Khảo sát hoạt tính gây độc của cao chiết từ cây trâm bầu trên dòng tế bào ung thư gan hepg2

TRW&m w hi S®8RSY>ĨÍ TẴT TĩTĂ7^ KHOA ĨĨỐỈ5G WemtJP KSM CAO YẰ CƠN® NGrĩỆ SĩNH Hóc KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP 5§1: »aio SÍT HOẠT TÍNH CÃYBỘC CỦA CAO curtfr TỪ CÂY TRẦM BÍO TRÉN DỊNG tẾbÀo ỮNổ THỮ 6AN HEP62 SVTH ỉ TRƯƠNG ĐOẪN HƠNG HẢỈ NGẲNH í CỔNG NGHỆ SỈNH HỌC KHĨA ỉ 2015 - 2017 G¥HD : TS NG ưYỐN H ũ*ư HỪNG uyển Tất Thành tin - Thu- viện 321 71Đ 017 001629 HỒ CHÍ MINH ■ NĂM 2017 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GẢY DỘC CỦA CAO CHIÉT TỪ CÂY TRẢM BẤU TRÊN DÒNG TÉ BÀO ƯNG THƯ GAN HEPG2 TRƯƠNG ĐỒN HỒNG HÃI Khóa luận đệ ưình để đáp ứng yêu cảu cáp băng Kỹ sư ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hữu Hùng TRƯỜNG ĐH NGUYỀN TAT THÀNH TRUNG TÀM THÒNG TIN-THƯVIỆN L\JO(MC100 >100 3.3.Z.2 Hoạt tính gây độc cao chiết hexan, ethyl acetate, butanol, H:Ea từ trâm bầu lên dòng tế bào HepG2 Dựa vào đồ thị Hình 3.4, đường đồ thị thể khả gây độc cao chiết hexamethyl acetate lên tế bào HepG2 so với cao chiết hexan, ethyl acetate butanol có xu hướng dốc (đường đồ thị gần trục thể phần trăm tế bào chết nhiều hơn) Do đó, hexan:ethyl acetate có tác dụng gây độc lên tế bào cao so với cao lại Từ nồng độ 3,125 pg/ml đến 12,5 pg/ml tác dụng gây độc lên té bào cao H:Ea khơng có khác biệt đáng kể Tỷ lệ tế bào bị gây độc cao H:Ea tăng nhanh từ nồng độ 12,5 pg/ml đến nồng độ 100 pg/ml, tương ửng với khoảng 90% tế bào chết 31 -“S- Hexan Ethyl acetate -Í- Butanol -*- Dcxorubicine Hình 3.4 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết eữụ acetate lá, hexan lá, butanol cao H:Ea dòng tế bào HepG2 Chứng dưomg: Doxorubicin Bên cạnh đó, Bảng 3.7 giá trị IC50 IC90 cúa cao chiết hexan, ethyl acetate, butanol H:Ea từ trâm bầu cho thấy IC50 IC90 cao chiết H:Ea lẩn lượt 21,73 pg/ml 46,11 pg/ml, thấp hom hẳn so với giá trị IC50 1C90 cùa cao hexan lá, ethyl acetate butanol Vì thể, cao chiết H:Ea từ chọn đê tiếp tục đem tách chiết phân đoạn từ P1 đến PAX1 thử nghiệm trẽn te bào HepG2 Bảng 3.7: Giá trị IC50 IC90 cùa cao chiết hexan, ethyl acetate, butanol H:Ea từ trâm bầu dòng tế bào HepG2 Cao chiết IC50 (pg/ml) IC90 (pg/ml) Hexan 39,08 87,70 Ea >100 >100 Butanol >100 >100 H:Ea 21,73 46,11 3.3.2.3 Hoạt tính gây độc cao chiết H:Ea phân đoạn từ P1 đến P14 PAX1 lên dòng tế bào HepG2 Dựa vào đồ thị Hình 3.5, đường đồ thị thể khả gây độc cao H:Ea phân đoạn P12 lên tế bào HepG2 so với cao phân đoạn từ P1 đển PAX1 có xu hướng dốc hom (đường đồ thị gần trục thề phần ưăm tế bào chết nhiều hom) Do 32 đó, cao phán doạn p 12 có tác dụng gáy dộc tế bão cao so với cao lại Tý lệ tế bào bị gày độc cao ll:Ea phán doạn PI2 táng nhanh từ nồng độ 3,125 pg/ml đến nồng độ 100 pg/ml, tương ứng với khoang 90% tế bào chết Hình 3.5 Hoạt tính gây độc tế bào cao phân đoạn p với (A) Pl - P4, (B) P5 - P8, (C) P9 - P12, (D) P13 - PAX1 dòng tế bào HepG2 Chứng dương: Doxorubicin Bên cạnh đó, Bảng 3.8 cho thấy IC50 cao chiết H:Ea phàn đoạn từ P1 đến P14 PAX1 với phân đoạn P12 có nồng độ 1C50 16,61 Ịig/ml có IC90 45,16 pg/ml thấp so với phân đoạn cịn lại Vì thế, chọn cao chiểt H:Ea phân đoạn P12 từ trâm bầu để tiếp tục đem tách chiết phân đoạn nhò hơn, phân đoạn từ TI đến T9 thử nghiệm tế bào 33 Bảng 3.8: Giá trị IC50 IC90 cúa cao phân đoạn Pl đến P14 vả PAX1 dòng tế bào HepG2 Cao 1C50 IC90 Cao IC50 IC90 chiết (pg/ml) (pg/ml) chiết 100 >100 P9 16.69 95,99 P2 92,70 >100 P10 16.94 91,54 P3 >100 >100 Pll P4 37,46 >100 P12 16.61 45,16 P5 20,48 >100 P13 17,13 91,75 P6 15,56 >100 P14 2Ô.31 91,92 P7 17,70 >100 PAX1 70,27 95,81 P8 10,69 >100 54,43 3.3.2.4 Hoạt tính gây độc cùa cao chiết H:Ea phân đoạn từ TI đến T9 lên dòng tế bào HepG2 Nồng độ (pg/ml) Hình 3.6 Hoạt tính gây độc tế bào cao phàn đoạn T với (A) TI - T5, (B) T6 - T9 dòng tế bào HepG2 Chứng dương: Doxorubicin Dựa vào đồ thị Hình 3.6, đường đồ thị thể khả gày độc cao chiết phân đoạn T6 lên tế bào HepG2 so với cao phàn đoạn từ TI đến T9 có xu hướng dốc hon (đường đồ thị gần trục thề phần trăm tế bào chết nhiều hon) Do đỏ, cao phân đoạn T6 có tác dụng gây độc lèn tể bào cao hon so với cao lại Tỷ lệ tế 34 bào bị gây độc cao phân đoạn 'í lăng nhanh từ nồng độ 3,125 pg/ml đến nồng độ 100 pg/ml, lương ứng với khoảng 90% tế bão chết Bên cạnh đó, Bảng 3.9 cho thấy IC50 IC90 cao chiết H:Ea phân đoạn lư ĩ đến T9, phân đoạn T6 có giá trị IC50 11.23 pg/ml có IC90 42,18 pg/ml thấp so với phân đoạn lại Bảng 3.9: Giá trị IC50 IC90 cao phân đoạn TI đến 19 dòng tế bào HepG2 Cao chiết IC50 (pg/ml) IC90 (pg/ml) Tl+2 69,77 >100 T3 19,84 >100 T4 18,85 42,04 T5 6,98 >100 T6 11,23 42,18 T7 20,91 45,23 T8 14,18 43,00 T9 25,63 47,51 35 KÉT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ Kết luận Với phương pháp quan sát hình thái mật độ bám trãi tế bào HepG2 sau xử lý cao chiết cho thấy cao chiết từ trâm bầu (ngoại trữ cao chiết EtOH từ hạt, ethyl acetate từ lá, butanol từ lá) có tác dụng làm giãm mị: độ bám trải HepG2 sau 24 xử lý Theo kết thử nghiệm MTT, cao chièt ethanol, cao chiết ethanol từ có tác dụng gây độc dòng tế bào HepG2 cao với IC50 46,67 pg/ml IC90 92,33 pg/ml Đối với cao chiết tổng từ cao chiết ethanol lá, cao chiết H:Ea có tác dụng gây độc dòng tế bào HepG2 cao với IC50 21,73 Ịig/ml IC90 46,11 pg/ml Đối với cao chiết phân đoạn p từ cao chiết H:Ea lá, cao chiết phân đoạn P12 có tác dụng gây độc dịng tế bào HepG2 cao với IC50 16,61 pgzml IC90 45,16 pg/ml Đối với cao chiết phân đoạn T từ cao chiết P12, cao chiết phân đoạn T6 có tác dụng gây độc dịng tế bào HepG2 cao với IC50 11,23 pg/ml IC90 42,18 pg/ml Như vậy, cao chiết phân đoạn T6 từ tràm bầu có tác dụng gây độc tế bào mạnh dòng tế bào HepG2 Đề nghị Từ kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào cho thấy cao phân đoạn T6 có tác dụng tốt dịng tế bào HepG2 Do đó, cao phần đoạn T6 cần tiếp tục đem tách chiết hợp chất xác định chế gây độc lên tế bào HepG2 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bui Xuan I ỉao, I ran Kim Q, 2011 Nghiên cứu thành phán hóa học trâm bầu Combretum Quadrangulare Kỷ yếu Hội nghị - Hội thào (LIC), Đại học Quốc gia Hà Nội Trang 317-320 Le Thi Tú Anh, 2012 Nghiên cứu thành phán hóa học '.à hoạt tinh sinh học lồi mít đen Artocarpus nigrifolius c Y wu Luận vãn thạc sĩ khoa học Đại học Khoa học tự nhiên, trang 12 Phan Nhật Trường, 2012 Tìm hiêu sơ thành phả?: hóa học cùa trâm bầu — Combretum quadrangulare Kurz Luận văn tốt nghiệp trường Đại học cần Thơ, 42 trang Trần Thị Phương Chi, Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Huỳnh Phương Trung, Mai Lý Bằng, Lê Hưng Đạt, Trần Ái Liên, Trần Thị Hiển Trịnh Kim Phương, Huỳnh Thị Hồng Thảo, Đặng Thanh Điền, Trần Hồng Loan, Dương Minh Hồng, 2016 Nghiên cứu tỉnh hình mắc ung thư gan yểu tỏ nguy dẫn đến ung thư gan bệnh viện ung birớu cần thơ Đại học Võ Trường Toàn, trang 3-4 Võ Vãn Chi Từ điển thuốc Việt Nam (bộ mới), tập 2, 2013 NXB Y học 3000 trang Tiếng Anh Arjun H Banskota, Yasuhiro Tezuka, Kim Qui Tran Ken Tanaka Ikuo Saiki and Shigetoshi Kadota., 2000 Thirteen Novel Cycloartane-Type Triterpenes from Combretum quadrangulare Journal ofNatural Products Page 57-64 Arjun II Banskota, Yasuhiro Tezuka, Jeevan K Prasain Katsumichi Matsushige Ikuo Saiki, and Shigetoshi Kadota., 1998 Chemical Constituents of Brazilian Propolis and Their Cytotoxic Activities Journal of Natural Products Page 896-900 I Ketut Adnyana, Yasuhiro Tezuka Arjun H Banskota Kim Qui Tran, and Shigetoshi Kadota., 2001 Three New Triterpenes from the Seeds of Combrctum quadrangulare and Their Hepatoprotective Activity Journal of Natural Products Page 360*363 .lun-ya Ueda, Yasuhiro Tezuka Arjun Hari Banskota Quan l.e I ran, Qui Kim Iran, Yuko llarimaya Ikuo Saiki, Shigetoshi Kadota 2002 Antiproliferative Activity of Vietnamese Medicinal Plants ỉỉiologìcaỉ and Pharmaceutical litillelin Vol 25, No Page 753*760 37 10 Kazufumi Toumc, Takafumi Nakazawa Takashi Ohtsuki, Midori A Arai, Takashi Koyano, Thaworn Kowithayakorn and Masami Ishibashi., 2011 Cycloartane Triterpencs Isolated from Combrctum ạuadrangulare in a Screening Program for Death-Receptor Expression Enhancing Activity Journal of Natural Products Page 249-255 11 Rebecca SY Wong., 2011 Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment National Center for Biotechnology Information Vo 30 (1), page 4-10 12 Wimaluk Nopsiri, Sunee Chansakaow, Sompom Pu’dyanan Surapol Natakankitkul and Dammrong Santiarwom., 2014 Antioxidant and Anticancer Activities from leaf extracts of four Combretum species from nonhem Thailand CMU Journal ofNatural ofSciences Vol 13 (2), page 195-205 Tài liệu internet 13 Combretum quadrangulare National Institute of Medicinal Materials (NIMM) 14 Thực trạng gia tăng bệnh gan Việt Nam toàn giới 2015 Peacelife 15 All Cancers (excluding non-melanoma skin cancer) Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012, 2015 International Agency for Research on Cancer 16 World cancer factsheet., 2012, International Agency for Research on Cancer PHỤ LỤC Bang phụ lục 1: Mật dộ tê bào dường cong táng trưởng Thí nghiệm lặp lại lần Ngày Mật độ tế bao (X IU tế bào /cm2) 15 36 90 15 15 126 207 90 27 45 306 308 360 440 162 288 126 252 -21 11 12 480 440 360 270 400 480 333 10 480 480 500 288 333 Bảng phụ lục 2: Tỷ lệ tế bào chết nồng độ cùa cãc cao chiết ethanol lá, rễ, hạt cao chiết Hexan, ethyl acetate, butanol H:Ea rứ trâm bầu Tại nồng dộ cao chiết thí nghiệm lặp lại lần Nồng độ (pg/rnl) 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 Cao chiết EtOH EtOH rễ EtOH hạt Tỷ lệ tế bào chết (%) 15.95 15.36 14.79 10.27 11.03 62.00 95.22 10.62 0.39 1.07 4.24 2.86 9.81 95.60 2.11 4.16 2.62 17.64 39.31 5.77 57.87 96.27 0.82 3.89 0.62 0.42 0.59 50.54 96.56 1.78 2.20 0.66 3.83 11.71 91.30 2.04 6.45 00 3.28 0.43 15.66 42.27 2.35 1.61 5.77 11.38 95.41 0.02 9.30 10.67 6.22 5.12 31.66 56.42 0.53 1.78 0.47 Caọ chiết Hexan Ethyl acetate Butanol H:Ea 40 Tỳ lệ tế bào chết (%) 18.62 20.25 18.84 14.96 13.45 63.40 93.21 3.27 2.95 6.92 5.37 0.82 17.43 4.42 3.25 1.22 2.53 8.00 19.91 3.125 6.25 12.5 25 50 100 12.71 8.57 4.60 6.14 21.70 83.35 95.79 18.19 13.17 11.57 4.71 4.15 9.73 11.79 12.06 8.64 5.57 2.01 15.23 80.46 94.93 14.30 12.59 13.74 8.28 7.87 13.60 15.99 2.80 3.02 10.27 16.77 32.73 39.98 5.50 11.12 4.39 6.66 0.33 26.03 1.47 5.36 9.54 17.34 69.26 95.05 97.32 8.20 5.05 3.44 60.69 94.56 97.90 Bang phụ lục 3: y lệ tê bào chêt lại mói nóng độ cao chiết Pl — PAX1 từ cao chiêt H:Ea trâm bầu Tại nồng độ cao chiết thí nghiệm lặp lại lần Nồng độ (pg/ml) 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 Cao chiết P1 P2 P3 P4 P5 P6 Tỷ lệ tế bào chết (%) 2.57 3.29 3.60 13.27 24.06 28.79 21.85 9.60 10.23 9.96 26.51 33.55 31.75 53.53 20.11 25.21 40.40 43.90 38.91 34.67 44.84 8.37 21.07 35.71 35.99 35.34 62.96 69.38 12.49 37.01 34.22 33.14 59.99 81.07 85.16 16.07 32.78 31.67 46.60 62.98 5.50 23.90 27.53 22.22 1.07 11.70 17.85 26.59 33.40 32.43 48.42 13.37 16.99 32.39 41.85 37.11 33.17 50.19 7.06 7.99 5.45 13.43 24.54 29.47 24.59 5.11 4.60 15.52 21.04 35.07 31.92 57.27 3.31 17.92 31.55 42.54 37.04 36.26 50.82 5.98 36.61 36.14 32.35 65.08 73.35 12.49 32.01 36.76 26.77 56.52 82.05 84.81 6.92 21.92 31.14 43.01 62.18 27.00 34.37 33.72 37.12 67.45 69.96 9.36 33.62 32.94 24.80 70.42 79.36 86.21 12.87 34.16 36.54 45.87 69.61 7.38 41 Cao chiết Tỳ lệ tế bào chết (%) P9 5.49 21.57 18.01 49.16 63.31 81.90 91.69 P10 Pll P12 19.10 13.74 40.49 55.33 79.62 89.32 25.12 19.30 43.19 64.34 81.31 90.78 0.00 9.07 19.54 10.57 51.90 90.78 97.17 6.54 14.63 15.36 47.85 65.38 96.99 P13 P14 16.02 13.02 46.38 62.51 78.27 92.33 0.00 16.40 17.21 45.56 57.80 27.04 19.30 40.98 64.58 81.73 91.87 0.00 16.94 22.12 13.27 48.47 86.38 96.07 6.91 15.32 17.53 44.33 61.87 90.78 96.44 5.86 23.80 17.21 43.76 60.44 78.77 93.34 17.10 19.14 43.76 55.73 23.73 21.56 44.82 62.19 82.83 91.24 4.51 25.27 15.92 42.45 63.55 82.41 92.33 0.00 12.08 20.27 12.21 51.98 90.87 96.99 9.07 11.73 39.26 60.68 90.44 97.44 15.94 13.26 40.25 60.36 78.94 91.05 0.00 23.50 14.15 37.38 50.47 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 P7 P8 80.09 84.34 21.80 32.47 34.37 31.38 67.43 70.87 76.63 14.32 29.93 21.18 53.18 71.39 83.52 85.39 80.01 84.11 8.29 30.54 33.39 37.23 80.52 73.97 74.87 6.77 32.01 34.74 67.08 55.63 84.50 84.22 78.87 83.76 13.10 32.16 31.89 28.97 75.67 71.61 77.91 21.19 36.32 33.02 54.57 65.57 84.74 84.34 42 PAX1 78.18 93.34 71.75 92.24 14.16 6.66 17.60 27.25 19.32 97.72 22.19 13.83 20.22 25.58 17.97 95.89 76.66 92.79 2.57 22.11 17.93 17.77 29.25 17.46 96.07 Bảng phụ lục 4: Tý lệ lê bào chết lại nông dộ cùa cao phân doạn TI - T9 tù cao chiết p 12 Tại nông dộ cao chiết thí nghiệm dược lặp lại lần Nồng độ (pg/ml) 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 3.125 6.25 12.5 25 50 100 Cao chiết Tl+2 T3 T4 T5 Fhân trăm tê bào chết (%) 11.70 5.79 20./2 29.05 19.87 14.55 26.39 24.38 23.98 33.38 26.76 28.69 27.65 24.46 34.21 26.60 r 27.86 81.83 81.01 80.92 9.04 9.04 23.41 23.82 13.98 28.42 29.13 32.38 47.32 35.19 43.17 63.23 42.12 61.73 86.94 87.28 85.77 88.48 89.37 89.37 4.35 3.37 5.50 9.56 13.59 17.18 10.08 2.42 20.10 35.47 25.22 24.68 73.78 66.89 72.00 98.76 98.88 99.13 97.94 98.08 98.49 9.57 9.13 33.46 39.10 35.41 50.02 47.58 45.25 70.68 65.12 68.05 91.15 89.79 89.65 89.96 92.13 91.13 90.79 89.01 89.01 43 Cao chiết T6 T8 T9 Phẩn trăm tế bào chết í%ì 2.47 33.46 31.66 31.23 46.21 44.30 36.10 52.79 53.95 49.23 79.03 79.41 78.65 95.42 95.13 94.43 93.01 92.88 93.26 3.40 3.91 7.14 16.59 15 82 14.53 22.27 23.91 24.54 23.89 20.71 22.16 63.82 64.96 61.74 97.12 97.12 94.53 96.88 97.50 94.25 6.36 9.30 11.71 32.23 33.25 37.66 39.17 39.57 37.95 46.61 47.62 42.26 84.07 78.08 75.08 95.15 93.81 93.81 96.63 95.57 96.28 0.30 0.83 33.87 34.79 35.30 39.57 41.30 37.04 41.25 40.44 41.46 48.52 51.11 46.89 94.81 94.81 94.14 95.04 94.51 93.98