khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm từ chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây trâm bầu combretum quadrangulare kurz

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY TRÂM BẦU Combretum quadrangulare Kurz... Dương Nhật Linh Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Du

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH

Sơ lược về vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là những vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô thực vật khỏe mạnh (Stoltzfus và cs, 2000; Wellington và cs., 2004) mà không gây ra tác hại trên cây kí chủ nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học phong phú (Li và cs, 2008; Tan, 2001) Những vi sinh vật này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs, 2005) Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật sống trên Trái đất, giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… (Strobel và cs, 2003) Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên cũng có một số loài có thể nội sinh trong hạt Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng một vai trò là tác nhân điều hòa sinh học (Võ Thị Ngọc Mỹ, 2016)

Bằng chứng về mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật được tìm thấy trong các mô hóa thạch của thân và lá đã chứng minh rằng các mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật có thể đã tiến hóa từ thời thực vật bậc cao được ưu tiên xuất hiện trên trái đất (Redecker và cs., 2000) Sự tồn tại của nấm bên trong các cơ quan của thực vật mà không gây triệu chứng đã được biết đến ở cuối thế kỉ 19 và thuật ngữ

“endophyte” lần đầu tiên được De Bary đề xuất vào năm 1866 (De Bary, 1866) Kể từ khi vi sinh vật nội sinh được mô tả lần đầu tiên trong cây cỏ mọc lẫn cây lúa (Lolium temulentum) (Freeman, 1904) Vi sinh vật nội sinh có thể được phân lập từ các cơ quan khác nhau của các loài thực vật khác nhau (Arnold, 2007) và tất cả các loài thực vật đã nghiên cứu đều thấy ít nhất một vi sinh vật nội sinh

Có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất, mỗi loài là một cây chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội sinh của chúng Do đó, cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 5 GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN khác nhau là đáng kể (Strobel và cs., 2003) Hiện nay, thuật ngữ vi sinh vật nội sinh bao gồm tất cả các sinh vật có toàn bộ hoặc một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng sống bên trong mô thực vật mà không tạo ra bất kỳ triệu chứng nào (Khan, 2007)

Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính đó là vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tùy ý (Baldani và cs., 1997) Vi sinh vật nội sinh tùy ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs., 2000) Vi sinh vật nội sinh tùy ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau Endophyte cũng được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro

Vi sinh vật nội sinh đã nhận được sự chú ý đáng kể sau khi phát hiện được chúng có khả năng bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, sâu bệnh, mầm bệnh và thậm chí cả động vật ăn thực vật Hầu như tất cả các loài thực vật (khoảng 400.000) chứa một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Khan, 2007) Chúng sinh sống ở phần lớn các cây khỏe mạnh, trong các mô khác nhau, hạt, rễ, thân, cành và lá Thực vật ký chủ đem lại lợi ích rộng rãi bằng cách nuôi dưỡng những vi sinh vật nội sinh này và các vi sinh vật nội sinh này giúp thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao đề kháng các tác nhân gây bệnh khác nhau bằng cách sản xuất kháng sinh cho thực vật ký chủ Vi sinh vật nội sinh cũng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có tầm quan trọng trong y học hiện đại, nông nghiệp và công nghiệp Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh như một chất “kích hoạt sinh học” (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs., 2006; Strobel, 2003)

Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học khác nhau có thể trực tiếp hoặc gián tiếp được sử dụng như tác nhân điều trị chống lại nhiều bệnh ở thực vật, động vật và cả ở người (Strobel và cs., 2003) Một số ví dụ điển hình như là thuốc kháng sinh mới ecomycins được tạo ra từ vi

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs., 2013) Năm 1996, Strobel và cộng sự đã báo cáo rằng nấm nội sinh (Pestalotiopsis microspora) được tìm thấy trong cây Yew cũng có thể sản xuất Taxol - thuốc điều trị ung thư đầu tiên trên thế giới (Strobel và cs., 1996) Việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh đặc biệt là tạo nên những đặc tính riêng biệt cho thực vật chủ của chúng, điều này không chỉ quan trọng khi xét trên một quan điểm sinh thái mà còn là từ một quan điểm hóa sinh và phân tử Vì vậy, các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật nội sinh không những có một tiềm năng to lớn trong ngành công nghệ dược phẩm mà còn trong ngành chế biến chế phẩm vi sinh trong nông nghiệp (Borel và cs., 1991)

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dược liệu đã được công bố và ứng dụng vào thực tiễn

Năm 1999, Miss đã phân lập và tuyển chọn một số loài vi khuẩn sống trong mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra L-sparaginase Tác giã đã phân lập được 657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo để sản xuất L-sparaginase Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh để thử nghiệm (Miss và cs., 1999)

