Khảo sát hoạt tính gây độc của cao chiết từ cây trâm bầu (combretum quadrangulare) lên dòng tế bào ung thư máu k562

TKƯỜNG ĐẬI HộC ĩìữmễỉĩ TẤT THẰỈÍH MỈSA ĨỈƠỈỈG NỠJĨIỆ» CƠÍĨG KGHỆ Cí.ữ VÃ CƠĨÍG ĨỈGỈĨỆ 3ỈSI! ?ỈỘG J'SVl 90% tế bào chết) Bảng 3.6: Giá trị IC50 IC90 cao Ethanol lá, rễ, hạt trảm bầu lên dòng tế bào ung thư máu K562 Cao chiết IC50 (pg/ml) IC90 (pg/ml) EtOH 14,98 48,46 EtOH rễ 15,40 78,69 EtOH hạt >100 >100 28 Giá trị IC50 IC90 cùa cao chiết EtOH từ trâm bầu (Bảng 3.6) 14,98 ug'ml 48,46 pg/ml, nhỏ so với giá trị ÍC50 IC90 cao chiết EtOH từ rề hạt Từ cho thấy hoạt tính gảy độc tế bão cũa cao chiết EtOH cao Vi vạy, cao chiêt EtOH từ chọn đế tách chiết cao tổng theo hệ dung môi khac va thư nghiệm khả gây độc dõng tế báo ung thư máu K562 Hình 3.4: Hoạt tính gây độc cao chiết Hexan, Ethyl acetate, HEa Butanol trâm bầu lên dòng tế bào ung thư máu K562 Chứng dương Doxorubicin Bảng 3.7: Giá trị IC50 IC90 cao Hexan, Ethyl acetate, H:Ea Butanol trâm bầu lên dòng tế bào ung thư máu K562 Cao chiết IC50 (pg/ml) IC90(pg/ml) Hexan 13,24 46,62 Ethyl Acetate 42,45 >100 HEa 5.4 11,87 Butanol 100 >100 Hình 3.4 cho thấy đường đồ thị cao H:Ea so với cao ethyl acetate, hexan, butanol có xu hướng dốc (đường đồ thị gần trục thể phần trăm tế bào chết hơn) Tỷ lệ tế bào bị gây độc cao chiết H:Ea tăng nhanh từ nồng độ 3,125 pg/ml 29 đén nồng độ 50 pg/ml, từ nồng độ 50 pg/ml đến 100 ng/ml tác dụng gây độc lên tế bào cao chiết H:Ea từ trâm báu the qua phẩn trăm tế bào chết tăng không đáng kề Bên cạnh đó, dựa vào Bảng 3.7, giá trị IC50 IC90 cao chiết H:Ea từ trâm bầu 5,4 pg/ml 11,87 pg/ml, giá trị nảy thấp so với giá trị IC50 IC90 cao chiết hexan, ethyl acetate butanol Từ kết luận, hoạt tính gây độc tế bào cao H:Ea cao Vì vậy, cao H:Ea chọn để tách chiết cao p thử nghiệm khả gây độc dòng tẽ bào ung thư máu K562 Hình 3.5: Hoạt tính gây độc cao chiết p (A) P1-P4, (B) P5-P8, (C) P9-P11, (D) P12-PAX1 lên dòng tế bào ung thư máu K562 Chứng dương Doxorubicin Theo Hình 3.5, nhìn chung cao chiết Pl - P14 có tác dụng gây độc mạnh tế bào K562, nhỏm cao chiết P8 - P14 có hoạt tính gây độc tế bào tốt Riêng cao chiết PAX có hoạt tính gây độc tế bào K562 30 Bảng 3.8: 1C50 IC90 cao chiết P1-PAX1 trám bầu lên dòng tế bào ung thư máu K.562 IC90 IC90 (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) 19,33 84,83 7,79 15,32 P2 16,74 >100 P10 7,36 15,35 P3 14,33 >100 Pll 9,11 20,82 P4 13,79 >100 P12 8,97 34,91 P5 6,09 42,42 PỈ3 8,37 18,36 P6 13,69 >100 PỈ4 8,63 18.95 P7 6,13 25,82 PAX1 34,0 68,62 P8 8,57 17,72 IC50 IC90 (pg/ml) P1 Cao chiết Cao chiết Dựa vào giá trị IC50 IC90 (Bảng 3.8), cao chiết P5, P7, P8, P9, P10, Pl 1, P12, P13 P14 nhóm cao chiết có hoạt tính gây độc mạnh tế bào, đó, cao chiết có giá trị IC50 IC90 cao cao P7 Neu chi dựa vào giá trị IC50 IC90 P7 cao chiết sử dụng để tiếp tục