Hoạt tính tổng số (IU/ml) 60 Nhiệt độ (°C) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme chủng LT12 Kết biểu diễn hình cho thấy: Ở nhiệt độ khác nhau, trình sinh tổng hợp enzyme gắn liền với trình sinh trƣởng chủng LT12 Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme 30°C, sau giảm dần nhiệt độ tăng, 45°C khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme giảm đáng kể 2.7 Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp β-galactosidase chủng LT12 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase chủng LT12 (Hình 4) cho thấy: trình sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase tỉ lệ thuận với trình sinh trƣởng chủng LT12 sƣốt thời gian nghiên cứu Trong khoảng từ đến 10 giờ, với tăng nhanh sinh khối tế bào giảm nhanh pH dịch ni (pH từ 6,21 xuống cịn 4,42) Sau 16 giờ, q trình sinh trƣởng dịch ni vào giai đoạn ổn định, tăng trƣởng chậm dần dần đạt trạng thái cân bằng, pH dịch nuôi giảm chậm gần nhƣ không đổi suốt thời gian cịn lại Q trình sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase tăng nhanh đạt cực đại thời điểm 28 giờ, sau giảm dần Enzyme β-galactosidase chủng LT12 đƣợc sinh tổng hợp suốt pha cân đạt cực đại cuối pha cân Vì vậy, cần phải thu hoạch enzyme β-galactosidase trƣớc thời điểm 36 hiệu Kết tƣơng tự nhƣ kết nghiên cứu khác thời gian sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase chủng vi khuẩn lactic đƣợc tác giả khác báo cáo [1, 2] 151 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 OD620 Hình Động thái sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase chủng LT12 2.8 Ảnh hưởng môi trường thay đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme chủng LT12 Sau 24 nuôi cấy 30°C môi trƣờng MRS dịch thể (pH 7) môi trƣờng thay thế, thu đƣợc kết Bảng Kết bảng cho thấy: Ở môi trƣờng MRS, chủng LT12 sinh trƣởng mạnh Trong môi trƣờng thay với mục đích giảm giá thành mơi trƣờng nƣớc chiết bắp cải cho thấy chủng LT12 phát triển mạnh Chính thế, chúng tơi tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ môi trƣờng thay (MRS: bắp cải) đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme -galactosidase chủng LT12 Kết đƣợc trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng môi trường thay đến sinh trưởng, khả sinh axit hoạt độ enzyme  -galactosidase chủng LT12 Môi trƣờng MRS Bắp cải Giá đỗ Cải Hành pH cuối 4,47 3,86 4,34 4,26 4,58 OD620 4,481 0,903 0,701 0,038 0,679 IU/mL 0,41 0,08 0,06 0,03 0,05 Bảng Ảnh hưởng tỉ lệ môi trường đến đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme chủng LT12 Tỉ lệ môi trƣờng 100% bắp cải 75% bắp cải: 25% MRS 50% bắp cải : 50% MRS 25% bắp cải : 75% MRS 100% MRS 152 OD620 pH cuối 0,87 ± 0,01 2,27 ± 0,01 3,15 ± 0,01 4,08 ± 0,01 4,28 ± 0,01 3,85 ± 0,01 4,10 ± 0,01 4,27±0,01 4,35± 0,02 4,44 ± 0,02 Hoạt tính tổng số (IU/mL) 0,073 ± 0,007 0,024± 0,004 0,302 ± 0,013 0,301 ± 0,005 0,373 ± 0,001 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 Số liệu bảng cho thấy: Khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme chủng LT12 tốt môi trƣờng MRS dịch thể Tuy nhiên, thí nghiệm mơi trƣờng thay thế: 50% bắp cải: 50% MRS, 25% bắp cải: 75% MRS hoạt tính enzyme thu đƣợc (~ 0,30 IU/mL), khơng khác biệt nhiều so với môi trƣờng 100% MRS (0,37 IU/mL) nên đƣợc sử dụng để thay môi trƣờng 100% MRS để giảm giá thành sản xuất enzyme Môi trƣờng 25% bắp cải: 75% MRS giúp chủng vi khuẩn lactic LT12 sinh trƣởng tốt (OD620 ~ 4,1) so với môi trƣờng 100% MRS (OD620 ~ 4,3) nên đƣợc sử dụng sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn lactic