Năm 2000, Kim đã tách chất ức chế β-lactamase từ vi khuẩn sống trong mô thực vật Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn (Kim và cs., 2000)

Năm 2003, Kennedia nigricans, một loại cây leo ở Úc, dân gian thường dụng áp nhựa để điều trị vết thương, sát trùng, đã được Strobel và cộng sự phân lập được chủng Streptomyces sp NRRL 30562 mới ứng dụng sản xuất kháng sinh (Strobel và cs., 2003)

Nghiên cứu của Phongpaichit (2006) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men vi nấm nội sinh từ cây Garcinia, kết quả cho thấy từ 377 trong số 1979 vi nấm phân lập được có khả năng kháng lại S aureus, Methicillin ̶ resistant

Staphylococuss aureus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, trong đó 2 chủng D15 và M76 có khả năng kháng lại tất cả các chủng S aureus (Phongpaichit, 2006)

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

Năm 2007, Chandrashekhara và cộng sự đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây neem tại Ấn Độ trong đó có 2 chủng Gram (+) và 5 chủng Gram (-) (Chandrashekhara và cs., 2007)

TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU

Sơ lược về cây Trâm Bầu ( Combretum quadrangulare Kurz) Đặc điểm thực vật học

Tên khoa học là Combretum quadrangulare Kurz Tên thường gọi là trâm bầu, chưng bầu, tim bầu, săng kê, song re

Hình 1.1 Cây Trâm bầu ( Combretum quadrangulare Kurz) (Roy và cs., 2014)

Loài: Combretum quadrangulare Đặc điểm hình thái và phân bố

Họ Combretaceae bao gồm 600 loài cây, cây bụi và cây dây leo trong khoảng

18 - 20 chi Thực vật thuộc họ này được tìm thấy ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Phi và Ấn Độ Các chi lớn nhất là Combretum và Terminalia, với khoảng 370 và 200 loài tương ứng Combretum quadrangulare Kurz được điều tra nhiều nhất loài thuộc chi này

Combretum quadrangulare Kurz là một loại cây bụi và hay mọc ở Đông Nam Á, đặc biệt là Miến Điện đến Lào Cây mọc hoang hoặc được trồng trong Việt Nam, Campuchia, Lào, Myanmar và Thái Lan Cây được trồng dọc theo bờ sông Nó được tìm thấy khắp Thái Lan đặc biệt là ở những nơi ẩm ướt Chiều cao của cây là 5 - 10 mét, có những nhánh non hình tứ giác hoặc tứ giác rất hẹp Lá đơn giản, mọc đối, hình elip hoặc obovate, rộng 3 - 8 cm và dài 6 - 16 cm: cuống lá một cách sâu sắc

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN gợn sóng Cụm hoa ở đầu và đỉnh nách; Hoa nhỏ có màu trắng vàng Quả khô, có hình tứ giác mỏng: hạt có màu nâu đỏ, hình elip, 4 góc (Roy và cs., 2014)

Công dụng và các bài thuốc trị bệnh từ cây Trâm bầu

Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) là một trong những loài quan trọng nhất trong hệ thống y học cổ truyền với các hợp chất terpenoids, flavonoid, steroid,…có khả năng kháng khuẩn, chống HIV, bảo vệ gan (Roy và cs., 2014) Bộ phận hạt, lá, rễ của cây Trâm bầu được dùng điều chế cho thuốc trị giun, phần rễ và thân cũng được dùng chữa bệnh hoa liễu (Pongbunrods và cs., 1979)

Bài thuốc chữa giun kim và giun đũa

Chuẩn bị: Hạt trâm bầu và chuối chín

Thực hiện: Đem nướng hạt trầu bài rồi kẹp trong chuối chín rồi nhai nuốt Trẻ em dùng từ 7 – 14 g (khoảng 5 – 10 hạt), người lớn dùng 14 – 20 g (khoảng 10 – 15 hạt)

❖ Trà trâm bầu giúp nhuận gan

Chuẩn bị: Hạt trâm bầu 20 – 30 g

Thực hiện: Nấu nước uống và dùng như trà trong ngày

❖ Thuốc tẩy giun từ trâm bầu và lá mơ

Chuẩn bị: Bột nếp 100 g, bột từ hạt trâm bầu và lá mơ mỗi thứ 50 g

Thực hiện: Đem tán bột dược liệu rồi trộn đều với bột nếp với một ít nước Sau đó vo bột thành viên và hấp cách thủy cho chín Mỗi sáng sau khi thức dậy, ăn một lượng vừa phải đồng thời không ăn thêm thực phẩm khác cho đến trưa Áp dụng bài thuốc liên tục trong 4 – 5 ngày sẽ giúp tiêu diệt hoàn toàn giun ở trong đường ruột

❖ Bài thuốc trị cổ trướng và xơ gan

Chuẩn bị: Lá cối xay, lá trâm bầu, vỏ cây vọng cách và vỏ cây quao nước mỗi thứ 50 g, quả dứa dại và thân cây ráy gai mỗi thứ 200 g

Thực hiện: Sắc uống, ngày dùng 1 thang

Nguyên tắc cơ bản trong chọn lựa thực vật để phân lập vi sinh vật nội sinh Để có được nguồn vi sinh vật nội sinh có ích, có tính ứng dụng cao, chúng ta đòi hỏi phải có những nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích (Strobel và cs., 2003)

Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường

Khi thực vật sống trong môi trường bất thường, các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt sẽ tạo cho chúng khả năng chịu đựng, chống chịu cao

Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài thực vật sống ở dưới nước, nơi mà cây chịu rất nhiều tác động, luôn bị va đập bởi nước cuốn, mảnh vụn, đá, sỏi,… làm cho cây thường xuyên bị tổn thương Tuy nhiên, số lượng cây này không giảm sút và vẫn khỏe mạnh, có thể nó được bảo vệ bởi những vi sinh vật nội sinh Dựa vào mối liên hệ này mà chủng Serratia marcescens đã phân lập từ cây Rhyncholacis penicillata có khả năng ứng dụng để sản xuất Oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới (Strobel và cs., 2003)

Thực vật sử dụng như dược liệu dân tộc học

Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian từ ông bà xưa truyền lại để giảm đau, chữa lành vết thương, kháng khuẩn, kháng nấm,… thu được kết quả khả quan Ví dụ: Kennedia nigricans - một loại cây leo ở Úc được dân gian lấy sáp nhựa để sử dụng điều trị vết thương, sát trùng Từ cây này đã phân lập được chủng Streptomyces sp NRRL 30562 ứng dụng sản xuất kháng sinh (Strobel và cs., 2003)

Thực vật có tính đặc thù

Các thực vật có tuổi thọ bất thường, phát triển trong các vùng biến đổi sinh học lớn hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa,… cũng là đối tượng nghiên cứu rất lý tưởng cho vi sinh vật nội sinh mới lạ (Strobel và cs., 2003)

TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH THỬ NGHIỆM

Loài: Staphylococcus aureus (Buchanan và Gibbons, 1994)

Tên Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus (hạt) Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5 - 1,5 àm, cú thể đứng riờng rẽ, từng đụi, bốn con, chuỗi ngắn (3 - 4 tế bào) hoặc chựm không theo một trật tự nào cả Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như Tryptic Soy Agar (TSA) có thể màu kem đến màu hồng sáng

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng: Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus (độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Loài : Escherichia coli ((Buchanan và Gibbons, 1994)

Hình dạng E coli thuộc loại kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng là 37 o C, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 10 - 46 o C Mọc dễ dàng trong Mac Conkey, EMB, một số hóa chất ức chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất, muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, selenite…

Tính chất sinh hóa: E coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrite Để phân biệt E coli với vi khuẩn đường ruột khác người ta thường dùng thử nghiệm IMVIC (++ )

Kháng nguyên E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H, được chia thành rất nhiều tuýt huyết thanh khác nhau

Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90 % trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu ở phụ nữ là do E coli và có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục và nhiễm khuẩn huyết

Viêm màng não: E coli chiếm khoảng 40 % trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh, 75 % trong số có kháng nguyên KI

Tiêu chảy: những chủng E coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC, ETEC, EIEC, VTEC

E coli gây bệnh tiêu chảy theo phân ra ngoài và có thể gây thành dịch Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Buchanan và Gibbons, 1994)

Loài: Salmonella typhi (Buchanan và Gibbons, 1994)

S typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân Vì vậy, nó có khả năng di động, không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4 - 0,6 × 2 – 3 μm S typhi là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2

S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một sô biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phùng, 2012)

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn mao ở một đầu, nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các môi trường thông dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor) Mọc tốt ở nhiệt độ 37 đến 42 o C và có thể mọc ở nhiệt độ 5 - 42 o C, không lên men glucose Thử nghiệm oxidase dương tính Gây tiêu huyết β trên thạch máu, P aeruginosa có thể tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin

Trực khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzyme và độc tố khác nhau Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc,… ngoài ra P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí Một số chủng vi khuẩn B cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chủng lại có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật (Ryan và cs., 2004)

B cereus gây một số ít các bệnh truyền qua thực phẩm, gây buồn nôn, nôn mửa và tiêu chảy nghiêm trọng Các bệnh do Bacillus gây ra do thực phẩm không được nấu chín hoặc không đủ nhiệt độ (Kotiranta và cs., 2000)

B cereus được biết là gây ra nhiễm trùng da mãn tính khó tiêu diệt B cereus cũng có thể gây viêm giác mạc (Pinna và cs., 2001)

B cereus nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, thường liên quan đến việc tiêu thụ các món ăn làm từ gạo Các độc tố khác được tạo ra trong quá trình tăng trưởng, bao gồm phospholipase, protease và hemolysin, một trong số đó, cereolysin là một hemolysin được hoạt hóa bằng thiol Những độc tố này có thể góp phần vào khả năng gây bệnh của B cereus trong bệnh lý đường tiêu hóa (Drobniewski và cs., 1993) B

TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI

Candida albicans và Candida non albicans đều là thành viên của hệ vi sinh vật ở da và niêm mạc Nó là nhân tố gây nhiễm khi có sự thay đổi môi trường cơ thể và cho phép nó phát triển vượt ngoài tầm kiểm soát Candida albicans thường sống dưới dạng nấm men ở màng nhầy của người và động vật máu nóng (miệng, ruột, âm đạo) và ít khi ở trên da Ở những trường hợp nhất định (pH môi trường thay đổi, bệnh tiểu đường, ung thư, AIDS, suy dinh dưỡng…) nấm men chuyển thành dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, tăng trưởng không kiểm soát và gây những bệnh khá nghiêm trọng

Candida albicans là tác nhân gây bệnh candida ở da, móng, niêm mạc

(candidasis, moniliasis) Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan sâu gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm Khả năng tồn tại ở hai dạng hình thái là tế bào và sợi giúp loài này nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và khó bị tiêu diệt (Maheshwari, 2010)

Các đặc tính sinh lý của Candida albicans Candida albicans có thể phát triển tốt ở 20 - 38 o C, pH từ 2,5 - 7,5 Ở một số môi trường nuôi cấy khác nhau thì cấu tạo hình thể của Candida albicans cũng có thể

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN thay đổi Trên môi trường thạch đĩa Sabouraud, Candida albicans ở dạng nấm men, sinh sản bằng cách nảy chồi, có khuẩn lạc tròn, trơn mướt màu trắng hoặc kem đường kính từ 1 - 2 mm Ở môi trường huyết thanh ngựa hoặc huyết thanh người (ủ 4 – 7 giờ, tại 37 o C) Candida albicans cho các ống mầm đặc trưng (Maheshwari, 2010) Ở một số môi trường đặc biệt PCB (khoai tây – cà rốt – mật bò) hoặc môi trường thạch bột ngô chứa 1 % Tween 80, Candida albicans phát triển thành sợi nấm giả và bào tử vách dày thường nằm ở đầu hay giữa các vách ngăn sợi nấm giả Sự hình thành bào tử bao dày là một tiêu chí hình thái giúp định danh Candida albicans

Bệnh do nấm Candida gây ra Candida là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nấm cho người và động vật Candida albicans và Candida non albicans đều là thành viên của hệ vi sinh vật ở da và niêm mạc Khi vi nấm kí sinh và gây bệnh ở mô sâu, sợi nấm giả thường chiếm đa số Trường hợp gây tổn thương ngoài da thì số lượng tế bào nấm men nảy chồi chiếm ưu thế hơn sợi tơ nấm giả Bình thường có thể tìm thấy Candida ký sinh trong họng, đường tiêu hoá, âm đạo, da mà không gây bệnh, chúng sống cộng sinh và cân bằng trong vi hệ bình thường (Maheshwari, 2010)

Sự phát triển và gây bệnh của chúng chịu sự kiềm chế của các vi khuẩn sống trong vi hệ Chúng trở nên gây bệnh khi điều kiện thuận lợi, nhất là khi cơ thể giảm sức đề kháng Các loài Candida tồn tại được trong môi trường âm đạo, đầu tiên chúng phải bám dính được vào tế bào biểu mô âm đạo, sau đó xâm nhập vào tế bào biểu mô nhờ men gây phân huỷ protein đặc hiệu do Candida tiết ra Candida albicans có khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào biểu mô âm đạo cao hơn loài C tropicalis, C krusei và C keyfer Điều này giải thích lý do vì sao nhiễm Candida âm đạo chủ yếu do loài Candida albicans Candida có thể gây bệnh ở nhiều tổ chức, cơ quan nông (da, niêm mạc) và sâu (hệ thống) (Maheshwari, 2010) Ở người khoẻ mạnh bình thường, nấm Candida tìm thấy được 30 % ở miệng,

38 % ở ruột, 39 % ở âm đạo, 17 % ở phế quản Trong các loại nấm phân lập được,

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN hay gặp nhất là loại Candida albicans, có thể gặp các loài khác như Candida tropicalis, Candida parapsilopsis, Candida glabrata (Maheshwari, 2010) Đa số trường hợp, Candida nhiễm trên miệng, da hoặc âm đạo Thường dùng kháng sinh để tiêu diệt một cách an toàn Candida spp cũng gây ra một số bệnh nhiễm trùng cơ hội, vi nấm xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng huyết hoặc lan tỏa gây bệnh ở các cơ quan nội tạng Nấm Candida có ở khắp nơi, bất cứ lúc nào cũng có thể theo thức ăn nhiễm vào đường ruột, song chỉ khi có điều kiện thuận lợi, sinh sôi nảy nở nhiều mới gây bệnh Nhiễm nấm Candida đường ruột có các triệu chứng đặc hiệu Nếu triệu chứng lâm sàng rõ, kết quả xét nghiệm có nhiều nấm Candida mới dùng thuốc kháng nấm (Maheshwari, 2010)

Dermatophytes là một nhóm nấm có quan hệ gần gũi với loại nấm có enzym keratinase và do đó có thể gây ra nhiễm trùng trong các mô keratin của người và động vật (da, tóc và móng), dẫn đến một căn bệnh được gọi là dermatophytosis, thường được gọi là bệnh nấm ngoài da Nhóm này bao gồm chi Epidermophyton, Trichophyton và Microsporum, có khoảng 40 loài Tùy thuộc vào nguồn gốc của keratin được sử dụng, dermatophytes có thể được chia vào nhóm ưa đất (từ môi trường lây sang người qua vết trầy sướt ở da), nhóm ưa động vật (sống ở súc vật và truyền bệnh trực tiếp cho người) và nhóm ưa con người (chỉ gây bệnh và lây trực tiếp từ người này sang người khác), đối với nhóm dermatophytes ưa đất, một số loài động vật và con người là môi trường sống chính của chúng (Molina de Diego A., 2011) Dermatophytes phân bố trên toàn thế giới, gây ra hầu hết các bệnh nấm ngoài da ở cả những người khỏe mạnh và bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch (Molina de Diego A., 2011)

Sự nhiễm trùng thường xảy ra ở da và ở các lớp bị chai sần không có sự sống vì các loại nấm này không có khả năng xâm nhập vào các mô sâu hơn hoặc do các bộ phận của vật chủ có hệ miễn dịch Phản ứng đối với một sự nhiễm trùng nấm ngoài da có thể từ nhẹ đến nặng là do kết quả của các phản ứng giữa vật chủ và các sản

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN phẩm trao đổi chất, độc lực của chủng hoặc các loài lây nhiễm, vị trí giải phẫu học của nhiễm trùng, và các yếu tố môi trường tại địa phương (WeitzmanI và cs., 1995) Các tác nhân gây bệnh được mô tả một cách cơ bản theo sơ đồ phân loại các chi của Emmons dựa trên cơ sở hình thái khuẩn lạc, sự hình thành bào tử và các thông tin cập nhật sau khi phát hiện loài mới Các chi và sự mô tả về chúng như sau

Phân loại Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales Họ: Arthrodermataceae Chi: Trichophyton

Trichophyton spp có bào tử đính lớn, khi trưởng thành, có dạng phẳng, thường có từ 1 đến 12 vách ngăn mỏng Chúng được tạo ra đơn lẻ hoặc thành các chùm, và có thể được kéo dài ở dạng chùm, hình chuỳ, hình thoi, hình trụ Kích thước dao động trong khoảng chiều dài từ 8 đến 86 àm, chiều rộng 4 đến 14 àm Bào tử đớnh nhỏ, thường nhiều hơn hơn bào tử đính lớn, chúng có thể là hình cầu, hình quả lê hoặc hình chùm, không cuống hoặc có cuống, và được tạo ra đơn lẻ dọc theo hai bên sợi nấm hoặc thành cụm giống như chùm nho (WeitzmanI và cs., 1995)

Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales Họ: Arthrodermataceae Chi: Microsporum

Microsporum spp bào tử đính lớn có đặc điểm là có những vách ngăn thô ráp do có nhiều điểm nhỏ, gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm Ban đầu, bào tử đính lớn được mô tả bởi Chester Emmons (1934), chúng như hình con quay hoặc hình thoi, nhưng khi phát hiện ra loài mới đã giúp mở rộng phạm vi hình dạng của chúng từ hình trứng ở Microsporum nanum cho đến hình trụ nhọn 2 đầu ở Microsporum vanbreuseghemii Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có từ 1 đến15 vách ngăn và kớch thước nằm trong khoảng chiều dài 6-160 àm, chiều rộng 6-25 àm Bào tử đính nhỏ không có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí đơn lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm như ở Microsporum racemosum, một tác nhân gây bệnh hiếm có (WeitzmanI và cs., 1995)

Bệnh do dermatophytes gây ra

Thông thường, các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi dermatophytes (nấm ngoài da) được đặt tên theo vị trí giải phẫu học có liên quan đến bằng cách gắn thêm thuật ngữ Latin chỉ định các vị trí cơ thể sau chữ tinea, ví dụ như tinea capitis (nấm da đầu) Các biểu hiện lâm sàng thường gặp như sau: (i) tinea barbae (nấm ở vùng có râu), (ii) tinea capitis (nấm da đầu, lông mày, và lông mi), (iii) tinea corporis (nấm ở vùng da nhẵn ); (iv) tinea cruris (nấm bẹn), (v) tinea favosa (nấm da mãn tính), (vi) tinea imbricata (nấm da gây ra bởi T Concentricum), (vii) tinea manuum (nấm ở tay), (viii) tinea pedis (nấm ở chân), và (ix) tinea unguium (nấm móng) Một số vị trí giải phẫu học có thể bị nhiễm bởi một loài nấm da duy nhất, và những loài khác nhau có thể tạo ra các tổn thương lâm sàng giống hệt nhau Các tác nhân gây bệnh có thể phổ biến toàn cầu, ví dụ như T rubrum, trong khi đó sự phân bố của một số tác nhân gây bệnh khác có thể khác nhau về mặt địa lý (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm ở vùng có râu (Tinea barbae)

Một nhiễm trùng ở vùng có râu, có thể nhẹ và xảy ra trên bề mặt hoặc viêm nang lông có mụn mủ nghiêm trọng, dạng thứ hai thì thường gây ra bởi nhóm dermatophytes ưa động vật như Trichophyton verrucosum, T mentagrophytes var mentagrophytes và T mentagrophytes var erinacei (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm da đầu (Tinea capitis)

Một nhiễm trùng liên quan đến da đầu, thường được gây ra bởi các thành viên của chi Microsporum và Trichophyton Nhiễm trùng có thể diễn biến từ nhẹ như là không ngứa hoặc ngứa nhẹ, gần như chưa có biểu hiện lâm sàng, hoặc với ban đỏ nhẹ và một vài mảng trụi tóc lớn với chân tóc màu xám nhạt, hình thành các mảng lớn của sẹo và rụng tóc, vảy ở da đầu, cho đến nặng như hiện tượng bị viêm nang lông có mụn mủ rất nghiêm trọng, các mụn mủ này lan rộng dần ra và tạo thành một mảng lớn hình tròn hay bầu dục Các mụn mủ dần dần ăn sâu xuống tạo thành các apxe Bề mặt thương tổn đóng vảy tiết, tóc trong đám thương tổn rụng hết Nếu cạy hết vảy tiết bề mặt sẽ lõm lỗ chỗ như tổ ong nên có tên mới là Kerion de celse, đôi khi đi kèm với mệt mỏi, sốt và nổi hạch Cả bề mặt da và tóc bị ảnh hưởng Nhiễm trùng của tóc có thể được mô tả như ectothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành ở bên ngoài của sợi tóc) hoặc endothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành trong sợi tóc) Nguyên nhân chủ yếu hiện tại của tinea capitis ở hầu hết các khu vực Bắc, Trung và Nam Mỹ là T tonsurans (endothrix) thay thế M audouinii (ectothrix) (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm ở vùng da nhẵn (Tinea Corporis)

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2019 – 07/2020 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh – cơ ở III, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

VẬT LIỆU

Các mẫu cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) khỏe mạnh được thu thập từ ba địa điểm là Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long đem đi định danh ở phòng thí nghiệm Thực vật – Bộ môn Sinh thái, Sinh học tiến hóa – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

Thiết bị và dụng cụ

✔ Cân, tủ lạnh, nồi hấp, máy vortex, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ ấm, kính hiển vi, máy đo pH, máy lắc, máy ly tâm, máy đo mật độ quang…

✔ Cối, chày, ống nghiệm, đĩa petri, lam, lamelle, pipet, erlen, becher, ống đong, phễu, đũa thủy tinh, que cấy, đèn cồn…

Môi trường và hóa chất:

❖ Hóa chất và thuốc nhuộm

✔ Thuốc nhuộm: crystal violet, lugol, safranin O

✔ Hoá chất: NaCl, cồn 96 o , cồn 70 o , kháng sinh chloramphenicol, kháng nấm nystatin, NaOH 2M, HCl 2M…

✔ PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agar), NB (Nutrient Broth), SDA (Sabouraud Dextrose Agar), MHA (Muller Hinton Agar)…

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dựa vào mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi bố trí thí nghiệm như sơ đồ 2.1

Cây Trâm bầu Định danh tên khoa học

Thu nhận và xử lý mẫu

Phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)

Quan sát đại thể, vi thể Giữ chủng

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh từ VSV nội sinh Định danh chủng vi sinh vật có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn mạnh nhất

Khảo sát pH của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn có hoạt tính cao

Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm

Thu nhận mẫu và xử lý mẫu

Lấy mẫu là khâu đầu tiên và quan trọng nhất trong quá trình tìm kiếm và phân lập một chủng vi sinh vật Việc chọn lựa phải đảm bảo sao cho khả năng sự hiện diện của chủng vi sinh vật là cao nhất Mẫu được lấy, tốt nhất là tiến hành ngay quá trình phân lập tuyển chọn (Roy và cs., 2010)

Tiến hành thu nhận các mẫu rễ phát triển tốt, thân cứng chắc, lá khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, dập úng và tăng trưởng tốt ở cây dược liệu: Trâm bầu

Mẫu được thu vào lúc sáng sớm hay chiều mát, thu toàn bộ cây rồi rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra Mẫu được bảo quản ở 4 o C và tiến hành phân lập trong vòng 6 giờ tính từ khi mẫu được thu thập (Roy và cs., 2010)

Xử lý mẫu Để loại trừ các vi sinh vật còn bám trên bề mặt, mẫu sau khi được thu thập được tiến hành xử lý như sau:

- Bước 1: rửa sạch phần rễ, thân và lá dưới vòi nước mạnh, tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng, cắt mẫu thành các đoạn nhỏ 2 – 4 cm để dễ thao tác

- Bước 2: ngâm mẫu trong ethanol 70 % trong 2 phút và lắc nhẹ

- Bước 3: ngâm mẫu trong dung dịch sodium hypochlorite 2 % trong 3 phút và lắc nhẹ

- Bước 4: ngâm mẫu trong ethanol 70 % trong 3 phút và lắc nhẹ

- Bước 5: rửa mẫu với nước cất vô trùng 5 lần

- Bước 6: đặt trên giấy hút ẩm đã được hấp vô trùng

- Bước 7: kiểm tra mẫu đạt yêu cầu Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trựng, lấy 200 àL nước cất vụ trựng đó rửa mẫu ở bước thứ 5 (lần cuối) lờn cỏc đĩa môi Tryptone Soya Agar (TSA) và ủ ở 37 o C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này

SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Mesa và cs., 2015)

Phân lập vi khuẩn nội sinh và vi nấm nội sinh

Những mẫu khử trùng bề mặt đạt yêu cầu, tiến hành phân lập vi sinh vật nội sinh

Phân lập vi khuẩn nội sinh

- Mẫu sau khi đã được xử lý xong, tiến hành phân lập, đặt mẫu trên môi trường TSA có bổ sung nystatin 30 μg/mL để ngăn chặn sự phát triển của nấm

- Các đĩa petri sẽ được ủ 37 o C trong vòng 2 – 3 ngày Sau 2 – 3 ngày đọc kết quả trên đĩa petri (Costa và cs., 2012)

Phân lập vi nấm nội sinh

- Mẫu sau khi đã được xử lý xong, tiến hành phân lập, đặt mẫu trên môi trường PDA bổ sung thêm 0,05 mg/mL chloramphenicol để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và giúp nấm phát triển trên các mô thực vật

- Các đĩa petri được ủ ở 27 – 29 o C trong 7 - 10 ngày Sau 7 - 10 ngày đọc kết quả trên đĩa petri (El - Nagerabi và cs., 2014)

Ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, kích thước… kết quả vi sinh vật nội sinh mọc trên các mẫu được phân lập từ 2 môi trường TSA, PDA

Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về kích thước, hình dạng, màu sắc Lưu ý, từ một khuẩn lạc lấy từ mẫu thí nghiệm có thể có được ít nhất một chủng nội sinh (Phạm Quang Thu, 2012) Cấy đơn bào từ từ các tản nấm mọc lên từ lần phân lập đầu tiên lên môi trường PDA cho đến khi thu được những khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng và màu sắc (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)

Quan sát đại thể, vi thể

Quan sát đại thể bằng mắt thường để nhận dạng về kích thước, hình dạng, màu sắc của các khuẩn lạc

Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40X, 100X

Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch đĩa

Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả

Hình dạng Hình dạng mép (tròn, răng cưa, ) có núm hay không

Kích thước Độ dày, đường kính Độ trong, màu sắc Trên, dưới, có hay không khuếch tán ra môi trường xung quanh

Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi

Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang

Nhuộm gram: Nhằm xác định hình dạng tế bào vi khuẩn, dạng cầu hay trực, quan sát cách sắp xếp dạng đơn lẻ, dạng chuỗi hay chùm và phân biệt tính chất bắt màu Gram (-) hoặc Gram (+) Cách tiến hành:

- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U

- Nhuộm bằng dung dịch crytal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Tẩy màu bằng cồn 96 o , khoảng 15 - 20 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin O trong 30 giây, rửa nước, thấm khô

- Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần

- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím Crytal violet, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng Safranin O

Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi

Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả

Hình thái Trực, cầu, chùy,…

Cách sắp xếp Riêng lẻ, chuỗi ngắn, chuỗi dài, tụ,

Cách bắt màu Tím/ hồng

- Cần chú ý vô trùng để tránh nhiễm sinh vật khác làm sai lệch kết quả

Cấy đơn bào từ từ các tản nấm mọc lên từ lần phân lập đầu tiên lên môi trường PDA cho đến khi thu được những khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng và màu sắc (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2011)

- Chủng nấm phải tuyệt đối thuần (không bị nhiễm)

- Sử dụng môi trường nuôi cấy đúng như trong tài liệu quy định

- Quan sát và ghi lại các đặc điểm phân loại của chủng vi nấm cần định danh (đặc điểm khuẩn lạc, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học, )

- Hình thái vi thể: Đặt một miếng môi trường PDA bán lỏng mỏng có kích thước 0,5 x 0,5 cm lên một miếng lam vô trùng đặt ở giữa đĩa petri trên một miếng giấy lọc được làm ẩm bằng nước cất vô trùng Sau đó cấy nấm sợi vào 2 góc đối của miếng thạch, đậy lamell lên, đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày Lấy lam ra, nhuộm nấm bằng lactophenol, sau đó quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 40X về các đặc điểm sau: hình dạng sợi nấm: màu sắc, có hay không có vách ngăn, có phân nhánh hay không, đặc điểm cơ quan sinh bào tử, hình dáng bào tử (Nguyễn Thị Hà, 2014)

Giữ giống vi sinh vật là công việc hết sức cần thiết do chúng dễ bị thoái hóa nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật Công việc giữ giống là thực hiện các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vi sinh vật có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ

Sau khi thu được các chủng thuần, chúng ta đem đi giữ giống ở các môi trường thích hợp, cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng và đem đi giữ ở nhiệt độ -4 o C

Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây Trâm bầu

Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu

Chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn để tiến hành xác định hoạt tính kháng khuẩn từ dịch lọc theo phương pháp giếng khuếch tán (Kumar và cs., 2009)

❖ Chuẩn bị môi trường thử nghiệm

- Môi trường Nutrient Broth (NB) thử nghiệm được hấp vô trùng ở

- Môi trường NA được đổ vào đĩa petri (đường kính 90 mm) thể tích 20 mL

- Môi trường thạch dinh dưỡng Muller Hinton Agar (MHA) (20 mL) được hấp vô trùng 121 o C/20 phút được đổ vào từng đĩa petri vô trùng (đường kính 90 mm)

❖ Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm

- Vi khuẩn được cấy ria vào thạch NA, ủ ở 24 giờ ở 37 o C

- Chọn một khuẩn lạc thuần, cấy tăng sinh vi khuẩn nội bào vào 30 mL môi trường NB, ủ ở 37 o C/24 giờ

- Tiến hành ly tâm môi trường chứa vi khuẩn tốc độ 13000 vòng/phút trong

10 phút và lọc qua màng lọc 0,2 μm để thu dịch kiểm tra hoạt tính kháng (Kumar và cs., 2009)

❖ Chuẩn bị vi khuẩn gây bệnh

- Vi khuẩn gây bệnh được sử dụng: S typhi, P aeruginosa, S aureus, E.coli,

- Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch NA ủ ở 37 o C/24 giờ

Tiêu đề	Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)
Tác giả	Nguyễn Thị Mỹ Duyên
Người hướng dẫn	ThS. Dương Nhật Linh
Trường học	Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	136
Dung lượng	2,79 MB