Thông tin tài liệu
NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đon vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TĨNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2020 Tên đề tài Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn lâu dài cao chiết Ngọc nữ biến Clerodendrum inerme (L.) Gaertn phưong pháp tiến hóa thích nghi số hợp đồng: 2021.01.41 Chủ nhiệm đề tài: Bùi Lê Minh Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 1/2021 - 6/2021 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐĨ, HÌNH ẢNH TÓM TẤT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu MỚ ĐẦU CHUƠNG tống quan tài liệu 1.1 Tiến hóa thích nghi vai trò nghiên cứu khả kháng thuốc vi sinh vật.8 1.2 Khả kháng khuân cao chiết Ngọc nữ biên Clerodendrum inerme (L.) Gaertn 10 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHUƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 2.1 Thu thập tách chiết mẫu 13 2.2 Phân lập, định danh xác định đặc tính vi khuấn kháng thuốc 13 2.2.1 Phân lập định danh vi khuẩn kháng thuốc 13 2.2.2 Xác định khả kháng thuốc kháng sinh vi khuấn phân lập 14 2.2.3 Xác định khả tán huyết vi khuần phân lập 14 2.2.4 Xác định hoạt tính coagulase vi khuẩn phân lập 14 2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh cao chiết 15 2.3.1 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiếu (minimum inhibitory concentration -MIC) 15 2.3.2 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiếu (minimum bactericidal concentration - MBC) 15 2.4 Tiến hóa thích nghi phịng thí nghiệm s aureus với nhân tố kháng sinh 16 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Phân lập, xác định chủng vi khuấn kháng thuốc da người bị viêm 17 3.2 Đánh giá khả kháng khuấn cao chiết Ngọc nữ biển với chủng s aureus\9 3.3 Đánh giá khả kháng khuẩn cao chiết Ngọc nữ biển với chủng s aureus tiến hóa thích nghi 20 3.4 Đánh giá mức độ ốn định tính kháng thuốc hình thành chủng s aureus tiến hóa thích nghi 21 3.5 Đánh giá khả hình thành tính kháng tính nhạy cám chéo với kháng sinh chủng s aureus tiến hóa thích nghi 22 3.6 Đánh giá bất lợi khả sinh trưởng thơng thường vi khuấn thích nghi với cao chiết 23 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu viết tắt Thuật ngữ đầy đủ DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid MBC Minimum bactericidal concentration - Nồng độ diệt khuấn tối thiếu MIC MRSA MDR Minimum inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiếu Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Multidrug resistant OD Optical density - Mật độ quang học Am Ampicillin Cm Chloramphenicol Km Kanamycin Gm Gentamycin Rp Rifampicin Tc Tetracylin Vm Vancomycin Sm Trimethoprim/sulfamethoxazole Mc Methicillin Cx Ciprofloxacin HI Hemolysis index DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình Kết PCR khuếch đại gen chi thị phân loại mẫu vi sinh phân lập từ da người (SaL2 SaL7) 18 Hình Sinh trưởng chủng s aureus tiêu chuấn thích nghi với yếu tố kháng khuấn 23 Bảng Danh sách mồi sử dụng cho PCR 13 Bảng Kháng sinh đồ kết xác định hoạt tính tán huyết, coagulase hai chủng vi khuẩn phân lập 17 Bảng Kết PCR xác định gen quy định kiểu hình tính kháng thuốc kháng sinh chủng phân lập 19 Bảng So sánh khả kháng khuẩn cao chiết Ngọc nữ biển Ampicillin 20 Bảng Khả kháng khuấn cao chiết Ngọc nữ biển kháng sinh với chủng s aureus thích nghi với yếu tổ 21 Bảng Hoạt tính kháng khuấn cao chiết Ngọc nữ biến loại kháng sinh với chủng aureus thích nghi xác định trước thời điếm lưu trừ lạnh 21 Bảng Tính kháng/nhạy cảm chéo chủng s aureus thích nghi với yếu tổ kháng khuấn tác dụng yểu tố khác 22 TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu Sản phẩm thực đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh Các bảng phân tích MIC, MBC cao chiết Bảng phân tích MIC, MBC cao chiết Ngọc nữ biên với chủng s aureus chuẩn, Ngọc nữ biên với chủng s aureus chủng kháng đa kháng sinh phân lập chủng tiến hóa thích nghi Nộp cơng bố tạp chí quốc tế Cơng bố tạp chí khoa học nước Thời gian đăng ký: từ 1/2021 đến 6/2021 Thòi gian nộp báo cáo: ngày 13/7/2021 MỞ ĐẦU Vi khuấn kháng thuốc kháng sinh mối đe dọa với loài người âm thầm phát triển khó ngăn chặn Sự xuất vi khuẩn kháng thuốc môi trường sinh hoạt thể người cho thấy tượng kháng thuốc xảy nhiều nơi nguy cao dẫn tới yếu tố phức tạp trình điều trị Các giải pháp để thay bố sung cho kháng sinh đề điều trị nhiễm khuấn tích cực phát triến đa dạng, nhiên khả ứng dụng rộng rãi thuộc hợp chất tự nhiên thân thuộc với người dùng nguồn cung cấp tự nhiên có khả tái tạo Dựa tảng y học dân tộc nhiều quốc gia giới, đặc biệt nước khu vực Đơng Nam Á, thấy tiềm cao ứng dụng hợp chất tự nhiên có hoạt tính kháng khuấn thói quen sử dụng thuốc người dân có từ hàng nghìn năm Mặc dù vậy, sở khoa học chưa đầy đủ để chứng minh hợp chất tự nhiên có khả sử dụng bền vững mà khó dẫn tới tình trạng kháng thuốc lan tràn với kháng sinh 90 năm qua Chính vậy, xu hướng đánh giá hiệu kháng khuấn hợp chất tự nhiên từ thực vật đánh giá hoạt tính kháng khuẩn lâu dài bên cạnh hoạt tính kháng khuấn tức thời, tác dụng chéo tới hoạt động yếu tố kháng khuấn khác kháng sinh Hướng nghiên cứu xác định chiều hướng vi khuấn có khả hình thành tính kháng lại yếu tố kháng khuấn hay khơng có với tốc độ để xác định khả ứng dụng hợp chất, cao chiết xác định Ngọc nữ biến Clerodendrum inerme (L.) Gaertn dược liệu xuất rải rác vùng duyên hải Việt Nam thường dùng làm thuốc chừa cám sốt, xoa bóp chưa nghiên cứu nhiều khả kháng khuẩn Trong nghiên cứu trước nhằm mục đích so sánh số dược liệu biết tới với khả kháng khuấn cao với sổ dược liệu chưa biết nhiều hoạt tính cao chiết lá, cành Ngọc nữ biển phát có hoạt tính cao so với dược liệu khác Chúng lựa chọn cao chiết nghiên cứu trường hợp cụ để nghiên cứu khả ứng dụng lâu dài hợp chất tự nhiên Việc phân lập vi khuấn kháng kháng sinh từ bệnh phấm tạo chủng vi khuấn thích nghi với hợp chất tự nhiên phịng thí nghiệm sử dụng đề có nguồn vi khuấn kháng thuốc giúp đánh giá xác hiệu quà lâu dài dược liệu Với hướng nghiên cứu này, chúng tơi hy vọng áp dụng với nhiều hợp chất tự nhiên khác để có sở vừng vàng đưa khuyến cáo phù hợp cho việc sử dụng hợp chất tự nhiên thực tế CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tiến hóa thích nghi vai trị nghiên cứu khả kháng thuốc cua vi sinh vật Tiến hóa thích nghi (adaptive evolution) tượng thích nghi tự nhiên xảy với tất loài sinh vật theo tốc độ mức độ khác tùy thuộc loài, điều kiện tự nhiên áp lực tự nhiên Trong tiến hỏa định hướng (directed evolution) hay tiến hóa thích nghi với áp lực (stress-adaptive evolution) phương pháp sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm để tạo vi sinh vật có kiều hình thích ứng với nhân tổ áp lực xác định kháng sinh, dung môi, điều kiện vật lý khắc nghiệt Đây mơ q trình tiến hóa tự nhiên rút ngắn thời gian có kiểm sốt áp lực chọn lọc phịng thí nghiệm (24) Có nhiều phương thức để thực trình tiến hóa thích nghi với đối tượng vi sinh vật phịng thí nghiệm, điếm bàn nhân tố chọn lọc cung cấp thường xuyên cho vi sinh vật liên tục sau nhiều hệ, cách liên tục đồi môi trường bố sung nhân tố Một nghiên cứu Leonie cộng (2017) kết luận phương pháp tiến hóa thích nghi với vi sinh vật, cụ thể E coli, dẫn tới kiểu hình đột biến thích nghi nhau, không phụ thuộc vào tốc độ thay đổi áp lực mơi trường (11) Tiến hóa thích nghi chủng E coli khiếm khuyết hệ thống phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase (PTS, hệ thống vận chuyển glucose phosphoryl hóa glucose) sau 120 thích nghi với mơi trường glucose dần tới hình thành chủng PB12 có khả sinh trưởng nhanh gấp 400 lần (1) Kết phân tích hệ gen cho thấy chủng tiến hóa thích nghi có tốc độ sinh trưởng nhanh nhờ đột biến vùng lớn nhiễm sắc thể 10.328 bp (gDNA) bao gồm 12 gene, việc loại bỏ gene rppH, mutHvằ galR có vai trò quan trọng nhất: ỉsrppH làm tăng mức độ ốn định mRNA tham gia đường đường phân, ỈSgalR cho phép vận chuyển glucose vào tế bào GalP, cịn ỉsmutH làm giảm tốc độ hình thành đột biến cao đột ngột xuống mức thấp (1) Trong q trình tiến hóa thích nghi, tế bào vi sinh vật thường tăng tần sổ đột biến đế hình thành tính trạng thích nghi, nhiên tốc độ thay đôi tần số đột biến phụ thuộc vào đặc tính lồi Sừ dụng tiến hóa thích nghi với vi khuẩn Lactobacillus easel cách cho vi khuẩn liên tục tiếp xúc với loại kháng sinh amoxicillin gentamicin qua 2.000 hệ (10 tháng), nhóm nghiên cứu Jicheng Wang nhận thấy tần suất đột biến tăng lần so với tế bào nuôi điều kiện thường (3,5 X 10’9/bp/thế hệ) (30) Tuy nhiên, tần số đột biến L casei chì 1/3 so với E coli (1,1 X 10’8/bp/thế hệ) Yao đồng hình thành tính kháng chủng Enterococcus faecalis với loại kháng sinh nghiên cứu thuộc nhóm khác (ciprofloxacin, levofloxacin, gatifloxacin, penicillin, vancomycin, chloramphenicol, gentamicin) chi sau 10 lần cay truyền trải dài 40 ngày nuôi vi khuấn liên tục môi trường chứa kháng sinh Nhóm nghiên cứu nhận thấy hình thành khả kháng kháng sinh với suy giảm khả sinh trưởng điều kiện bình thường, đặc biệt chủng kháng có pha sinh trưởng logarit bị kéo dài lên tới (27) Sự suy giảm khả sinh trưởng điều kiện bỉnh thường chủng thích nghi ghi nhận số nghiên cứu khác (4; 7; 15; 23; 31) Chính khả thích ứng nhanh với điều kiện bất lợi mà khả hình thành tính kháng vi khuấn gây bệnh tác nhân diệt khuẩn vấn đề đáng lưu tâm Một nghiên cứu Kuete đồng (2010) cho thấy khả kháng nhiều loại hợp chất thiên nhiên chủng vi khuấn Gram âm kháng thuốc phần lớn liên quan tới hoạt động hệ thống bơm màng (efflux pump) AcrAB-TolC (Enterobacteriaceae) hay MexAB-OprM (P aeruginosa) (16) Đặc biệt, s aureus (tụ cầu vàng) ln mơ hình vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc quan tâm nhiều khả hình thành tính kháng nhanh với nhiều loại kháng sinh, kháng sinh nhóm p-lactam Những vi khuấn gọi vi khuấn s aureus kháng methicillin (MRSA) Methicillin phát triên vào năm 1960 để sử dụng cho bệnh nhân mắc phải s aureus kháng penicillin, nhiên chì sau năm, MRSA xuất từ Anh quốc Đan Mạch khắp nơi giới (28) Đề thay Methicillin thi vancomycin sử dụng để điều trị MRSA Vancomycin loại glycosylated tricyclic peptide mạch nhánh thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide bám vào mạch peptide tống hợp ngăn cản tương tác peptide với enzyme transpeptidase làm ngừng trình sinh tống hợp lớp peptidoglycan cần thiết cho tổng hợp thành tế bào s aureus (26) Mặc dù không phố biến trường hợp s aureus kháng Vancomycin ghi nhận chủng s aureus gọi VRSA Nhóm kháng Vancomycin mức trung bình (MIC khoảng 8-16 pg/ml) gọi VISA (Vancomycin intermediate s aureus) nhóm hay xuất hơn, chí số vi khuẩn MRSA dề xuất dạng kháng Vancomycin Một số loại kháng sinh thay Methicillin khác Linezolid, Streptogramin, Clindamycin sử dụng đê điều trị s aureus xuất chủng s aureus kháng lại từ sớm Duy chi có Daptomycin (một loại lipopeptide mạch vịng phụ thuộc canxi) chưa có chủng kháng ghi nhận, nhung chất ưa lipid loại kháng sinh mà Daptomycin chì đưa vào phối thơng qua phương pháp hoạt diện phế nang (aveolar surfactant), làm ứng dụng giới hạn (19) Trước thực trạng kháng thuốc s aureus, việc tìm kiếm giãi pháp kháng sinh từ hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trở nên quan trọng nguồn bồ sung cho kháng sinh dùng Có nhiều dịch chiết từ thực vật chứng minh có khả kháng s aureus MRSA, nhiên chi có số nghiên cứu xác định xác cấu trúc cùa hợp chất thiên nhiên có hoạt tính (12) Trong sổ kể đến p-asarone từ thân ngầm Thủy xương bồ (Acorus calamus), mansonone F từ du Nhật (Ultnus davidiana var japonica), galloylated flavonol rhamnosides từ hoa Kiều hùng (Calliandra tergemina), prenylated flavonoids từ rễ thóc lép (Desmodium caudatum), eupomatenoid-5 từ hồ tiêu Piper regnellii chất có hoạt tính kháng MRSA mạnh (12) Mặc dù vậy, giới hạn chung nghiên cứu việc đánh giá hoạt tính kháng MRSA chì dựa hiệu thời gian ngắn mà khơng có nghiên cứu tác dụng ức chế, diệt khuẩn MRSA tiếp xúc với tác nhân qua thời gian dài Chính vậy, việc ứng dụng tiến hóa thích nghi phương pháp phù hợp có giá trị để nghiên cứu sâu hiệu thực tế tác nhân kháng s aureus kháng thuốc 1.2 Khả kháng khuẩn cao chiết Ngọc nữ biển Clerodendrum inernie (L.) Gaertn Ngọc nữ biển (hay tên gọi khác trùm gọng, vạng hôi, mò biển) - Clerodendrum inerme (L.) Gaertn., tên khác Volkameria ỉnermis L - loài thực vật có hoa thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) tìm thấy úc, Châu Á đảo biến Thái Bình Dương Giới Ngành Plantae Angiospermae Lớp Dicolyledone Bộ Lamiales Họ Chi Tên khoa học Verbenaceae Clerodendrum clerodendrum inerme (L.) Gaertn c inerme có thành phần họp chất thiên nhiên đa dạng, bao gồm nhiều nhóm họp chất có dược tính quan trọng glycoside tim, anthraquinones, họp chat phenol, flavonoid, saponin, tannin, iridoid, diterpene, triterpene, sterol, steroid, carbohydrate, tinh dầu lignin (2) Ở Việt Nam, Ngọc nữ biển phân bố rải rác dọc bờ biến từ Bắc tới Nam sử dụng dược liệu cố truyền với công dụng chữa cảm sốt, đau dày, có thề làm thuốc xoa bóp chữa đau lưng tôn thương chấn thương 10 Mặc dù kháng khuẩn khơng phải hoạt tính biết đến nhiều c inerme có số cơng bố khoa học tập trung vào hoạt tính Một nghiên cứu Prasad đồng cho thấy cao chiết isoamyl alcohol c inerme có hoạt tính kháng Staphylococcus typhi, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Proteus sp., Bacillus subtilỉs, cao chiết propanol ức chế tat chủng vi khuấn trừ Proteus sp., cao chiết ethanol, methanol chloroform chì có khả kháng Proteus sp s aureus (21) Một nghiên cứu khác xác định khả kháng khuấn c inerme chống lại chủng vi sinh vật sau: Shigella sonnei, K pneumoniae, B subtilis, s typhi, p aeruginosa, Pseudomonas solanacerum Xanthomonas citri ghi nhận kháng vi khuẩn tốt cao chiết cồn ethanol (3) Các dịch chiết từ c inerme sử dụng nước, dầu hòa, benzene, ethyl acetate, methanol có tác dụng ức chế tối thiểu 11-15 chủng (bao gồm Gram âm Gram dương) số 18 chủng vi khuấn gây bệnh cho người (14) Củng sừ dụng dịch chiết từ c inerme, nhóm nghiên cứu khác phát cao chiết ethanol có hoạt tính kháng khuẩn mạnh so với cao chiết nước chloroform, cao chiết cồn khả kháng nấm Aspergillus niger (10) Thí nghiệm định lượng Gupta Roy với mẫu thực vật thu thập từ vùng Sundarban (Ấn Độ) xác định cao chiết hexane từ c inerme có MIC kháng B subtilis 1,95 mg/ml MBC kháng B subtilis mức 3.91 mg/ml, cao chiết methanol từ rề cao chiết chloroform từ gồ thân hay cao chiết hexane từ vỏ có MIC MBC mức thấp đáng kể 0,49 mg/ml (9) Những kết cho thấy cao chiết từ c inerme dường có hoạt tính ức chế sinh trưởng vi khuấn cao khả diệt khuẩn so với cao chiết từ phần khác Tuy nhiên báo cáo này, cao chiết c inerme lại bền với nhiệt độ so với cao chiết lại (9) Nghiên cứu khả kháng vi khuẩn kháng thuốc, đa kháng thuốc cao chiết c inerme ít, kể tới nghiên cứu Thái Lan Chayanin đồng Bên cạnh số chủng vi khuẩn gây bệnh da liễu thông thường E coll, s epidermidis, s aureus, nhóm nghiên cứu xác định cao chiết cồn từ c inerme có khả kháng chủng vi khuấn s aureus kháng methicillin (MRSA) DMST 4798 DMST 20651 mức MIC mg/ml (22) Khả kháng MRSA cao chiết khơng có khác biệt so với khả kháng chủng s aureus thông thường tương tự nghiên cứu Gupta Roy (2012), cao chiết thề khả ức chế diệt khuẩn Công bố Pallab đồng (2020) xác định hợp chất có tiềm kháng khuẩn từ cao chiết methanol c inerme squalene linolenic acid methyl ester Hai hợp chất khả kháng chủng Gram âm (£ coli, p aeruginosa) chủng Gram dương (S aureus B 11 The MBC/MIC ratio (R) can reflect the overall antibacterial mechanism It is generally accepted that if R > 4, the agent is considered bacteriostatic, and if R < then it is categorized as a bactericidal agent (Carbonnelle 1987) Accordingly, all used antimicrobial agents were bactericidal to both the standard and evolved s aureus strains, except Sm was bacteriostatic to the Sm-adapted s aureus with R = 25 (Table 1) However, marginal changes in most R values were the results of the concomitant increase of both MIC and MBC values to adapted strains While the upward trend in MIC and MBC values was modest with plant extracts (1.6- to 4-fold increase), it was more significant with antibiotics, especially Km (400- and 800-fold increase in MIC and MBC values, respectively) Even though the plant extracts exhibited much weaker bacterial killing activity against the initial strain than that of the antibiotics, the difference was not considerable post-adaptation 36 ATCC 25923 strain Adapted strain after storage Adapted strain before storage Extract or antibiotic MIC (pg rnL ') MBC (pg mL1) R MIC (pg mL1) MBC (pg mL1) R MIC (pg mL1) MBC (pg mL1) R CQ 1,250 2,500 2,000 4,000 2,000 >4,000 >2 zz 125 125 250 500 250 500 CI 312.5 625 625 2,000 3.2 1,250 2,500 PA 1,250 1,250 2,500 4,000 1.6 2,500 >4,000 >2 EG 312.5 1,250 1,000 4,000 2,000 4,000 AP 625 625 2,500 2,500 2,500 4,000 1.6 Cm 6.25 25 100 400 200 800 Sin 6.25 25 100 2,500 25 400 5,000 12.5 Km 6.25 12.5 2,500 10,000 10,000 20,000 Table The antimicrobial resistance tendency of s aureus adapted to antimicrobial agents An adapted strain is ATCC 25923 that was continuously exposed to a plant extract or antibiotic The MIC and MBC values of an antimicrobial agent on a strain that was previously exposed to the same agent were evaluated before and after the -80 °C storage period The change in MIC or MBC shows the increase of these values when the adapted strain was used, compared to those of the assays using the ATCC 25923 strain Cm, chloramphenicol; Sm, streptomycin; Km, kanamycin R is the ratio of MBC to MIC of each antimicrobial agent-adapted strain pair CQ, Combretum quadrangulare Kurz (leaf extract); AP, Andrographis paniculata (Bunn F.) Nees, (leaf and stem extract); zz, Zingiber zerumbet (L.) Smith (rhizome extract); EG, Eucalyptus globulus Labill (leaf extract); PA, Plectranthus atnboinicus Lour.; CI, Clerodendrum ỉnerme L; Cm, chloramphenicol; Sm, Streptomycin; Km, kanamycin; MIC, minimal inhibitory concentration; MBC, minimal bactericidal concentration R is the ratio of MBC to MIC of a specific antimicrobial agent used in the assay Each experiment was repeated independently for at least three times 37 It was revealed that the physiological, non-heritable adaptation of the bacteria partly contributed to the bacterial resistance to both antibiotics and plant extracts Most of the antibiotic-adapted strains became more sensitive post-storage with a 50-75% reduction in MIC or MBC values of their cognated antibiotics (Table 1) On the other hand, most of the extract-adapted strains showed insignificant post-storage changes in their resistance, except EG-adapted, CI-adapted and AP-adapted strains The dependence of antimicrobial resistance of S’, aureus on storage temperature has not been well-documented before A study proved that cold stress (4 °C and -20 °C) was known to induce s aureus resistance to quinolones and aminoglycosides by upregulating the efflux pump gene norA (Qiao et al 2020) It is not clear whether the storage period reduced the resistance or sensitized the bacteria Despite that, storage temperature should be taken into account in evaluation of bacterial resistance to antimicrobial agents Next, we selected four plant extracts with the lowest MIC to the standard s aureus, including zz, CI, EG, AP and the previously used three antibiotics (Cm, Km, and Sm) to investigate the collateral resistance and sensitivity It was found that most of the extract-adapted strains exhibited collateral sensitivity to antibiotics (Table 2) except CI extract-adapted strain toward Cm In contrast, all of the antibiotic-adapted strains displayed collateral resistance to all antimicrobial reagents, especially those that were significantly elevated (8-400 folds) Interestingly, the obtained collateral resistance of Km-adapted s aureus against Cm is in constrast with a previously reported result from Escherichia coli (Lazar et al 2013) CI and AP extracts were found to induce collateral resistance, zz extract caused collateral sensitivity in s aureus to other extracts, but no such effect was found with EG extract Intriguingly, 38 extract-adapted strains showed the same resistant trend to zz extract and the three antibiotics, suggesting common resistant mechanisms induced by adaptation ZZ-A CI-A EGA AP-A Cm-A Km-A Sm-A AMIC AMBC AR AMIC AMBC AR AMIC AMBC AR AMIC AMBC AR AMIC AMBC AR AMIC AMBC AR AMIC 2.0 4.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 4.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 2.0 4.0 0.5 0.3 2.5 8.0 2.0 3.2 1.6 1.0 1.0 1.0 2.0 4.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 1.0 0.3 1.3 4.0 4.0 4.0 1.0 3.2 3.2 1.0 1.0 4.0 4.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 0.6 1.3 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4.0 4.0 1.0 0.5 1.0 2.0 0.5 2.0 4.0 0.5 5.0 10.0 2.0 2.0 8.0 4.0 4.0 >4.0 1.0 4.0 >8.0 2.0 16.0 16.0 1.0 100.0 200.0 2.0 20.0 20.0 40.0 2.0 4.0 4.0 1.0 8.0 >4.0 0.5 4.0 >8.0 2.0 8.0 8.0 1.0 400.0 800.0 2.0 16.0 5.0 20.0 4.0 4.0 8.0 2.0 8.0 4.0 0.5 4.0 >8.0 2.0 20.0 20.0 1.0 100.0 400.0 4.0 16.0 AMBC 1.0 0.5 0.5 1.0 20.0 4.0 100.0 AR 2.0 0.5 1.0 2.0 1.0 0.3 6.3 Adapted strain zz CI EG AP Cm Km Sm Table Collateral resistance and sensitivity of s aureus strains adapted to a single antimicrobial agent (plant extract or antibiotic) AMIC, AMBC, AR indicate the changes in the antimicrobial activity expressed by the ratio of either MIC, or MBC, or R of a specific antimicrobial agent against each adapted bacteria after 30 passages to these against the starting strain ZZ-A, CI-A, EG-A, AP-A, Cm-A, Km-A, Sm-A are the s aureus strains adapted to zz, CI, EG, AP extracts, Cm, Km, and Sm, respectively The sensitization and re-sensitization of resistant bacteria to antibiotics and other stresses have been observed early, involving weakening or interrupting bacterial defense mechanisms 39 (Repaske 1958; Vaara and Vaara 1983; Helander et aL 2001) While the collateral sensitivity of bacteria to an antibiotic was found to develop during the adaptation of the bacteria to other types of antimicrobial drugs (Barbosa et al 2017; Dawan et al 2021), no report has observed the same phenomenon using natural compounds except one case study (Bischofberger et al 2021) The collateral sensitivity is theoretically feasible and might direct the evolution trajectories and counteract the antibiotic-resistant mechanisms (Rodriguez de Evgrafov et al 2015) In terms of MBC/M1C ratio, the adaptation caused an increase in R value in 59.1% of antimicrobial agent-adapted strain combinations In contrast, the reduced R values were observed in only five pairs Interestingly, s aureus adapted to any of these agents expanded the range of zz extract concentration that they were persistent to, even though some strains appeared to be inhibited at lower zz extract (CI-A, EG-A, and AP-A strain) These changes might reflect different resistance mechanisms and evolution directions However, further studies are needed to clarify the resistant mechanisms and their clinical relevances (Pankey and Sabath 2004) The antibacterial activities of the selected plants and the relationship between! them and the high total flavonoid content were previously described (Roy et al 2009; Prasad et al 2012; Dezsi et al 2015; Nopsiri et al 2015; Ghasemzadeh et al 2016; Nguyen et al 2020) Flavonoids have been reported to have antiallergic, antioxidant, anti-inflammatory, hepatoprotective, antiviral, antiproliferative, anticarcinogenic abilities, and especially anti microbial activity (Kumar and Pandey 2013) Thus, it is likely that flavonoids in the selected plant extracts were responsible for the antibacterial properties 40 Antimicrobial mechanisms of flavonoids are diverse, e.g inhibitions of cell envelope synthesis, nucleic acid synthesis, electron transport chain and ATP synthesis, efflux pumps, membrane disruption, etc (Biharee et al 2020) They have rarely been reported to interrupt or inhibit bacterial protein synthesis (Xu and Lee 2001; Yao et al 2012) In contrast, all the antibiotics used in the study were protein synthesis inhibitors by interfering with synthesis of the 30S and 50S subunits of the ribosome (Luzzatto et al 1968; Germovsek et al 2017) All the extract adaptations did not induce collateral antibiotic resistance in s aureus Thus, the extracts might not interfere with the bacterial protein synthesis, or the antibacterial mechanisms of active compounds in the extracts were distinctive It has been hypothesized that the AR phenotype results in some cost of fitness, usually exhibited by the weaker growth profile of adapted bacteria in the absence of antimicrobial agents Herein, the Cm and Km-adapted strains showed marked growth retardation from to 12 h of culturing, while the reduced growth of the Sm-adapted strain was insignificant (Figure 1) Suprisingly, the extract-adapted strains only exhibited marginal growth reduction It suggests that antibiotic-resistant strains may evolved by upregulating or activating more energy-consuming resistance mechanisms, including efflux pump expulsion (Floyd et al 2010), or protein/membrane synthesis (Jiang et al 2019) 41 Growth of aureus strains in M1IB □ ATCC 25923 □ PA-adapted □ CQ-adapted □ Ci-adapted □ A P-adapted □ Cm-adapted □ ZZ-adapted B Km-adapted □ EG-adapted □ Sm-adapted Figure Growth of the adapted s aureus strains in MHB s aureus strains were grown overnight in MHB medium at 37 °C as seed cultures Seed cultures were used to grow the cells in MHB medium from ODóoo = 0.08 (~108 CFU mF1, 0.5 McFarland standard) at 37 °C and cell density was measured by spectrophotometer at 4, 8, and 12 hours after the medium transfer Error bars represent the standard deviation from three independent experiments The differences were considered significant (*) or non-significant (n.s.) as determined by Student’s t-test with p0.05, respectively In this study, we demonstrated that extracts from medicinal plants grown in Viet Nam conferred consistent antimicrobial activity against s aureus and explored the linkage between the antibacterial activities of PNACs and antibiotics through adaptive evolution The 30-day laboratory adaptation process showed a slow resistance tendency of aureus to diethyl ether extracts of the selected plants However, its resistance to antibiotics developed extremely fast during the same period, especially in the case of Km The results provided more evidence of the stable antibacterial activity of natural products, supporting the safety of long-term PNAC usage Noticeably, most of the extract-adapted strains showed collateral 42 sensitivity to antibiotics, while the antibiotic-adapted strains exhibited collateral resistance to plant extracts It is the first time this relationship between natural products and antibiotics has been reported Our preliminary study is limited as the roles of chemical constituents in the extracts were not determined and the adaptation period was not long More in-depth studies are needed to investigate the long-term activity of PNACs and elaborate the link between resistance mechanisms, for integrating PNACs into infection treatments or AMR prevention strategies Materials and Methods Preparation ofplant extracts The leaves and stems, or rhizome in the case of z zerumbet, of selected plants were collected from various locations in Viet Nam in January 2019 The samples were washed with distilled water and air-dried indoor at 40 °C for a week before being grounded into fine powders Samples (100 g per each) was extracted by soaking in L of diethyl ether (Xilong Scientific, China) at 25 °C for 24 h The extracted solutes were concentrated by vacuum evaporation The concentrated extracts were lyophilized and dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, USA) to 50 mg mL'1 and stored at -20 °C until use Determination of the minimum inhibition concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) s aureus ATCC 25923 strain was used as a standard bacterium Microdilution method of 96- well plate and resazurin (Sigma-Aldrich, USA) colorimetric indicator was used for the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of six plant extracts and three antibiotics (chloramphenicol, kanamycin, and streptomycin at the concentrations of 100, 50, 43 25, 12.5, 6.25, and 3.125 pg mL’1, respectively) on s aureus according to the guideline of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CaLSI 2017) For determining MBC, a range of antimicrobial agent concentrations was used, including MIC, 2*MIC, 4*MIC, and 8xMlC, respectively After incubating the cells with antimicrobial agents at 37 °C for 25-28 h, they were spread onto MHA plates and further incubated at 37 °C for 24 h Evolutional adaptation ofs aureus to antimicrobial agents During the adaptative laboratory evolution, s aureus ATCC 25923 was cultivated under ascending concentrations of an antimicrobial agent for prolonged periods of time (30 days or 30 passages) Initial strain (5xl06 CFU ml/1) was grown at 37 °C in sub-lethal concentrations of plant extracts or antibiotics (‘AxMIC, %xMIC, and 1/8XMIC) After 24 h of treatment, the MICs of the samples were determined using the resazurin method as mentioned above Accordingly, first-day sample-adapted s aureus in sample concentration of 1/2XMIC pg mL’ was used as the material for the next day Cells taken from the selected bacterial tube were then centrifuged to obtain the biomass Bacterial density was determined by a spectrophotometer at 600 nm The adaptation assay was repeated with the sample concentrations of MIC, ‘AxMIC, ‘Ax MIC, and I/8XM1C pg mL’1 Experiments on the following days were performed in a similar manner and by ascending sample concentration until day 30 After 30 adaptive passages, bacteria with the highest concentration of responders were obtained For generating the negative control, ATCC 25923 strain was grown by continuous culture transfer without any antimicrobial agent for 30 days Mannitol Salt Agar (MSA, Himedia, India) plates were used to isolate aureus colonies The colonies were then recovered in MHB medium and stored 44 in glycerol stock at -80 °C for 30 days The resistance tendency against plant extracts and antibiotics of the adapted strains was evaluated based on the MIC and MBC values The sensitivity tests were performed before and after the storage period to evaluate the stability of the resistance phenotype Also, the collateral sensitivity of each adapted strains against other antimicrobial agents was examined using the same method Cell growth measurement All aureus strains, including the ancestor and plant extracts/antibiotics-adapted strains, were first streaked onto an MHA plate to obtain single colonies, and then grown overnight at 37 °C in MHB Overnight cultures were then diluted in MHB to ODóoonm = 0.1 Cultures were allowed to grow at 37 °C for total 12 hrs Optical density of samples was read at a 600 nm wavelength after 4, 8, and 12 hours of culture Statistical analysis The Student's /-test was used to analyze the growth data, which was represented as the mean values of three independent replications The differences were considered significant when p
Ngày đăng: 09/11/2022, 23:09
Xem thêm:
