khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm từ chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây trâm bầu combretum quadrangulare kurz

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY TRÂM BẦU Combretum quadrangulare Kurz... Dương Nhật Linh Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Du

KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY TRÂM BẦU

(Combretum quadrangulare Kurz)

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG VI SINH VẬT NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY TRÂM BẦU

(Combretum quadrangulare Kurz)

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Nguyễn Thị Mỹ Duyên

Ngày sinh: 27/12/1998 Nơi sinh: Đăk Lăk

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1653010051

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

(Ghi rõ họ và tên)

Nguyễn Thị Mỹ Duyên

Giảng viên hướng dẫn: ThS Dương Nhật Linh

Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Duyên Lớp: DH16YD01

Ngày sinh: 27/12/1998 Nơi sinh: Đăk Lăk

Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG

VI SINH VẬT NỘI SINH PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare Kurz)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Nguyễn Thị Mỹ Duyên

được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian làm đè tài tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã để lại cho tôi nhiều kỷ niệm đẹp cùng nhiều kinh nghiệm quý báu Để hoàn thành đề tài này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô, anh chị, các bạn và cả gia đình của tôi

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy

Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh Thầy cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và luôn sẵn lòng giúp đỡ, luôn động viên em đi đúng hướng để hoàn thành tốt đề tài này

Em cũng xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni, bạn Nguyễn Quốc Khang, bạn

Nguyễn Thị Hồng Điệp và các bạn, các em ở phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp

đỡ, luôn ủng hộ và giúp em giải quyết những vấn đề khó khăn trong suốt quá trình làm đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn đến ông bà, ba mẹ những người đã có công sinh thành và nuôi dưỡng dạy con khôn lớn đến ngày hôm nay Cả nhà đã luôn động viên, luôn ủng hộ con hết mình để con có thể bước qua những khó khăn, vượt qua mọi thử thách trong cuộc sống

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Bình Dương, ngày 18 tháng 07 năm 2020

NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 4

Sơ lược về vi sinh vật nội sinh 4

Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU 9

Sơ lược về cây Trâm Bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 9

Nguyên tắc cơ bản trong chọn lựa thực vật để phân lập vi sinh vật nội sinh 12

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH THỬ NGHIỆM 13

Methicillin - resistant Staphylococcus aureus 17

1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI 18

Candida 18

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 27

2.2 VẬT LIỆU 27

Đối tượng nghiên cứu 27

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường 27

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

Bố trí thí nghiệm 28

Thu nhận mẫu và xử lý mẫu 29

Phân lập vi khuẩn nội sinh và vi nấm nội sinh 30

Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi sinh vật nội sinh từ cây Trâm bầu 33

Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh của vi sinh vật nội sinh từ cây Trâm bầu 36

Định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống 37

Khảo sát pH hoạt động của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh 45

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH, VI NẤM NỘI SINH TỪ CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare Kurz) 49

Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 49

Kết quả phân lập vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 58

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare Kurz) 64

Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây

Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 64

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare Kurz) 70

Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 70

Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 72

3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI NẤM NỘI SINH TỪ CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare Kurz) 75

Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh của vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 75

Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn gây bệnh của vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 76

3.5 ĐỊNH DANH CHỦNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CAO NHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY TRÂM BẦU 78

Định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất được phân lập từ cây Trâm bầu 78

3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN DỊCH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CHỦNG VI KHUẨN THỬ NGHIỆM CÓ HOẠT TÍNH CAO 79

TIẾNG ANH 116

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

cs.: Cộng sự VSV: Vi sinh vật NA : Nutrient Agar NB : Nutrient Broth TSA : Tryptone Soya Agar PDA : Potato Dextrose Agar SDA : Sabouraud Dextrose AgarMHA : Muller Hinton Agar OD: Optical Density

CFU: Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc

B cereus: Bacillus cereus

S aureus: Staphylococcus aureus E coli: Esscherichia coli

P aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa S typhi: Salmonella typhi

MRSA : Methicillin - resistant Staphylococcus aureus

C albicans: Candida albicans

T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes T rubrum Trichophyton rubrum

M canis Microsporum canis M gypseumMicrosporum gypseum

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm 28

DANH MỤC BẢNG

Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch đĩa 31 Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi 31 Kết quả phân lập các chủng nội sinh từ cây Trâm bầu 49 Kết quả phân lập quan sát đại thể và vi thể chủng vi khuẩn nội sinh từ

cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 49

Kết quả phân lập quan sát đại thể chủng vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu

(Combretum quadrangulare Kurz) 59

Kết quả phân lập quan sát vi thể chủng vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu

(Combretum quadrangulare Kurz) 61

Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh

cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) (mm) 64

Kết quả định tính khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh cây Trâm

bầu (Combretum quadrangulare Kurz) (mm) 70

Kết quả định lượng khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (mm) 73 Kết quả định tính khả năng kháng khuẩn gây bệnh của vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu 75 Kết quả định lượng khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây Trâm bầu (mm) 76 Kết quả định danh sinh hóa chủng R96, L12, L2, L23 78 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH kháng khuẩn, kháng nấm của chủng

vi khuẩn Bacillus sp R96 (mm) 79

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH kháng khuẩn, kháng nấm của chủng

vi khuẩn Bacillus sp R96 (mm) 79

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) 10

Hình 2.1 Kết quả vòng kháng nấm gây bệnh 37

Hình 3.1 Mẫu cây dược liệu đặt trên đĩa môi trường TSA 49

Hình 3.2 Kết quả quan sát đại thể, vi thể chủng vi khuẩn T1 phân lập từ thân và R96 phân lập từ rễ cây Trâm bầu 58

Hình 3.3 Kết quả mẫu cây Trâm bầu đặt trên môi tường PDA 59

Hình 3.4 Kết quả quan sát đại thể vi nấm NL12 và NT6 của cây Trâm bầu 61

Hình 3.5 Hình ảnh quan sát vi thể của vi nấm NL8 và NT5 trên vật kính 40X 63

Hình 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu 69

Hình 3.7 Kết quả kháng nấm của các chủng vi khuẩn nội sinh cây Trâm bầu 74

Hình 3.8 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu 77

Hình 3.9 Kết quả ảnh hưởng pH của chủng Bacillus sp R96 kháng S typhi và E coli 81