LT12 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu sáp ong thu đƣợc, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic từ tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme βgalactosiadse tốt Khả sinh enzyme chủng LT12 tốt sau 36 nuôi cấy (0,45 IU/mL) điều kiện môi trƣờng MRS dịch thể, pH = nhiệt độ 30oC Chúng tơi tìm đƣợc mơi trƣờng thay 25% bắp cải: 75% MRS làm tiền đề cho việc sản xuất enzyme β-galactosiadse với giá thành rẻ Kiến nghị Chủng vi khuẩn lactic LT12 enzyme β-galactosidase chủng có triển vọng tốt cơng nghiệp sữa tạo chế phẩm probiotics Chủng cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu sâu (định loại, lên men sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase, thử nghiệm động vật ngƣời, …) theo định hƣớng tạo chế phẩm probiotics TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Thị Vân Linh, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Bích Lam, Thu nhận tinh -Galactosidase từ Lactobacillus acodophilus, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 15, số T3, 2012 [2] Nguyễn Thị Hải Yến, Khảo sát đặc tính khả thu nhận enzyme galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, Đồ án tốt nghiệp, CNSHA-K44, 5-11, 16-21, 27-30 [3] Chang B-S., Mahoney R R., Factors affecting thethermostability of β-galactosidase (Streptococcus salivarius subsp thermophilus) in milk: a quantitative study, Journal of Dairy Research 56, 785-792, 1989 [4] Emanuel V, Adrian V, Ovidiu P, Gheorghe C., Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology, Vol (5), 403-408, 2005 [5] Fatma Isık U., Production of -galactosidase using lactic acid bacteria and optimisation of fermentation parameters, A Thesis Submitted to the Graduate School of Engineering and Science of Izmir Institute of Technology in Partial Fulfilment of Requyrements for the Degree of MASTER OF SCIENCE in Biotechnology, 2007 153 KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 [6] Furlan S.A., Schneider A.L.S., Merkle R., Jonas MFC & Jonas R., Formulation of a lactose-free, low-cost culture medium for the production of β- D galactosidase by Kluyveromyces marxianus, Biotechnology Letters 22, 589-593, 2000 [7] Greenberg N A., Wilder T., Mahoney R R., Studies on the thermostability of lactase (Streptococcus thermophilus) in milk and sweet whey, Journal of Dairy Research 52, 439-449, 1985 [8] Mahoney R.R., Galactosyloligosaccharides formation during lactose hydrolysis, Food Chemistry, 63, 147-154, 1998 [9] Montanari1 G., Zambonelli1 C., Grazia L., Benevelli M., Chiavar C., Release of galactosidase from Lactobacilli, Food technol Biotechnol, 38 (2), 129-133, 2000 [10] Thi Thuy Tran, Gashaw M., Bo M., Rajni H., Kaul, A thermostable phytase from Bacillus sp MD2: cloning,expression and high-level production in Escherichia coli, J Ind Microbiol Biotechnol, 279-287, 2009 154 ... NGHỊ SINH VI? ?N NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014 II NỘI DUNG Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ sáp ong - Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh β -galactosidase cao - Nghiên. .. Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh tổng hợp β -galactosidase từ chủng vi sinh vật tuyển chọn Kết nghiên cứu 2.1 Kết phân lập Từ mẫu sáp ong đƣợc thu địa điểm khác nhau, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn. .. Kết luận Từ mẫu sáp ong thu đƣợc, phân lập đƣợc 61 chủng vi khuẩn lactic từ tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic LT12 có khả sinh trƣởng sinh tổng hợp enzyme βgalactosiadse tốt Khả sinh enzyme