Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 của một số hợp chất từ cây trâm bầu Combretum quadrangulare.pdf

ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY Độc TÉ BÀO UNG THƯ GAN HEPG2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY TRÂM BẦU Combretum quadrangulare Sinh viên thực : Văn Hồng Hạnh MSSV : GVHD : TS Nguyễn Hữu Hùng 1411527514 ThS Nguyễn Thị Phương TP HCM, 2019 ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY Độc TÉ BÀO UNG THƯ GAN HEPG2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ CÂY TRÂM BẦU Combretum quadrangulare Sinh viên thực : Văn Hồng Hạnh MSSV : Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học GVHD : TS Nguyễn Hữu Hùng 1411527514 ThS Nguyền Thị Phuơng TP HCM, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYÊN TẤT THÀNH KHOA CÒNG NGHỆ SINH HỌC CỘNG HÒA XÀ HÔI CHÙ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc - -oOo - NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Họ tên: Văn Hồng Hạnh MSSV: 1411527514 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Lớp: 14DSH02 Đầu đề luận văn Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 số hợp chất từ trâm bầu Combretum quadrangulare Mục tiêu - Xác định khả gây độc tế bào ung thư gan HepG2 hợp chất trâm bầu thơng qua: hình thái tế bào giá trị IC50 họp chất - Đánh giá ảnh hưởng cùa họp chất từ trâm bầu lên biểu gene survivin Nội dung - Đánh giá khả gây độc tế bào HepG2 hợp chất trâm bầu - Tác động hợp chất tách chiết từ trâm bầu lên biếu gene survỉvin Thời gian thực hiện: tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Người hướng dẫn 1: TS Nguyễn Hữu Hùng Người hướng dần 2: ThS Nguyền Thị Phưong Nội dung yêu cầu KLTN thông qua Bộ môn TP HCM, ngày tháng năm2019 Bộ MƠN CÁN Bộ HƯỚNG DẢN LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hữu Hùng ThS Nguyễn Thị Phương theo sát suốt q trình nghiên cứu, tận tình dạy cho tơi kiến thức truyền đạt nhiều kinh nghiệm nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường tồn thể q thầy Khoa Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành TP Ho Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận nghiệp Tập thể nhóm thực tâp sinh Israel, cố gắng nồ lực học tập, giúp đỡ, động viên cho nhiều kỷ niệm đẹp thời sinh viên Cuối xin cảm gia đình ln bên cạnh, ủng hộ động viên đe có thêm nghị lực tiếp bước đường học tập sống Văn Hồng Hạnh Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT iv SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIẾU vii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ung thư gan 1.2 Quá trình apoptosis 1.3 Phương pháp MTT 1.4 Survivin 1.4.1 So lược survivin .4 1.4.2 Vai trò survivin ung thư 1.5 Tông quan vê trâm bâu 1.5.1 Giới thiệu trâm bầu 1.5.2 Đặc điểm hình thái 1.5.3 Tình hình nghiên cứu hợp chất từ trâm bầu CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 11 2.1 Nơi thực 11 2.2 Vật liệu nghiên cứu 11 ii 2.3 Phương pháp nghiên cứu 12 2.3.1 Đường cong tăng trưởng 12 2.3.2 Phương pháp MTT 15 2.3.3 Tác động hoạt chất lên biếu survivin mức độ phiên mã 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Đường cong tăng trưởng 20 3.2 Ánh hưởng DMSO doxorubicin lên mật độ bám tế bào HepG2 theo thời gian 21 3.3 Ảnh hưởng hợp chất từ trâm bầu lên tế bào ung thư gan HepG2 theo thời gian xừ lý 22 3.4 Ánh hưởng cùa DMSO lên sức sống tế bào HepG2 23 3.5 Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 hợp chất T66, T61 T6X 24 3.6 Ảnh hưởng T66 lên biểu gene survivỉn mức độ phiên mà 26 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC 33 iii TÓM TẤT Ung thư gan bệnh ung thư phổ biến đứng thứ tư nguyên nhân gây tử vong giới Việt Nam Do đó, khuynh hướng nghiên cứu hợp chất chiết xuất từ thực vật tự nhiên nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Theo nhà nghiên cứu trước đây, trâm bầu Combretum quadrangulare loại chứa hợp chất gây độc lên tế bào ung thư gan HepG2 Đe tài: “Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 số họp chất từ trâm bầu Combretum quadrangulare” thực từ tháng 02/2019 đến tháng 8/2019 Phịng thí nghiệm Te bào gốc - Te bào ung thư thuộc khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Nguyễn Tất Thành Địa chỉ: 2374 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, TP HCM Mục tiêu đề tài xác định hoạt tính gây độc lên tế bào ung thư HepG2 số họp chất tách chiết từ trâm bầu Combretum quadrangulare ảnh hưởng hợp chất lên biểu mRNA gene survivỉn Đe tài có hai nội dung: Đánh giá khả ức chế gây độc tế bào HepG2 họp chất trâm bầu tác động họp chất tách chiết từ trâm bầu lên biếu gene survivin Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Hợp chat T66 tách chiết từ trâm bầu gây độc mạnh tế bào HepG2 với giá trị IC50 20,09 ± 0,23 pg/ml Họp chất T66 tách chiết từ trâm bầu làm giảm biểu gene survivin, gene ức chế trình apoptosis tế bào HepG2 IV SUMMARY Liver cancer is the fourth most common cause of death in Vietnam and over the world Therefore, the tendency to search for new compounds extracted from natural plants is of great interest to researchers According to previous studies, Combretum quadrangulare is a plant contains toxic compounds on HepG2 liver cancer cells This study entitled "Study on HepG2-liver cancer cell cytotoxicity of the compounds from Combretum quadrangulare" was implemented from February 2019 to August 2019 at Stem Cell Laboratory - Cancer cells, Faculty of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University Address: 2374 Highway 1A, Trung My Tay Ward, District 12, Ho Chi Minh City With the aim to determine the toxic activity on HepG2 liver cancer cells of some compounds isolated from Combretum quadrangulare and its effect on mRNA expression of survivin The topic has two contents: Evaluate the cytotoxicity ability of compounds from Combretum quadrangulare on HepG2 cells and effect of the best cytotoxic compound on expression of survivin gene The results achieved after six months of research: The compound T66, a triterpenoid compound isolated from Compretum quadrangulare is the strongest toxicity on HepG2 cells with IC50 value is 20,09 ± 0,23 pg/ml compare to T61 and T6X compound The compound T66 reduces expression of survivin gene, an anti-apoptotic gene in HepG2 liver cancer cell V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Bản đồ biếu diễn ước tính so lượng ca mắc ung thư toàn giới năm 2012 Hình 1.2 Số lượng người tử vong ung thư giớinăm 2016 .2 Hình 1.3 Phản ứng MTT biến đối thành Formazan Hình 1.4 Cấu trúc chức protein survivin Hình 1.5 Hình thái trâm bầu Combretum quadranguỉare Hình 2.1 So đồ tóm tắt thí nghiệm sàng lọc cao phân đoạn trâm bầu có hoạt tính tốt tế bào HepG2 (T6) chứa hoạt chat T66, T61 T6X thử nghiệm hoạt chất sử dụng nghiên cứu 12 Hình 3.1 Đo thị đường cong tăng trưởng tế bào ung thư gan HepG2 số lượng tế bào thể giá trị trung bình ba lần lặp lại độ lệch chuẩn SD 20 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ DMSO (0-1%) lên sức sống tế bào ung thư gan HepG2 Các cột the giá trị trung bình ba lần lặp lại độ lệch chuan SD 24 Hình 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 họp chat T66, T61, T6X tách chiết từ trâm bầu đối chứng dưong Doxorubicin nồng độ 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 100 pg/ml Tỷ lệ tế bào chết the giá trị trung bình ba lần lặp lại độ lệch chuẩn SD 25 Hình 3.4 Bảng điện di gel agarose 1% sản phẩm RNA tổng số sau tách chiết từ tế bào HepG2 xử lý với PBS (giếng 1), DMSO (giếng 3) hợp chat T66 (giếng 4) M: Marker, thang DNA .28 Hình 3.5 Bảng điện di gel agarose 1% sản phấm PCR gen GAPDH survivin tế bào HepG2 xử lý với PBS, DMSO hợp chất T66 29 vi DANH MỤC BẢNG BIÉU Bảng 1.1 Số liệu đánh giá khả ức chế tế bào thành phần hợp chất trâm bầu Combretum quadrangulare Bảng 2.1 Thành phần phản ứng RT-PCR 18 Bảng 2.2 Danh sách cặp mồi sử dụng phản ứng PCR 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng DMSO Doxorubicin lên mật độ bám tế bào HepG2 theo thời gian Thanh kích thước 100 pm 21 Bảng 3.2 Ảnh hưởng cao chiết lên mật độ bám tế bào HepG2 theo thời gian xử lý hợp chất Thanh kích thước 100 pm 23 Bảng 3.3 Giá trị IC50 hợp chat T66, T61, T6X trâm bầu dòng te bào ung thư gan HepG2 25 Bảng 3.4 Ket đo độ hấp thụ quang học định lượng RNA tống số 27 vii ... nhà nghiên cứu trước đây, trâm bầu Combretum quadrangulare loại chứa hợp chất gây độc lên tế bào ung thư gan HepG2 Đe tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 số họp chất từ trâm. .. hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 số hợp chất từ trâm bầu Combretum quadrangulare Mục tiêu - Xác định khả gây độc tế bào ung thư gan HepG2 hợp chất trâm bầu thông qua: hình thái tế bào. .. kháng tế bào ung thư mạnh phân đoạn mà từ tách chiết ba hoạt chất sử dụng nghiên cứu Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan HepG2 số họp chất từ trâm bầu Cotnbretuni quadrangulare”