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3 1 So sánh khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh R96, L23, L12, T1, L2, R89, L45, L43, L15, L16, R24 từ cây Trâm bầu 68 Biểu đồ 3.2 So sánh khả năng kháng nấm của vi khuẩn nội sinh R96, L23, L12, T1, L2, R89, L45, L43 từ cây Trâm bầu 73 Biểu đồ 3.3 So sánh khả năng kháng khuẩn của vi nấm nội sinh NT5, NL8, NL9, NL10 từ cây Trâm bầu 76

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tự nhiên có hàng nghìn cây thảo dược được con người biết đến và sử dụng từ lâu đời, các cây thảo dược này có chứa các hoạt chất dùng để bào chế các loại thuốc phục vụ cho y học, đời sống con người Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng trên thế giới Theo Viện dược liệu - Bộ y tế, Việt Nam có 5.117 loài và dưới loài, thuộc 1.823 chi, 360 họ của 8 ngành thực vật bậc cao có mạch, cùng với một số taxon thuộc nhóm rêu, tảo và nấm lớn Trong đó có gần 90% là cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong rừng và chỉ có hơn 10% là cây thuốc trồng (Viện dược liệu, 2016) Cây Trâm bầu cũng là một cây dược liệu mọc tự nhiên nhưng chưa được chú trọng

Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) là một trong những loài

quan trọng nhất trong y học cổ truyền với các hợp chất terpenoids, flavonoid, steroid có khả năng kháng khuẩn, chống HIV, bảo vệ gan (Roy và cs., 2014) Bộ phận hạt, lá, rễ cây Trâm bầu được dùng điều chế cho thuốc trị giun, phần rễ và thân cũng được dùng chữa bệnh hoa liễu (Pongbunrods và cs., 1979) Trong dịch chiết của lá khô cây

Trâm bầu có hoạt tính kháng vi khuẩn Helicobacter pylori (OHsUGI và cs., 1997)

Trong hạt cây Trâm bầu cũng có một hợp chất được tìm thấy là combertin, một loại

alkaloid steroid có hoạt tính kháng Esscherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 mạnh hơn Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Nantachit

và cs., 2015)

Năm 2018, Diale và cộng sự đã nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ cây

Combretum molle – một loài thuộc chi Combretum cùng với cây Trâm bầu có hoạt

tính kháng lại các vi khuẩn Bacillus cereus, S aureus, P aeruginosa và E coli (Diale

và cs., 2018)

Hiện nay, trên thế giới cũng như Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cao chiết cây Trâm bầu, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu công bố về vi sinh vật nội sinh của cây Trâm bầu có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh Chính vì thế,

chúng tôi quyết định thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn,

kháng nấm từ chủng vi sinh vật nội sinh phân lập được từ cây Trâm bầu

(Combretum quadrangulare Kurz)”

• Mục tiêu:

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn, vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu

(Combretum quadrangulare Kurz) có hoạt tính kháng một số vi khuẩn, vi nấm gây bệnh

• Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) Phân lập vi nấm nội sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn, vi nấm nội

sinh từ cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)

Định danh các chủng vi khuẩn, vi nấm có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống

Khảo sát pH hoạt động của dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn có hoạt tính mạnh

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH

Sơ lược về vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh (Endophyte) là những vi sinh vật (chủ yếu là nấm và vi khuẩn) sống trong mô thực vật khỏe mạnh (Stoltzfus và cs, 2000; Wellington và cs., 2004) mà không gây ra tác hại trên cây kí chủ nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học phong phú (Li và cs, 2008; Tan, 2001) Những vi sinh vật này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada và cs, 2005) Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật sống trên Trái đất, giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh, tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh… (Strobel và cs, 2003) Hầu hết các dạng nội sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên cũng có một số loài có thể nội sinh trong hạt Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng một vai trò là tác nhân điều hòa sinh học (Võ Thị Ngọc Mỹ, 2016)

Bằng chứng về mối quan hệ giữa vi sinh vật và thực vật được tìm thấy trong các mô hóa thạch của thân và lá đã chứng minh rằng các mối quan hệ giữa vi sinh vật nội sinh và thực vật có thể đã tiến hóa từ thời thực vật bậc cao được ưu tiên xuất hiện trên trái đất (Redecker và cs., 2000) Sự tồn tại của nấm bên trong các cơ quan của thực vật mà không gây triệu chứng đã được biết đến ở cuối thế kỉ 19 và thuật ngữ “endophyte” lần đầu tiên được De Bary đề xuất vào năm 1866 (De Bary, 1866) Kể từ khi vi sinh vật nội sinh được mô tả lần đầu tiên trong cây cỏ mọc lẫn cây lúa

(Lolium temulentum) (Freeman, 1904) Vi sinh vật nội sinh có thể được phân lập từ

các cơ quan khác nhau của các loài thực vật khác nhau (Arnold, 2007) và tất cả các loài thực vật đã nghiên cứu đều thấy ít nhất một vi sinh vật nội sinh

Có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất, mỗi loài là một cây chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội sinh của chúng Do đó, cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội sinh mới và có lợi trong sự đa dạng sinh học của các hệ sinh thái

khác nhau là đáng kể (Strobel và cs., 2003) Hiện nay, thuật ngữ vi sinh vật nội sinh bao gồm tất cả các sinh vật có toàn bộ hoặc một phần thời gian của chu kỳ sống của chúng sống bên trong mô thực vật mà không tạo ra bất kỳ triệu chứng nào (Khan, 2007)

Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính đó là vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tùy ý (Baldani và cs., 1997) Vi sinh vật nội sinh tùy ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs., 2000) Vi sinh vật nội sinh tùy ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau Endophyte cũng

được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro

Vi sinh vật nội sinh đã nhận được sự chú ý đáng kể sau khi phát hiện được chúng có khả năng bảo vệ thực vật chống lại côn trùng, sâu bệnh, mầm bệnh và thậm chí cả động vật ăn thực vật Hầu như tất cả các loài thực vật (khoảng 400.000) chứa một hoặc nhiều vi sinh vật nội sinh (Khan, 2007) Chúng sinh sống ở phần lớn các cây khỏe mạnh, trong các mô khác nhau, hạt, rễ, thân, cành và lá Thực vật ký chủ đem lại lợi ích rộng rãi bằng cách nuôi dưỡng những vi sinh vật nội sinh này và các vi sinh vật nội sinh này giúp thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao đề kháng các tác nhân gây bệnh khác nhau bằng cách sản xuất kháng sinh cho thực vật ký chủ Vi sinh vật nội sinh cũng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có tầm quan trọng trong y học hiện đại, nông nghiệp và công nghiệp Người ta cho rằng hoạt động hỗ sinh của thực vật có sự hiện diện của vi sinh vật nội sinh như một chất “kích hoạt sinh học” (biological trigger) để kích hoạt các hệ thống phản ứng một cách nhanh hơn và mạnh mẽ hơn so với thực vật không được hỗ sinh (Bandara và cs., 2006; Strobel, 2003)