tách chiết Tuy nhiên, dựa vào thử nghiệm gây độc cao chiết p dòng tế bào ung thư khác dòng tế bào ung thư gan HepG2, cho thấy cao chiết p 12 có hoạt tính cao hẳn cao khác Vì dòng tế bào ung thư máu K562, cao chiết P12 ưu tiên thử nghiệm nhằm so sánh khả gây độc cao chiết dòng tế bào khác nhan Dựa vào đồ thị Hình 3.9, cho thấy đường đồ thị cao phân đoạn T6 so với cao phân đoạn cịn lại có xu hướng dốc (đường đồ thị gần trục thể phần trăm tê bào chết hơn) Do đó, cao T6 có tác dụng gây độc lên tế bào cao cao phân đoạn T lại Tỷ lệ tế bào bị gày độc cao phân đoạn T6 tăng nhanh từ nồng độ 6,25 pg/ml đến nồng độ 25 pg/ml, tương ứng với khoảng 95% tế bào chết Từ nồng độ 25 pg/ml đến 100 ịig/ml hoạt tính gây độc tế bào cao phân đoạn T6 tăng khơng đáng kề 31 Hình 3.6: Hoạt tính gầy độc cao phân đoạn í -19 trâm bầu lên dòng tế bào ung thư máu K562 Chứng dương Doxorubicin Bên cạnh đó, dựa vào Bảng 3.12 3.13 cho thấy: IC50 cao phân đoạn T5 T6 có giá trị nhỏ (10,63 pg/ml) Tuy nhiên, IC90 cao phân đoạn T5 31,76 pg/ml, cao hom so với giá trị IC90 cao phân đoạn T6 (23,33 pg/ml) Từ kết luận, hoạt tính gây độc tế bào cao T6 cao Bảng 3.9 : Giá trị IC50 IC90 cao phân đoạn TI-T9 lên dòng tế bào K562 IC50 IC90 (pg/ml) (pg/ml) T6 10,63 23,33 47,39 T7 28,54 49,98 18,36 47,10 T8 48.41 47,58 10,63 31,76 T9 31,58 48,71 IC50 IC90 (pg/ml) (pg/ml) Tl+2 20,39 80,42 T3 21,28 T4 T5 Cao chiết Cao chiết 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Thơng qua thử nghiệm MTT kết luận ràng cao chiết từ trâm bầu có hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào ung thư máu K562 Trong cao phân đoạn T6 tách chiết từ cao chiết P12 (với cao chiế: tổng H:Ea từ trâm bầu) có hoạt tính gây độc mạnh nhất, thể thông qua giá trị IC50 IC90 10,63 pig/ml 23,33 pg/ml Ngoài ra, phương pháp quan sát hình thái mật độ tế bào K562 sau xử lý cao chiết cho thấy cao chiết từ tràm bẩu (ngoại trừ cao chiết EtOH từ hạt, ethyl acetate từ lá, butanol từ lá) có tác dụng làm giảm mật độ tể bào K562 theo thời gian xử lý cao chiết sau 24 Đề nghị Từ kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào cho thấy cao phân đoạn T6 có tác dụng tốt dịng tế bào K562 Do đó, cao phân đoạn T6 cần tiếp tục đem tách chiết hợp chất xác định chế gây độc lên tể bào K562 33 TÀI UỆƯ THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Thị Tú Anh (2012) Nghiên cứu phán hóa học hoạt tính sinh học lồi mít đen artocarpus nigrifolius c.y.wu, Trang 30 Luận văn Bước đầu phân tích proteomics tế bao bệnh leukemia Nguyễn Bá Đức (2003) Bệnh bạch cầu lymỵhó mãn tinh Hoá chất điểu trị bệnh ung thư Nhà xuất bàn y học 2003 221-22" Nguyễn Bá Đức (1997) Bệnh bạch cầu kinh thể lymphô Bài giáng ung thư học Nhà xuất y học 1997, 283-286 PGS.TS Phạm Duy Hiển, Phản biệt u lành u ác tính, tháng 10 năm 2014 Trần Kim Quy cộng (2000), Quadranosides VI—XI Six New Triterpene Glucosides from the Seeds of Combretum quadrangulare Trung tâm dược liệu Việt Nam,Cậy trâm bầu Viện Dược liệu Việt Nam, Cây trâm bầu công dụng trâm bầu Tiếng Anh Andreas Gewies (2003) Introduction to Apoptosis 34 10 Banskota AU., Tezuka Y., I ran KQ., Tanaka K., Saiki I., Kadota s (2000) Methyl quadrangularales A-I) and related triterpenes from Combretum quadrangulare Chern Pharm Bull 11 Bruce Alberts., Alexander Johnson., Julian Lewis Martin Raff., Keith Roberts., Peter Walter (2008) Molecular Biology of the Cell Garland Science, Taylor & Francis Group ISBN 978-0-8153-4106-2 13 Green, Douglas (2011 )■ Means to an End: Apoptosis and other Cell Death Mechanisms Cold Spring Harbor, NY: Co Spring Harbor Laboratory Press 14 Karam, Jose A (2009) Apoptosis in Carcinogenesis and Chemotherapy Netherlands: Springer 15 Pettit GR., Temple c., Narayanan VL., 1995 Annneoplastic agents 322 Synthesis of combretastatin A-4prodrugs Anti-Cancer Drug Des 16 Rajiv Roy., Raj K Singh., Shyama K Jash., Atasi Sarkar and Dilip Gorai., 2014 Combretum quadrangular (Combretaceae): Phytochemical Constituents and Biological activity, trang 35 PHỊ LỤC Bảng phụ iục 1: Mật độ tế bào đương cong tăng trưởng Ngày Mật độ tế bào (xio3/giếng) 5 20 13 13 17 25 27 29 30 37 39 72 64 70 96 148 98 : 14 158 180 156 210 190 204 lỉ 234 186 200 10 212 12 171 182 Bảng phụ lục 2: Tỷ lệ tế bào chết nồng 2: cao chiết ethanoi '.á rễ hạt vá cao chiết Hexan, ethyl acetate, H:Ea, butane từ iá trám bầu, Ỡ mỗí nồng độ cac chiết, thí nghiệm lặp lại lần Ti lệ tẻ bão chết (%) 1> I •J > '/• Ị 1 , , l > 1* < ", / Ị p/ ỉ '0i ' *3 0.93 /53 • t 36 11.2•4 2.69 15.54 3.30 r.12 60 '9 63.1’l 5'.63 ** 91.94 93.29 94.5' 98."’8 98 44 9$.8' 98/•9 98.45 99.14 98.50 98.33 09.12 21.49 29.17 32.82 48.52 57.80 95.01 98 24 f 11,10 28.94 33.24 48.01 58.41 97.59 97.27 HEa í 21,49 29,17 32,82 48,52 57,80 95,01 98.24 48 > •ỉ 11,10 28,94 33,24 48,01 58,41 97,59 97,27 • 6“.36 90.35 90.84 32? 67,36 90,35 90,84 3.96 18.60 28.35 49^96 f 21,49 29,17 32,82 48,52 57,80 95,01 98,24 4.59 18.47 23.41 37,15 57,02 92.80 98.06 Ethyl acetate Hexan 11,10 28,94 33,24 48,01 58,41 97,59 97,27 3,96 18,60 28,35 49’96 4,59 18,47 23,41 37,15 57,02 92,80 98,06 3,96 18,60 28,35 49,96 67,36 90,35 90,84 r 4,59 18,47 23,41 37,15 57,02 92,80 98,06 EtOH-ạt 3,125 6,25 12,5 25 50 100 Nồng độ (pg/ml) 3,125 6,25 12,5 25 50 100 EtOH rễ EtOH 1J Nồng độ (pg/ml) 52 N Bảng phụ lục 3: Tỳ lệ tế bào chết nồng độ cao Pl - PAX1 từ trâm bầu nóng độ cao chiết, thí nghiệm lập lại lẩn Ti lộ tế báo chết (%) P2 1,84 3,31 1,46 9’58 8*63 16,1 ỉ 39,09 46J0 69,21 70.280,92 80.92 Ạ 1,84 1,53 2,98 11,35 40,71 68,49 80,61 1,53 16,71 21,54 40,24 86,25 97,87 98,43 99,00 24,14 37,14 80,58 97,74 98,10 98,72 37 3,19 18,53 46,69 47,95 70,63 80,84 3,19 2,88 14,37 44,12 46,79 70,00 70,95 80,37 