Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu và hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thân rễ cây sâm đá (curcuma singularis gagnep.).pdf

NTTU-NCKH-04 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thân rễ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) Số hợp đồng: 2021.01.94/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Trang Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: tháng (5/2021-1/2022) TP Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 05 năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021 - 2022 Tên đề tài: Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thân rễ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) Số hợp đồng : 2021.01.94/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Trang Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: tháng (5/2021-1/2022) Các thành viên phối hợp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Ký tên MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật 1.1.1 Hình thái 1.1.2 Phân bố 1.2 Tổng quan chủng vi sinh vật đề tài 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 10 1.3.1 Ngoài nước 10 1.3.2 Trong nước 11 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nội dung 1: Khảo sát đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu Sâm đá 13 2.2 Nội dung 2: Điều chế cao chiết thân rễ Sâm đá 13 2.3 Nội dung : Định tính sơ thành phần hóa thực vật: alkaloid, flavonoid, saponin, tanin 13 2.4 Nội dung : Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao ethanol từ thân rễ Sâm đá vi khuẩn phổ biến 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu Sâm đá 18 3.1.1 Đặc điểm hình thái 18 3.1.2 Cấu tạo giải phẫu Sâm đá 19 3.2 Điều chế cao chiết ethanol từ thân rễ Sâm đá 23 3.3 Định tính sơ thành phần hóa thực vật 23 3.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 24 3.4.1 Phương pháp khuếch tán môi trường thạch 24 3.4.2 Phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Kiến nghị 30 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MIC Minimum Inhibitory Concentration MBC/ MFC Minimum Bactericidal/ Fungicidal Concentration) E coli Escherichia coli P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa MSSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus MRSA Methicillin sentitive Staphylococcus aureus C albicans Candida albicans DMSO Dimethyl sulfoxide Amp Ampicillin Ak Amikacin Nys Nystatin Flu Fluconazol DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Kết sơ thành phần hóa học thân rễ Sâm đá 23 Bảng 3.2 Đường kính vịng kháng khuẩn dịch chiết ethanol thân rễ Sâm đá 25 Bảng 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với chủng vi khuẩn thử nghiệm 28 Bảng 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chứng dương với chủng vi khuẩn thử nghiệm 29 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Hình thái Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 18 Hình 3.2 Cấu tạo giải phẫu rễ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 20 Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân rễ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 21 Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu bẹ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 21 Hình 3.5 Cấu tạo giải phẫu phiến Sâm đá 22 Hình 3.6 Kết kháng sinh đồ cao chiết thân rễ Sâm đá 25 Hình 