Nhiều vi sinh vật nội sinh có khả năng tổng hợp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học khác nhau có thể trực tiếp hoặc gián tiếp được sử dụng như tác nhân điều trị chống lại nhiều bệnh ở thực vật, động vật và cả ở người (Strobel và cs., 2003) Một số ví dụ điển hình như là thuốc kháng sinh mới ecomycins được tạo ra từ vi

khuẩn Pseudomonas syringae (Christina và cs., 2013) Năm 1996, Strobel và cộng sự đã báo cáo rằng nấm nội sinh (Pestalotiopsis microspora) được tìm thấy trong cây

Yew cũng có thể sản xuất Taxol - thuốc điều trị ung thư đầu tiên trên thế giới (Strobel và cs., 1996) Việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật nội sinh đặc biệt là tạo nên những đặc tính riêng biệt cho thực vật chủ của chúng, điều này không chỉ quan trọng khi xét trên một quan điểm sinh thái mà còn là từ một quan điểm hóa sinh và phân tử Vì vậy, các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật nội sinh không những có một tiềm năng to lớn trong ngành công nghệ dược phẩm mà còn trong ngành chế biến chế phẩm vi sinh trong nông nghiệp (Borel và cs., 1991)

Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới, có nhiều công trình nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh phân lập từ cây dược liệu đã được công bố và ứng dụng vào thực tiễn

mô của cây cỏ có khả năng sản xuất ra L-sparaginase Tác giã đã phân lập được 657 loài vi khuẩn từ những cây thân thảo để sản xuất L-sparaginase Trong đó ông tìm ra được 220 loài vi khuẩn có hiệu lực mạnh để thử nghiệm (Miss và cs., 1999)

thực vật Tác giả đã phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sống trong mô của 25 loài thực vật khác nhau và phân lập được 600 chủng vi khuẩn (Kim và cs., 2000)

Năm 2003, Kennedia nigricans, một loại cây leo ở Úc, dân gian thường dụng

áp nhựa để điều trị vết thương, sát trùng, đã được Strobel và cộng sự phân lập được

chủng Streptomyces sp NRRL 30562 mới ứng dụng sản xuất kháng sinh (Strobel và

cs., 2003)

Nghiên cứu của Phongpaichit (2006) đã thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của

dịch lên men vi nấm nội sinh từ cây Garcinia, kết quả cho thấy từ 377 trong số 1979 vi nấm phân lập được có khả năng kháng lại S aureus, Methicillin ̶ resistant

Staphylococuss aureus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, trong đó 2

chủng D15 và M76 có khả năng kháng lại tất cả các chủng S aureus (Phongpaichit,

2006)

Năm 2007, Chandrashekhara và cộng sự đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây neem tại Ấn Độ trong đó có 2 chủng Gram (+) và 5 chủng Gram (-) (Chandrashekhara và cs., 2007)

Năm 2009, Verma và cộng sự đã phân lập được 55 chủng xạ khuẩn nội sinh từ cây neem có khả năng ức chế được 54,4 % hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh (Verma và cs., 2009)

Năm 2010, nghiên cứu của Arunachalam và cộng sự đã chứng minh rằng dịch

nuôi cấy vi khuẩn nội sinh phân lập từ lá cây thuốc Andrographis paniculata cho thấy

khả năng kháng được 8 loại vi khuẩn cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) (6 vi khuẩn gây bệnh cho người và 2 vi khuẩn gây bệnh cho cá) (Arunachalam và cs, 2010) Cũng trong năm này, Roy và cộng sự đã khảo sát hợp chất tiết ra từ 4 chủng vi khuẩn nội sinh dừa cạn kháng được vi khuẩn, vi nấm gây bệnh (Roy và cs, 2010)

Năm 2011, Kafur và cộng sự đã phân lập được 38 chủng xạ khuẩn nội sinh trong cây Dừa cạn có khả năng ức chế 43,4 % hoạt động của vi khuẩn và nấm bệnh (Kafur và cs., 2011)

Năm 2012, Pavithra đã nghiên cứu 40 chủng nấm nội sinh trong cây Tulsi (có hoạt tính kháng được 77,5 % nấm bệnh (Pavithra và cs., 2012)

Năm 2013, Idris nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn từ nấm nội sinh phân lập từ

cây thuốc Kigelia africana có khả năng kháng lại Bacillus subtilis, S aureus, E.coli

(Idris và cs., 2013)

Năm 2013, Sunkar và cộng sự đã phân lập và xác định được vi khuẩn nội sinh

Brasica oleracea có khả năng sinh các enzyme amylase, protease, cellulase có tiềm

năng trong sản xuất enzyme với quy mô lớn, đồng thời cho thấy hoạt động kháng

khuẩn với K pneumonia (20 mm), S aureus (25 mm) (Sunkar và cs., 2013)

Trong nghiên cứu của El- Deeb và cộng sự năm 2013 cho thấy 8 chủng vi khuẩn

phân lập từ cây Plectranthus tenuiflorus có khả năng kháng lại các tác nhân gây bệnh ở người như S typhi, S aureus, E coli, K pneumoniae, Streptococcus agalactiae,

Proteus mirabilis LC, C albicans (El – Deeb và cs., 2013)

Năm 2014, Bintang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn nội sinh BS1

từ lá trầu không có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh như: E coli, B

cereus và S aureus, kết quả sự ức chế mạnh nhất đối với S aureus (Bintang và cs.,

2014)

Arun K G và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn và vi nấm từ Terminalia

arjuna (marutham), Catharanthus roseus (nithyakalyani) và Azadirachta indica

(vembu), trong đó chủng vi khuẩn NRL2 có hoạt tính kháng cao đối với chủng S

aureus và dịch chiết thô từ chủng vi khuẩn NRL2 cũng có khả năng kháng MRSA

(Arun K G và cs, 2015)

Năm 2018, Diale và cộng sự đã nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ cây

Combretum molle – một loài thuộc chi Combretum cùng với cây Trâm bầu có hoạt

tính kháng lại các vi khuẩn B cereus, S aureus, P aeruginosa và E coli (Diale và

cs., 2018)

Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2019) cho thấy 14 vi khuẩn nội sinh trong

tổng 43 chủng phân lập từ thân cây Dendrobium có hoạt tính kháng khuẩn mạnh bằng

phương pháp Kirby – Bauer (Wang và cs., 2019)

Năm 2020, Myo và cộng sự đã phân lập và tìm được một chủng vi khuẩn nội

sinh từ Catharanthus roseus và hai chủng vi khuẩn từ Boscia variabilis Collett & Hemsl (Capparaceae) không chỉ có hoạt tính kháng vi khuẩn P aeruginosa, S

aureus, S typhi và B cereus mà còn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh ở thực vật

(Myo và cs., 2020)

Tình hình nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong các loài cây ở Việt Nam như năm 2005, Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng vi nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36 %), 20 chủng có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 29,2 %), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33 %) (Lê Mai Hương và cs, 2005)

Nghiên cứu của Lương Thị Hồng Hiệp và Cao Ngọc Điệp (2011), phân lập

và nhận diện vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuyến Chi (Wedelia trilobata (L.)

Hitche.) (Lương Thị Hồng Hiệp và cs., 2011)

Phạm Quang Thu, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Xuân Hưng và Nguyễn Văn Nam (2012) nghiên cứu vi sinh vật nội sinh và các hợp chất hóa học có hoạt tính

kháng nấm gây bệnh ở các dòng keo tai tượng (Acacia mangium) (Phạm Quang Thu

và cs., 2012)

Năm 2013, Nguyễn Văn Minh và cộng sự đã nghiên cứu và sàng lọc vi sinh

vật nội sinh cây cao su có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora casiicola

(Nguyễn Văn Minh và cs., 2013)

Nghiên cứu của Võ Thị Ngọc Mỹ và cộng sự (2016), phân lập và sàng lọc các

chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa từ một số cây họ Zingiberaceae và Rutaceae (Võ Thị Ngọc Mỹ và cs., 2016)

Năm 2017, Trương Minh Phụng và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính kháng

khuẩn của các chủng xạ khuẩn nội sinh trong cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum

latifolium) (Trương Minh Phụng và cs., 2017)

Nguyễn Thị Thúy Duy và cộng sự (2019) đã nghiên cứu về phân lập và tuyển

chọn vi khuẩn nội sinh trong cây thù lù cạnh (Physalis angulata L.) có khả năng

kháng khuẩn ở khu vực Thành phố Cần Thơ (Nguyễn Thị Thúy Duy và cs., 2019)

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU

Sơ lược về cây Trâm Bầu (Combretum quadrangulare Kurz)

Đặc điểm thực vật học

Tên khoa học là Combretum quadrangulare Kurz Tên thường gọi là trâm bầu,

chưng bầu, tim bầu, săng kê, song re

Hình 1.1 Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz)(Roy và cs., 2014)

Vị trí phân loại Giới: Plantae Bộ: Myrtales Họ: Myrtales Chi: Combretum

Loài: Combretum quadrangulare

Đặc điểm hình thái và phân bố

Họ Combretaceae bao gồm 600 loài cây, cây bụi và cây dây leo trong khoảng 18 - 20 chi Thực vật thuộc họ này được tìm thấy ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,

chủ yếu ở Châu Phi và Ấn Độ Các chi lớn nhất là Combretum và Terminalia, với khoảng 370 và 200 loài tương ứng Combretum quadrangulare Kurz được điều tra

nhiều nhất loài thuộc chi này

Combretum quadrangulare Kurz là một loại cây bụi và hay mọc ở Đông Nam

Á, đặc biệt là Miến Điện đến Lào Cây mọc hoang hoặc được trồng trong Việt Nam, Campuchia, Lào, Myanmar và Thái Lan Cây được trồng dọc theo bờ sông Nó được tìm thấy khắp Thái Lan đặc biệt là ở những nơi ẩm ướt Chiều cao của cây là 5 - 10 mét, có những nhánh non hình tứ giác hoặc tứ giác rất hẹp Lá đơn giản, mọc đối, hình elip hoặc obovate, rộng 3 - 8 cm và dài 6 - 16 cm: cuống lá một cách sâu sắc

gợn sóng Cụm hoa ở đầu và đỉnh nách; Hoa nhỏ có màu trắng vàng Quả khô, có hình tứ giác mỏng: hạt có màu nâu đỏ, hình elip, 4 góc (Roy và cs., 2014)

Công dụng và các bài thuốc trị bệnh từ cây Trâm bầu

Cây Trâm bầu (Combretum quadrangulare Kurz) là một trong những loài quan

trọng nhất trong hệ thống y học cổ truyền với các hợp chất terpenoids, flavonoid, steroid,…có khả năng kháng khuẩn, chống HIV, bảo vệ gan (Roy và cs., 2014) Bộ phận hạt, lá, rễ của cây Trâm bầu được dùng điều chế cho thuốc trị giun, phần rễ và thân cũng được dùng chữa bệnh hoa liễu (Pongbunrods và cs., 1979)

Bài thuốc chữa giun kim và giun đũa Chuẩn bị: Hạt trâm bầu và chuối chín

Thực hiện: Đem nướng hạt trầu bài rồi kẹp trong chuối chín rồi nhai nuốt Trẻ em dùng từ 7 – 14 g (khoảng 5 – 10 hạt), người lớn dùng 14 – 20 g (khoảng 10 – 15 hạt)

❖ Trà trâm bầu giúp nhuận gan Chuẩn bị: Hạt trâm bầu 20 – 30 g

Thực hiện: Nấu nước uống và dùng như trà trong ngày ❖ Thuốc tẩy giun từ trâm bầu và lá mơ

Chuẩn bị: Bột nếp 100 g, bột từ hạt trâm bầu và lá mơ mỗi thứ 50 g

Thực hiện: Đem tán bột dược liệu rồi trộn đều với bột nếp với một ít nước Sau đó vo bột thành viên và hấp cách thủy cho chín Mỗi sáng sau khi thức dậy, ăn một lượng vừa phải đồng thời không ăn thêm thực phẩm khác cho đến trưa Áp dụng bài thuốc liên tục trong 4 – 5 ngày sẽ giúp tiêu diệt hoàn toàn giun ở trong đường ruột

❖ Bài thuốc trị cổ trướng và xơ gan

Chuẩn bị: Lá cối xay, lá trâm bầu, vỏ cây vọng cách và vỏ cây quao nước mỗi thứ 50 g, quả dứa dại và thân cây ráy gai mỗi thứ 200 g