81,08 2,88 6,13 P8 0.00 0,00 0,00 23.59 31,14 32,62 53’79 50,34 51,52 48,48 48,85 93,60 86,66 88,92 97,46 98,38 98,07 98’50 98,95) 99,17 13,11 10,06 11,75 27’97 29,65 31,81 84,42 83,45'84,42 97,68 98,43 98,56 98,10 98,23 98,23 100 98.43 98,29 Pll P12 P10 0,15 25,83 40,31 87,75 98,37 98,43 99,14 3,25 10,34 17,39 46,64 70,87 81,16 3,25 •n rõ 9,07 18,74 47,6" 48,10 70,48 80,84 88,82 3.56 11,03 •."09 46,64 "0,79 81,00 3.56 P7 P6 5,03 18,04 47,29 47,95 70,48 80,61 88,64 P4 P3 oộ Nồng độ P1 (pg/ml) 0,00 1,16 0,49 1,23 3,125 0’90 1,18 5,00 3,12 2,74 10,22 6,25 0’93 12,5 30,31 29,24 30,47 40,86 25 65,79 66,67 67,38 69,44 50 81,16 81,00 81,32 80,13 100 0,00 1,16 0,49 1,23 Nồng P5 độ (pg/ml) 0,00 0,00 0,00 4,72 3,125 9,33 21,09 20,71 18,04 6,25 52,70 51,09 51,55 47,29 12,5 59,46 63,20 58,51 47,48 25 74,84 74,92 74,68 70,40 50 97,00 96,05 96,78 80,84 100 97,45 97,22 97,80 88,73 Nồng P9 độ (pg/ml) 5,44 1,09 3,125 18,88 19,60 14,21 25,31 6,25 42,54 31,95 38,42 45,23 12,5 88,46 87,42 87,16 88,66 25 98,06 97,74 98,06 98,62 50 98,56 97,57 98,10 98,75 100 98,15 98,72 98,65 98,72 Nồng P13 độ (pg/ml) 7,20 4,43 2,04 3,125 19,53 19,86 30,95 6,25 37,34 23,11 38,56 12,5 83,51 82,14 83,64 25 97,93 97,49 98,06 50 98,03 98,03 98,29 100 98,72 98,57 98,93 14,06 23,04 29,32 75,30 96,87 99,21 99,00 14,38 24,46 ỉ 25,40 74,78 96,12 99,93 99,14 9,15 22,71 27.09 80.97 96,55 98.69 99.43 3,74 11.94 45,10 68,46 9066 91.86 99.43 2,60 19,40 39,97 83,64 86,97 93,04 99,00 P14 PAX1 26,61 37,88 80,25 97,81 98,16 98,50 10,62 8,77 11,05 24,88 38,90 84,70 99,32 1,95 16,57 84,03 98,06 97,77 97,58 24,39 18,15 0,41 28,95 85,78 98,71 6,44 30,18 37,61 33,39 87,09 93,11 99,79 1,89 8,70 4,02 23,81 83,41 99,16 Bảng phụ lục 4: Ti lệ tế bào chết nồng độ cao TI - T9 trâm bầu Ở mói nơng độ cao chiết, thí nghiệm lập lại lân Nông độ (pg/ml) 3,125 6,25 12,5 25 50 100 Nồng độ (pg/ml) 3,125 6,25 12,5 25 50 100 Tl+2 9,13 10,02 13,41 21,50 64,63 74,93 9,13 0,81 10,02 12,91 23,96 64,24 76,58 0,81 9,13 10,02 13,41 21,50 64,63 74,93 9,13 9,81 4,67 9,90 23,35 64,39 91,59 9,81 4,60 17,24 25,47 61,21 94,79 98,20 98,86 13,53 5.51 8.11 19.8Ỉ 61,44 95.11 13.53 6,90 4.88 14.85 43.05 65.95 94.32 6.90 6,70 0,72 25,90 54,82 95,41 98,35 97,95 8,24 9,07 17,41 30,16 43,58 88,60 99,29 10,19 9,00 17,08 30,23 44,93 91,02 99,38 18.81 18,27 8,77 14.06! 5,38 26.42 39,74 61 98 68,28 92.67 92,67 18.81 18,27 11,43 0,88 27,17 13,49 33,72 47,63 53,36 54,59 87,79 88,49 93,68 96,34 0,88 11,43 T9 T8 T7 T6 19,96 15,30 38,95 59,36 94,40 97,77 98,94 9,88 5,51 6,38 19,88 61,05 92,96 9,88 T5 T4 T3 7,0’ 4.47 11,26 26,14 41,68 90,50 99,20 38 4.92 4.40 12,78 32,99 49,54 95,02 98,58 6.48 4,73 10,14 30,50 47,84 94,63 97.96 4,79 6,57 14,30 25,93 43,51 94,17 98,58 4,20 5,77 9,11 36,19 93,45 97,79 10,25 15,11 9,15 19,01 38,29 92,92 97.79 98,41 3,62 223 7,23 6,69 29,42 92^66