3.7 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết thân rễ Sâm đá chứng dương, chứng âm chủng vi khuẩn thử nghiệm 27 Hình 3.8 Các đĩa cấy trãi khảo sát MBC xuất khuẩn lạc 29 TĨM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU STT Cơng việc thực Khảo sát đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẩu Sâm đá Kết quà đạt Mơ tả đặc điểm hình thái cấu tạo giải phẫu rễ, thân, huyện Kbang, tỉnh Gia Lai Điều chế cao chiết thân rễ Sâm đá bang ethanol Thu cao ethanol dạng sệt Định tính sơ thành phần hóa Xác định (+/-) chất cần thực vật: alkaloid, flavonoid, định tính saponin, tanin, terpenoid Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Số liệu khả kháng vi sinh vật cao ethanol từ thân rễ Sâm cao chiết thân rễ Sâm đá đá vi sinh vật gây bệnh với chủng vi khuẩn thí nghiệm phổ biến STT Sản phẩm đăng ký Sản phẩm đạt Bộ hình ảnh giải phẫu rễ, thân rễ, Bộ hình ảnh giải phẫu rễ, thân rễ, bẹ bẹ lá, phiến Sâm đá lá, phiến Sâm đá rõ, đẹp Số liệu cụ thể kết khảo sát Số liệu đầy đủ hoạt tính kháng hoạt tính kháng khuẩn cao khuẩn cao ethanol từ thân rễ ethanol từ thân rễ Sâm đá Sâm đá chủng vi sinh vật thử nghiệm Bài báo tạp chí khoa học Bài báo tạp chí khoa học chấp nhận đăng Thời gian thực hiện: tháng (5/2021-1/2022) Thời gian nộp báo cáo : 5/2022 MỞ ĐẦU Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) loài thân thảo thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) đồng bào Bana biết từ lâu với tác dụng bồi dưỡng sức khỏe, người dân gọi “thuốc khỏe” Kinh nghiệm nhân gian bồi dưỡng sức khỏe, cường gân, bổ cốt, tăng sinh lực, cường dương, trị phong thấp, bổ thận, hạn chế suy nhược thể Đây loài đặc hữu Tây Nguyên (huyện Kbang, tỉnh Gia Lai), ghi nhận loài hệ thực vật Việt Nam năm 2016 Hiện nay, kháng lại kháng sinh dòng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh ngày phổ biến mối lo ngại cho y tế toàn cầu Thực vật nguồn thay lí tưởng mức độ an tồn cao khơng có tác dụng phụ Nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ thân rễ Sâm đá Kbang lên chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853, Methicillin resistant Staphylococcus areus ATCC 33591 (MRSA), Methicillin sensitive Staphylococcus areus ATCC 29213 (MSSA), Escherichia coli ATCC 25922 vi nấm Candida albicans ATCC 10231 tác nhân gây bệnh người, đặc biệt Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus biết đến với kháng thuốc cao Đề tài mơ tả cấu tạo hình thái, giải phẫu lồi Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết ethanol thân rễ Sâm đá Kết khảo sát cho thấy Sâm đá có khả kháng tất chủng vi sinh vật thử nghiệm, hoạt tính kháng tốt với MRSA (MIC = 0,625 mg/ml, d = 16 mm) MSSA (MIC = 0,625 mg/ml, d = 11,5 mm); kháng trung bình với chủng Pseudomonas aeruginosa (MIC = mg/ml, d= 11 mm), Candida albicans (MIC = mg/ml, d = 15 mm) Escherichia coli (MIC = 10 mg/ml, d = 10 mm) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật 1.1.1 Hình thái Thân thảo; phần khí sinh (lá, thân giả, hoa) tồn số tháng vào mùa mưa: nảy chồi vào đầu mùa mưa, sinh trưởng suốt mùa mưa, đầu mùa khô (tháng 11-12) thân giả, bị khô tàn lụi; thân thân ngầm củ tồn qua mùa khơ (trạng thái ngủ); mọc đơn độc mà thường mọc thành cụm (3-6 cây), cụm phân bố gần nhau; cao 30-50 cm Thân ngầm thường phân nhánh, đường kính thân 2-3 mm, có đốt ngắn 4-6 mm Từ thân ngầm bật chồi tạo phần khí sinh (lá, thân giả) Thân ngầm non có màu trắng, già có màu vàng, mùi thơm dịu Từ thân ngầm mọc nhiều rễ tơ củ Củ: thân ngầm hình thành 2-4 củ; củ có cuống dài 3-8 cm, tùy theo loại đất tơi xốp Củ dạng ô van dài 4-10 mm, rộng 24 mm, củ khơng có xơ, mềm Củ non màu vàng nhạt, vỏ mỏng; già có màu nâu nhạt, có mùi thơm nhẹ, dẻo, dính Củ thân ngầm nơi dự trữ nước chất dinh dưỡng giúp vượt qua khô hạn mùa khô; củ thân ngầm tồn vài ba năm Lá đơn nguyên, mọc cách; có 4-6 trưởng thành; dài với chiều cao cây; cuống có bẹ ơm non tạo thành thân giả (cao 10-15 cm), cuối bẹ có gờ nhỏ bên mép bẹ nối với nhau, gờ cao 1-2 mm, màu trắng; phần cuống thon nhỏ tạo thành cuống hoàn chỉnh, dài 8-12 cm, hai bên cuống có gờ mỏng tạo thành máng nông 2-3 mm Phiến nguyên đơn, dạng ô van thon, dài 20-30 cm, rộng 8-12 cm; mép phẳng, mặt phiến có nhiều lơng mịn, ngắn (dưới 0,5 mm) tạo cảm giác giống lớp nhung; chóp gốc phiến vuốt nhọn; dùng tay vị có cảm giác giịn, mùi thơm hắc nhẹ Hoa dạng cụm, cụm có 4-8 hoa, hoa mọc sít Mỗi hoa có bắc, đài nhau, cánh hoa, có cánh hoa lớn (cánh mơi), màu trắng, nhị [1] 1.1.2 Phân bố Cây Sâm đá phân bố hạn chế, có số vùng với diện tích nhỏ (khơng q 1000 m2) điểm: làng Kon Bông 2, xã Đắk Rong, làng Tung, xã KRong xã Kon Pne, huyện KBang, tỉnh Gia Lai, độ cao xấp xỉ 1000 m so mực nước biển; vùng rừng nguyên sinh, người tác động [1] 1.2 Tổng quan chủng vi sinh vật đề tài E coli trực khuẩn gram âm, thường khơng có vỏ, hầu hết có lơng Phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường; hiếu kỵ khí tùy tiện; lên men nhiều loại đường sinh Trong đường tiêu hóa, E coli chiếm khoảng 80% vi khuẩn hiếu khí Nhưng E coli vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng đầu nguyên gây nhiểm khuẩn huyết E coli gây nhiều bệnh khác viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương [2] Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), trước gọi Bacterium aeruginosa, Schroeter mô tả năm 1872 Năm 1990, Migula chuyển chúng sang giống Pseudomonas P aeruginosa trực khuẩn gram âm, thẳng cong khơng xoắn, hai đầu trịn Kích thước từ 0,5 – 1,0 µm x 1,5 – 5,0 µm Có lơng cực Các pili trực khuẩn mủ xanh dài khoảng nm, nơi tiếp nhận nhiều loại phage giúp cho vi khuẩn gắn vào bề mặt tế bào vật chủ Trực khuẩn mủ xanh không sinh nha bào P aeruginosa mọc dễ môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tuyệt đối P aeruginosa loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện Khi thể bị suy giảm miễn dịch, bị mắc bệnh ác tính mạn tính, dùng lâu ngày corticoid, kháng sinh chất chống ung thư dễ mắc bệnh nhiễm trùng nội sinh ngoại sinh P aeruginosa Trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng hai vi khuẩn thường gặp nhiễm trùng bệnh viện P aeruginosa từ mơi trường bên ngồi xâm nhập vào thể qua vết thương hở (nhất bỏng) Tại chỗ xâm nhập, chúng gây viêm có mủ (điển hình, có mủ màu xanh); thể suy giảm sức đề kháng, chúng xâm nhập vào gây viêm phủ tạng (xương, đường tiết niệu, tai giữa, phế quản, màng não) gây bệnh toàn thân (nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc) Về bệnh sinh học, có giả thuyết cho rằng, sản phẩm ngoại tiết sắc tố, độc tố tan máu, độc tố ruột, ngoại độc tố A (độc tố gây chết) có vai trị [2] Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) vi khuẩn hình cầu, có đường kính từ 0,8 -1,0 µm đứng thành hình chùm nho, bắt màu gram dương, khơng có lơng, khơng nha bào, thường khơng có vỏ S aureus thường kí sinh mũi họng da Vi khuẩn gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng chúng có nhiều yếu tố độc lực Tụ cầu vàng vi khuẩn gây bệnh thường gặp có khả gây nhiều loại bệnh khác như: nhiễm khuẩn da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, nhiễm độc thức ăn, viêm ruột cấp, hội chứng da phồng rộp, hội chứng sốc nhiễm độc, Sự kháng lại kháng sinh tụ cầu vàng đặc điểm đáng lưu ý Đa số tụ cầu kháng lại Penicillin G vi khuẩn sản xuất men Penicillinase ngờ gen R-plasmid Một số kháng lại Methicillin gọi Methicillin resistance S aureus (viết tắt MRSA), tạo protein gắn vào vị trí tác động kháng sinh Hiện số tụ cầu đề kháng với Cephalosporin hệ Kháng sinh dùng trường hợp Vancomycin [2] Candida albicans lồi nấm gây bệnh, lại thành phần thường gặp hệ vi sinh vật đường ruột người, khơng sinh sản phát triển ngồi thể người Trong xét nghiệm thông thường, lồi phát đường tiêu hóa miệng khoảng 40-60% người lớn khỏe mạnh Thường sinh vật cộng sinh, lại trở thành gây bệnh (bệnh hội) người bị suy giảm miễn dịch nhiều điều kiện khác nhau, đặc biệt bệnh nhân nhiễm HIV Ngoài ra, cịn gây viêm đường sinh dục nam nữ, chí đơi gây nguy hại tính mạng, hội cho phép phát triển mức Tỷ lệ tử vong 40% người bệnh nhiễm nấm tồn thân 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 1.3.1 Ngoài nước Năm 2022, Chinh Chung Doan ctv chiết xuất thân rễ Curcuma singularis (CSE) thể tác dụng chống tăng sinh ống nghiệm tế bào AGS cách chủ yếu kích hoạt đường apoptotic ti thể phụ thuộc caspase CSE cho thấy tín hiệu độc tính in vivo liều 1000 mg/kg với tổn thương gan nhẹ chứng minh, nên tránh sử dụng liều cao thời gian dài Thân rễ Curcuma singularis sử dụng tác nhân hóa trị liệu để điều trị ung thư dày với điều tra chống ung thư in vitro đánh giá an toàn sinh học in vivo [3] Năm 2021, Chinh Chung Doan ctv điều tra thành phần hóa học hoạt động chống tăng sinh chiết xuất thân rễ Curcuma singularis (CSE) Độc tính tế bào in vitro CSE đánh giá xét nghiệm WST-1 LDH Cảm ứng chương trình apoptosis xác định cách sử dụng phương pháp nhuộm DAPI hạt nhân xét nghiệm FACS Phân tích thành phần định hợp chất phương pháp HPLC Kết cho thấy dịch chiết tác dụng gây độc tế bào tế bào ung thư gan ung thư vú có tác dụng tối thiểu tế bào bình thường Nó gây apoptosis tế bào Hep3B SKBR3 tùy thuộc vào liều lượng Ngoài ra, ba hợp chất sesquiterpene, chẳng hạn germacrone (3,25 ± 0,32 mg/g), arturmerone (1,12 ± 0,24 mg/g) curcumol (0,31 ± 0,12 mg/g) tìm thấy thành phần CSE Đây báo cáo tác dụng gây độc tế bào in vitro thân rễ Curcuma singularis chống lại tế bào ung thư [4] ... Hình 3.3 Cấu tạo giải phẫu thân rễ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 21 Hình 3.4 Cấu tạo giải phẫu bẹ Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) 21 Hình 3.5 Cấu tạo giải phẫu phiến Sâm đá ... kháng thuốc cao Đề tài mơ tả cấu tạo hình thái, giải phẫu lồi Sâm đá (Curcuma singularis Gagnep.) hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết ethanol thân rễ Sâm đá Kết khảo sát cho thấy Sâm đá có khả kháng. .. hình ảnh giải phẫu rễ, thân rễ, Bộ hình ảnh giải phẫu rễ, thân rễ, bẹ bẹ lá, phiến Sâm đá lá, phiến Sâm đá rõ, đẹp Số liệu cụ thể kết khảo sát Số liệu đầy đủ hoạt tính kháng hoạt tính kháng khuẩn