Thực hiện: Sắc uống, ngày dùng 1 thang

Nguyên tắc cơ bản trong chọn lựa thực vật để phân lập vi sinh vật nội sinh

Để có được nguồn vi sinh vật nội sinh có ích, có tính ứng dụng cao, chúng ta đòi hỏi phải có những nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích (Strobel và cs., 2003)

Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường

Khi thực vật sống trong môi trường bất thường, các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt sẽ tạo cho chúng khả năng chịu đựng, chống chịu cao

Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài thực vật sống ở dưới nước, nơi mà

cây chịu rất nhiều tác động, luôn bị va đập bởi nước cuốn, mảnh vụn, đá, sỏi,… làm cho cây thường xuyên bị tổn thương Tuy nhiên, số lượng cây này không giảm sút và vẫn khỏe mạnh, có thể nó được bảo vệ bởi những vi sinh vật nội sinh Dựa vào mối

liên hệ này mà chủng Serratia marcescens đã phân lập từ cây Rhyncholacis

penicillata có khả năng ứng dụng để sản xuất Oocydin A, một hợp chất kháng nấm

mới (Strobel và cs., 2003)

Thực vật sử dụng như dược liệu dân tộc học

Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian từ ông bà xưa truyền lại để giảm đau, chữa lành vết thương, kháng khuẩn, kháng nấm,… thu được

kết quả khả quan Ví dụ: Kennedia nigricans - một loại cây leo ở Úc được dân gian

lấy sáp nhựa để sử dụng điều trị vết thương, sát trùng Từ cây này đã phân lập được

chủng Streptomyces sp NRRL 30562 ứng dụng sản xuất kháng sinh (Strobel và cs.,

2003)

Thực vật có tính đặc thù

Các thực vật có tuổi thọ bất thường, phát triển trong các vùng biến đổi sinh học lớn hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa,… cũng là đối tượng nghiên cứu rất lý tưởng cho vi sinh vật nội sinh mới lạ (Strobel và cs., 2003)

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH THỬ NGHIỆM

Staphylococcus aureus

Phân loại

Phân ngành: Firmicute Giới: Prokaryote Lớp: Firmibacteria Họ: Micrococceae Chi: Staphylococcus

Loài: Staphylococcus aureus (Buchanan và Gibbons, 1994)

Tên Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus (hạt) Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5 - 1,5 µm, có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3 - 4 tế bào) hoặc chùm không theo một trật tự nào cả Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như Tryptic Soy Agar (TSA) có thể màu kem đến màu hồng sáng

Khả năng gây bệnh

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng: Nhiễm độc có

thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus (độc tố) mà không cần

có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài

da, hội chứng ngộ độc thức ăn Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan

bảo vệ của vật chủ khi bị tổn thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, nhiễm trùng hệ hô hấp, nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, nhiễm trùng xương…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường

xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm

nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Escherichia coli

Giới : Bacteria Ngành : Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae Chi : Escherichia

Loài : Escherichia coli ((Buchanan và Gibbons, 1994)

Hình dạng E coli thuộc loại kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng

là 37oC, tuy nhiên có thể tăng trưởng từ 10 - 46oC Mọc dễ dàng trong Mac Conkey,

EMB, một số hóa chất ức chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất,

muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, selenite…

Tính chất sinh hóa: E coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrite Để phân biệt E coli với vi khuẩn đường ruột khác người ta thường

dùng thử nghiệm IMVIC (++ )

Kháng nguyên E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H,

được chia thành rất nhiều tuýt huyết thanh khác nhau Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn đường tiểu: 90 % trường hợp nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu ở

phụ nữ là do E coli và có thể đưa tới nhiễm khuẩn bọng đái, thận, cơ quan sinh dục

và nhiễm khuẩn huyết

Viêm màng não: E coli chiếm khoảng 40 % trường hợp viêm màng não ở trẻ

sơ sinh, 75 % trong số có kháng nguyên KI

Tiêu chảy: những chủng E coli liên quan đến tiêu chảy thuộc các nhóm EPEC,

ETEC, EIEC, VTEC

E coli gây bệnh tiêu chảy theo phân ra ngoài và có thể gây thành dịch Truyền

bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Buchanan và Gibbons, 1994)

Salmonella typhi

Phân loại:

Phân ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella

Loài: Salmonella typhi (Buchanan và Gibbons, 1994)

S typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân Vì vậy, nó có khả

năng di động, không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4 - 0,6 × 2 – 3 μm S typhi

là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 - 4 mm

Khả năng gây bệnh

S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn

Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một sô biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phùng, 2012)

Pseudomonas aeruginosa

Phân loại

Ngành : Proteobacteria

Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Pseudomonadales Họ : Pseudomonadaceae Chi : Pseudomonas

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn

mao ở một đầu, nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các môi trường thông dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor) Mọc tốt ở nhiệt độ 37 đến 42oC và có thể mọc ở nhiệt độ 5 - 42oC, không lên men glucose Thử nghiệm oxidase dương tính Gây tiêu huyết β trên thạch

máu, P aeruginosa có thể tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin

(Nguyễn Thanh Bảo, 2008) Khả năng gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzyme và độc tố khác nhau Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác

mạc,… ngoài ra P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương,

xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Bacillus cereus

Phân loại khoa học

Ngành : Firmicutes Lớp : Bacilli Bộ : Bacillales Họ : Bacillaceae Chi : Bacillus

Loài : Bacillus cereus

Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh bào tử, hiếu khí Một

số chủng vi khuẩn B cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chủng lại có

lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật (Ryan và cs., 2004) Khả năng gây bệnh

B cereus gây một số ít các bệnh truyền qua thực phẩm, gây buồn nôn, nôn mửa

và tiêu chảy nghiêm trọng Các bệnh do Bacillus gây ra do thực phẩm không được

nấu chín hoặc không đủ nhiệt độ (Kotiranta và cs., 2000).

B cereus được biết là gây ra nhiễm trùng da mãn tính khó tiêu diệt B cereus

cũng có thể gây viêm giác mạc (Pinna và cs., 2001)

B cereus nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, thường liên quan đến việc tiêu

thụ các món ăn làm từ gạo Các độc tố khác được tạo ra trong quá trình tăng trưởng, bao gồm phospholipase, protease và hemolysin, một trong số đó, cereolysin là một hemolysin được hoạt hóa bằng thiol Những độc tố này có thể góp phần vào khả năng

gây bệnh của B cereus trong bệnh lý đường tiêu hóa (Drobniewski và cs., 1993) B

Cereus cũng gây ra vô số bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng khác như nhiễm trùng huyết

tối cao và tàn phá hệ thống thần kinh trung ương (Bottone và cs., 2010) Bacillus

cereus là một mầm bệnh ở người được tìm thấy là tác nhân truyền nhiễm của

endophthalmitis và ngộ độc thực phẩm, đôi khi gây chết người (Drobniewski và cs., 1993)

Methicillin - resistant Staphylococcus aureus

MRSA là viết tắt của Methicillin ̶ resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) S aureus kháng Methicillin có nghĩa là kháng được tất cả

các β- lactam, và có thể kháng được Aminoglycosides và Macrolides Methicillin được coi là kháng sinh mạnh nhất trong nhóm β- lactam Hiện nay, S aureus kháng

Methicillin đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là trong các trường hợp nhiễm trùng tại bệnh viện (Karpin và cs., 2015) Chính vì vậy phát hiện kháng Methicillin

trên S aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn

S aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004) MRSA là các chủng S aureus biểu hiện

cơ chế kháng qua đột biến gen hoặc qua cơ chế kháng Methicillin khác, ví dụ thay đổi ái lực của protein gắn Penicillin với Oxacillin (CLSI, 2011) Thường gây nhễm trùng bệnh viện nặng Được phân lập tại Châu Âu đầu tiên vào năm 1960, phát tán nhanh ở Mỹ và trở thành dịch ở nhiều bệnh viện tại Mỹ ở thập niên 1980 (tỷ lệ nhiễm MRSA 10 – 40 %) Ở Canada phát hiện đầu tiên vào năm 1979 và trở thành dịch năm

1981 Tỷ lệ tăng từ 0,46/1000 ca năm 1995 lên 5,9/1000 ca năm 2004 Nghiên cứu năm 2006 ở 48 bệnh viện tại Canada cho thấy: 11.700/29.000 bệnh nhân nhập viện có mang MRSA gây bệnh nhiễm trùng (Nguyễn Thị Thu Ba và cs., 2011).

1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI

Candida

Phân loại

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Phân ngành: Saccharomycotina Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Chi: Candida

Candida albicans và Candida non albicans đều là thành viên của hệ vi sinh vật

ở da và niêm mạc Nó là nhân tố gây nhiễm khi có sự thay đổi môi trường cơ thể và

cho phép nó phát triển vượt ngoài tầm kiểm soát Candida albicans thường sống dưới

dạng nấm men ở màng nhầy của người và động vật máu nóng (miệng, ruột, âm đạo) và ít khi ở trên da Ở những trường hợp nhất định (pH môi trường thay đổi, bệnh tiểu đường, ung thư, AIDS, suy dinh dưỡng…) nấm men chuyển thành dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, tăng trưởng không kiểm soát và gây những bệnh khá nghiêm trọng

Candida albicans là tác nhân gây bệnh candida ở da, móng, niêm mạc

(candidasis, moniliasis) Vi nấm có thể xâm nhập vào máu và các cơ quan sâu gây nhiễm khuẩn huyết và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm Khả năng tồn tại ở hai dạng hình thái là tế bào và sợi giúp loài này nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và khó bị tiêu diệt (Maheshwari, 2010)

Các đặc tính sinh lý của Candida albicans

Candida albicans có thể phát triển tốt ở 20 - 38oC, pH từ 2,5 - 7,5 Ở một số

môi trường nuôi cấy khác nhau thì cấu tạo hình thể của Candida albicans cũng có thể

thay đổi Trên môi trường thạch đĩa Sabouraud, Candida albicans ở dạng nấm men,

sinh sản bằng cách nảy chồi, có khuẩn lạc tròn, trơn mướt màu trắng hoặc kem đường kính từ 1 - 2 mm Ở môi trường huyết thanh ngựa hoặc huyết thanh người (ủ 4 – 7 giờ, tại 37oC) Candida albicans cho các ống mầm đặc trưng (Maheshwari, 2010)

Ở một số môi trường đặc biệt PCB (khoai tây – cà rốt – mật bò) hoặc môi trường

thạch bột ngô chứa 1 % Tween 80, Candida albicans phát triển thành sợi nấm giả và

bào tử vách dày thường nằm ở đầu hay giữa các vách ngăn sợi nấm giả Sự hình thành

bào tử bao dày là một tiêu chí hình thái giúp định danh Candida albicans

thế hơn sợi tơ nấm giả Bình thường có thể tìm thấy Candida ký sinh trong họng,

đường tiêu hoá, âm đạo, da mà không gây bệnh, chúng sống cộng sinh và cân bằng trong vi hệ bình thường (Maheshwari, 2010)

Sự phát triển và gây bệnh của chúng chịu sự kiềm chế của các vi khuẩn sống trong vi hệ Chúng trở nên gây bệnh khi điều kiện thuận lợi, nhất là khi cơ thể giảm

sức đề kháng Các loài Candida tồn tại được trong môi trường âm đạo, đầu tiên chúng

phải bám dính được vào tế bào biểu mô âm đạo, sau đó xâm nhập vào tế bào biểu mô

nhờ men gây phân huỷ protein đặc hiệu do Candida tiết ra Candida albicans có khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào biểu mô âm đạo cao hơn loài C tropicalis, C

krusei và C keyfer Điều này giải thích lý do vì sao nhiễm Candida âm đạo chủ yếu

do loài Candida albicans Candida có thể gây bệnh ở nhiều tổ chức, cơ quan nông

(da, niêm mạc) và sâu (hệ thống) (Maheshwari, 2010)

Ở người khoẻ mạnh bình thường, nấm Candida tìm thấy được 30 % ở miệng,

38 % ở ruột, 39 % ở âm đạo, 17 % ở phế quản Trong các loại nấm phân lập được,

hay gặp nhất là loại Candida albicans, có thể gặp các loài khác như Candida

tropicalis, Candida parapsilopsis, Candida glabrata (Maheshwari, 2010)

Đa số trường hợp, Candida nhiễm trên miệng, da hoặc âm đạo Thường dùng kháng sinh để tiêu diệt một cách an toàn Candida spp cũng gây ra một số bệnh nhiễm

trùng cơ hội, vi nấm xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng huyết hoặc lan tỏa gây bệnh

ở các cơ quan nội tạng Nấm Candida có ở khắp nơi, bất cứ lúc nào cũng có thể theo

thức ăn nhiễm vào đường ruột, song chỉ khi có điều kiện thuận lợi, sinh sôi nảy nở

nhiều mới gây bệnh Nhiễm nấm Candida đường ruột có các triệu chứng đặc hiệu Nếu triệu chứng lâm sàng rõ, kết quả xét nghiệm có nhiều nấm Candida mới dùng

thuốc kháng nấm (Maheshwari, 2010)

Dermatophytes

Dermatophytes là một nhóm nấm có quan hệ gần gũi với loại nấm có enzym keratinase và do đó có thể gây ra nhiễm trùng trong các mô keratin của người và động vật (da, tóc và móng), dẫn đến một căn bệnh được gọi là dermatophytosis, thường

được gọi là bệnh nấm ngoài da Nhóm này bao gồm chi Epidermophyton,

Trichophyton và Microsporum, có khoảng 40 loài Tùy thuộc vào nguồn gốc của

keratin được sử dụng, dermatophytes có thể được chia vào nhóm ưa đất (từ môi trường lây sang người qua vết trầy sướt ở da), nhóm ưa động vật (sống ở súc vật và truyền bệnh trực tiếp cho người) và nhóm ưa con người (chỉ gây bệnh và lây trực tiếp từ người này sang người khác), đối với nhóm dermatophytes ưa đất, một số loài động vật và con người là môi trường sống chính của chúng (Molina de Diego A., 2011)

Dermatophytes phân bố trên toàn thế giới, gây ra hầu hết các bệnh nấm ngoài da ở cả những người khỏe mạnh và bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch (Molina de Diego A., 2011)

Sự nhiễm trùng thường xảy ra ở da và ở các lớp bị chai sần không có sự sống vì các loại nấm này không có khả năng xâm nhập vào các mô sâu hơn hoặc do các bộ phận của vật chủ có hệ miễn dịch Phản ứng đối với một sự nhiễm trùng nấm ngoài da có thể từ nhẹ đến nặng là do kết quả của các phản ứng giữa vật chủ và các sản

phẩm trao đổi chất, độc lực của chủng hoặc các loài lây nhiễm, vị trí giải phẫu học của nhiễm trùng, và các yếu tố môi trường tại địa phương (WeitzmanI và cs., 1995)

Các tác nhân gây bệnh được mô tả một cách cơ bản theo sơ đồ phân loại các chi của Emmons dựa trên cơ sở hình thái khuẩn lạc, sự hình thành bào tử và các thông tin cập nhật sau khi phát hiện loài mới Các chi và sự mô tả về chúng như sau

Trichophyton spp

Phân loại Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales

Họ: Arthrodermataceae

Chi: Trichophyton

Trichophyton spp có bào tử đính lớn, khi trưởng thành, có dạng phẳng, thường

có từ 1 đến 12 vách ngăn mỏng Chúng được tạo ra đơn lẻ hoặc thành các chùm, và có thể được kéo dài ở dạng chùm, hình chuỳ, hình thoi, hình trụ Kích thước dao động trong khoảng chiều dài từ 8 đến 86 µm, chiều rộng 4 đến 14 µm Bào tử đính nhỏ, thường nhiều hơn hơn bào tử đính lớn, chúng có thể là hình cầu, hình quả lê hoặc hình chùm, không cuống hoặc có cuống, và được tạo ra đơn lẻ dọc theo hai bên sợi nấm hoặc thành cụm giống như chùm nho (WeitzmanI và cs., 1995)

Microsporum spp

Phân loại

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Onygenales

Họ: Arthrodermataceae

Chi: Microsporum

Microsporum spp bào tử đính lớn có đặc điểm là có những vách ngăn thô ráp

do có nhiều điểm nhỏ, gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm Ban đầu, bào tử đính lớn được mô tả bởi Chester Emmons (1934), chúng như hình con quay hoặc hình thoi, nhưng khi phát hiện ra loài mới đã giúp mở rộng phạm vi hình dạng của chúng từ hình trứng

ở Microsporum nanum cho đến hình trụ nhọn 2 đầu ở Microsporum vanbreuseghemii

Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có từ 1 đến15 vách ngăn và kích thước nằm trong khoảng chiều dài 6-160 µm, chiều rộng 6-25 µm Bào tử đính nhỏ không có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí

đơn lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm như ở Microsporum racemosum, một tác

nhân gây bệnh hiếm có (WeitzmanI và cs., 1995)

Bệnh do dermatophytes gây ra

Thông thường, các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi dermatophytes (nấm ngoài da) được đặt tên theo vị trí giải phẫu học có liên quan đến bằng cách gắn thêm thuật ngữ Latin chỉ định các vị trí cơ thể sau chữ tinea, ví dụ như tinea capitis (nấm da đầu) Các biểu hiện lâm sàng thường gặp như sau: (i) tinea barbae (nấm ở vùng có râu), (ii) tinea capitis (nấm da đầu, lông mày, và lông mi), (iii) tinea corporis (nấm ở vùng da nhẵn ); (iv) tinea cruris (nấm bẹn), (v) tinea favosa (nấm da mãn tính), (vi) tinea

imbricata (nấm da gây ra bởi T Concentricum), (vii) tinea manuum (nấm ở tay), (viii)

tinea pedis (nấm ở chân), và (ix) tinea unguium (nấm móng) Một số vị trí giải phẫu học có thể bị nhiễm bởi một loài nấm da duy nhất, và những loài khác nhau có thể tạo ra các tổn thương lâm sàng giống hệt nhau Các tác nhân gây bệnh có thể phổ biến

toàn cầu, ví dụ như T rubrum, trong khi đó sự phân bố của một số tác nhân gây bệnh

khác có thể khác nhau về mặt địa lý (WeitzmanI và cs., 1995) + Nấm ở vùng có râu (Tinea barbae)

Một nhiễm trùng ở vùng có râu, có thể nhẹ và xảy ra trên bề mặt hoặc viêm nang lông có mụn mủ nghiêm trọng, dạng thứ hai thì thường gây ra bởi nhóm

dermatophytes ưa động vật như Trichophyton verrucosum, T mentagrophytes var

mentagrophytes và T mentagrophytes var erinacei (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm da đầu (Tinea capitis)

Một nhiễm trùng liên quan đến da đầu, thường được gây ra bởi các thành viên

của chi Microsporum và Trichophyton Nhiễm trùng có thể diễn biến từ nhẹ như là

không ngứa hoặc ngứa nhẹ, gần như chưa có biểu hiện lâm sàng, hoặc với ban đỏ nhẹ và một vài mảng trụi tóc lớn với chân tóc màu xám nhạt, hình thành các mảng lớn của sẹo và rụng tóc, vảy ở da đầu, cho đến nặng như hiện tượng bị viêm nang lông có mụn mủ rất nghiêm trọng, các mụn mủ này lan rộng dần ra và tạo thành một mảng lớn hình tròn hay bầu dục Các mụn mủ dần dần ăn sâu xuống tạo thành các apxe Bề mặt thương tổn đóng vảy tiết, tóc trong đám thương tổn rụng hết Nếu cạy hết vảy tiết bề mặt sẽ lõm lỗ chỗ như tổ ong nên có tên mới là Kerion de celse, đôi khi đi kèm với mệt mỏi, sốt và nổi hạch Cả bề mặt da và tóc bị ảnh hưởng Nhiễm trùng của tóc có thể được mô tả như ectothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành ở bên ngoài của sợi tóc) hoặc endothrix (vỏ bọc của bào tử đính có phân đốt, hình thành trong sợi tóc) Nguyên nhân chủ yếu hiện tại của tinea capitis ở hầu hết các khu vực

Bắc, Trung và Nam Mỹ là T tonsurans (endothrix) thay thế M audouinii (ectothrix)

(WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm ở vùng da nhẵn (Tinea Corporis)

Một nhiễm trùng xảy ra ở vùng da nhẵn trên cơ thể, thường liên quan đến thân, vai, tay chân, và đôi khi cả mặt (không bao gồm vùng có râu) có thể bị gây ra bởi bất kỳ loài dermatophyte nào Nhiễm trùng có thể dao động từ nhẹ đến nặng, thường xuất hiện thành vùng như mảng đỏ da, dày da, các mảng bong vảy với giới hạn rõ rệt, xung quanh rìa thương tổn có mụn nước (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm bẹn (Tinea cruris)

Nhiễm trùng ở vùng bẹn, quanh hậu môn, và vùng xương mu, và đôi khi phía

trên bắp đùi, thường được tìm thấy ở nam giới trưởng thành T rubrum và E

floccosum là các tác nhân gây bệnh thường gặp nhất Biểu hiện khi bị nhiễm trùng là

tổn thương da, mảng da lớn hình tròn hay đa cung có giới hạn rõ, trung tâm có màu nâu nhạt, ngã sang màu đỏ có vảy nhẹ, ngoài rìa có mụn nước và vảy Từ một bên nấm có thể lan sang bên đối xứng, lên xương mu, xuống đùi, sau kẽ mông, quanh thắt lưng (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm da mãn tính (Tinea Favosa)

Nấm da do Trichophyton schoenleinii gây ra rất nghiêm trọng và mãn tính, nó

đặc trưng bởi sự xuất hiện trên da đầu và da nhẵn những chấm đỏ phủ vảy tiết vàng, ở giữa lõm xuống, các chấm có thể liên kết thành mảng lớn, trong đó bao gồm các mảnh vỡ biểu mô và dày đặc Tóc thường không rụng,vẫn mọc dài nhưng khô và không bóng Nếu có rụng tóc thì trụi vĩnh viễn Nhiễm trùng này phổ biến nhất ở đại lục Á – Âu và Châu Phi (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm da gây ra bởi T concentricum (Tinea Imbricata)

Tinea Imbricata, một nhiễm trùng mãn tính với sự biểu hiện đặc trưng của Tinea corporis, được xác định bởi các vòng tròn đồng tâm của các mảng bong vảy chồng lên nhau rải rác khắp cơ thể Nhiễm trùng này chỉ xảy ra ở những hòn đảo trên biển

Thái Bình Dương, khu vực Đông Nam Á, Mexico, và Trung và Nam Mỹ T

concentricum, một loại nấm da thuộc nhóm ưa con người, là tác nhân duy nhất gây

ra nhiễm trùng nói trên (WeitzmanI và cs., 1995) + Nấm ở tay (Tinea Manuum)

Khi bị nấm ở tay, các khu vực lòng bàn tay và phía trong ngón tay là nơi thường bị ảnh hưởng nhất, dấu hiệu thường thấy nhất là sự phân bố dày sừng lan tỏa ở lòng

bàn tay sau đó ra mu tay, rìa ngón tay Hầu hết các nhiễm trùng được gây ra bởi T

rubrum (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm ở chân (Tinea Pedis)

Bàn chân, đặc biệt là lòng bàn chân và kẽ ngón chân, là khu vực thường bị nhiễm nấm chân nhất Các biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất là bong tróc vảy da khô, và đường nứt giữa kẻ da, xung quanh kẻ ẩm ướt, chảy nước, thường tăng tiết mồ hôi, đôi khi có đau, xảy ra chủ yếu vào các khe giữa các ngón chân thứ tư và thứ năm Một biểu hiện mãn tính phổ biến khác là dày vảy, sừng: đỏ da, dày da, giới hạn rõ, bong vảy trắng mịn, có ít mụn nước ở rìa thương tổn, vị trí thường gặp: gót chân, lòng bàn chân, rìa bàn chân, mu bàn chân Thường bắt đầu một bên sau lan ra hai bên Trường hợp vị viêm cấp tính, được đặc trưng bởi sự hình thành của mụn nước hoặc bọng nước chứa dịch trong, có mủ khi nhiễm tụ cầu vàng hoặc liên cầu nhóm A thứ

phát Sau đó vỡ để lại vết chợt có bờ tròn lởm chởm Vị trí thường gặp là lòng bàn

chân, mu bàn chân, thường do T mentagrophytes gây ra Có nhiều tác nhân gây tổn thương mãn tính ở chân như là T rubrum, T mentagrophytes var interdigitale và E

floccosum (WeitzmanI và cs., 1995)

+ Nấm móng (Tinea Unguium)

Tổn thương móng do dermatophytes gây ra được gọi là Tinea Unguium , tổn thương móng do nấm không thuộc nhóm dermatophytes được gọi là nấm móng Từ thứ hai thường được sử dụng như một thuật ngữ chung cho một tổn thương ở móng Nấm thường bắt đầu từ bờ tự do hay hai cạnh bên của móng ăn vào, móng mất vẻ bóng, dòn, dày lên có màu trắng bẩn Trên mặt móng bị lỗ chỗ hoặc có những đường rãnh Dưới móng có tích tụ ít bột vụn Ít khi có viêm quanh móng, về sau móng dần dần bị lẹm, phần còn lại xù xì màu vàng đục Bệnh lan từ móng này sang móng kia,

tiến triển qua hàng tháng hàng năm T rubrum và T mentagrophytes là hai tác nhân

phổ biến nhất thuộc nhóm nấm dermatophytes gây ra nhiễm trùng này (WeitzmanI và cs., 1995)

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU