khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết nấm tre phallus indusiatus lên tế bào ung thư vú

Ngoài giá trị về dinh dưỡng, một số loại nấm cũng là nguồn cung cấp các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe ví dụ như chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, giảm cholesterol, kích

Đại cương về nuôi cấy tế bào động vật

Khái niệm

Nuôi cấy tế bào động vật là quá trình duy trì và tăng sinh các tế bào, mô hoặc cơ quan động vật ở bên ngoài cơ thể (in vitro) trong môi trường nhân tạo Môi trường nhân tạo bao gồm các yếu tố như nhiệt độ, pH và các thành phần dinh dưỡng được thiết kế sao cho tương đồng nhất với các điều kiện trong cơ thể sinh vật (in vitro) để tế bào có thể tồn tại và tăng sinh

Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở hai dạng chính:

- Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào), có hình cầu và nằm lơ lửng trong môi trường nuôi cấy Ví dụ như dòng tế bào thu từ máu: leukamia, lymphoma

- Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi, sau một thời gian nuôi cấy, đáy của dụng cụ nuôi cấy sẽ được phủ hết bởi lớp tế bào đơn liên tục Hầu hết các tế bào động vật đều là tế bào bám dính ví dụ như tế bào nguyên bào sợi và tế bào biểu mô.

Đặc điểm của tế bào động vật

- Tính cơ học yếu: Tế bào động vật không có lớp vách tế bào như vi sinh vật hay tế bào thực vật nên dễ bị biến dạng và vỡ Trong quá trình nuôi cấy cần thao tác nhẹ nhàng, tránh những tác động cơ học mạnh

- Tăng trưởng chậm: Quá trình trao đổi chất ở tế bào động vật chậm hơn nhiều so với vi sinh vật, dẫn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào động vật cũng chậm hơn

Vì vậy, thời gian nuôi cấy tế bào động vật thường kéo dài, gây kéo dài và tăng nguy cơ nhiễm

- Cơ chế kìm hãm ngược: Sau một thời gian nuôi cấy, nồng độ cao của chất cần biểu hiện được tích lũy trong môi trường sẽ ức chế tế bào tổng hợp tiếp chất đó

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 5

Nếu tiếp tục giữ nguyên trong thời gian dài, tế bào sẽ bị tổn thương và chết Vì vậy, cần phải thay môi trường mới cho các tế bào sau mỗi khoảng thời gian nhất định

- Cần giá đỡ: Hầu hết tế bào và mô động vật đều cần bám vào giá đỡ hoặc bề mặt rắn mới có thể sống và phân chia Do đó, bề mặt của các bình nuôi cấy thường phải được xử lý trước khi nuôi cấy như phủ bề mặt (bằng collagen hoặc poly-D- lysine), bổ sung giá thể (polymer bọt biển, gốm)

- Có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình: Nếu tế bào động vật được nuôi cấy trong thời gian dài có thể xảy ra các quá trình như dung hợp và biến nạp Dẫn đến các tế bào bị biến đổi kiểu gen và kiểu hình

- Có thế bảo quản và lưu trữ trong nitơ lỏng: Tế bào động vật có thể được bảo quản và lưu trữ trong nhiều năm ở nitơ lỏng (-196 0 C) Khi được rã đông, tế bào vẫn có khả năng tăng sinh và phân chia như lúc đầu

- Kém thích nghi với môi trường: Khi được chuyển sang nuôi cấy trong một môi trường hoàn toàn mới, tế bào động vật thường thích nghi chậm và có thể chết Cần có quá trình để tế bào thích nghi với môi trường mới Quá trình thích nghi có thể thực hiện bằng cách chuyển tế bào từ môi trường cũ sang môi trường có 50% môi trường cũ + 50% môi trường mới Khi tế bào ổn định mới chuyển sang môi trường mới 100% Đa số tế bào động vật nhạy cảm với ion kim loại, cần huyết thanh và hormone để tăng trưởng và phân chia.

Enzyme sử dụng để tách tế bào

Trypsin có cấu trúc chuỗi polypeptide gồm 249 amino acid, trọng lượng phân tử 22,6 – 23,4 kDa Cấu trúc bậc ba, hoạt động trong môi trường pH từ 6 – 9, rất bền vững ở môi trường acid yếu, được sử dụng để tách tế bào

Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của Lysin hoặc Arginin và gốc amin (-NH 2 ) của acid amin bất kỳ đứng liền kề với nó trong polypeptide, ngoại trừ liên kết giữa Lysin và Arginin Khi được xử lí với trypsin, các liên kết protein giữa các tế bào bị phá vỡ, tế bào co lại và thường có dạng hình cầu Khi tế bào co lại, các tế bào trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học

Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi có mặt Ca 2+ vì trypsin trở nên trơ Ngoài ra hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh, nên cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu được tế bào đơn.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào

- Cơ chất tế bào bám: Giá thể phù hợp thì tế bào tăng trưởng mạnh, tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trên nhiều giá thể khác nhau như: đĩa plastic, giá thể bán rắn (gel, collagen, agar)

- Sự cấu thành của các yếu tố lý hóa và sinh lý của môi trường

- Thành phần của pha khí

- Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

1.1.4.2.Yếu tố bề mặt của chai nuôi

Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển, dụng cụ phổ biến hiện nay là polystyrene plastic Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào:

- Khả năng sinh sản của tế bào

- Sự tăng sinh của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn

- Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín

- pH pH của môi trường có vai trò quan trọng đối với chức năng của tế bào pH thích hợp sẽ duy trì sự cân bằng của các ion, giúp cho các kênh vận chuyển proton trên màng của tế bào và bào quan hoạt động bình thường Do đó, pH thích hợp sẽ tạo điều kiện tối ưu cho sự hoạt động của các enzyme nội bào, hormone và yếu tố tăng trưởng Khi mức pH của môi trường bị biến đổi có thể dẫn đến các rối loạn chuyển hóa và gây chết cho tế bào

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 7 pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào thay đổi tùy vào loại tế bào hoặc dòng tế bào cần nuôi cấy Thông thường, pH tối ưu khi nuôi cấy tế bào động vật là 7,2 và có thể dao động từ 7,0 -7,4 Trong qua trình nuôi cấy, pH môi trường có thế thay đổi và vượt quá giới hạn tối ưu so với lúc ban đầu Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự thay đổi của môi trường Ví dụ như trong quá trình phát triển, đặc biệt là trong môi trường có mức oxy thấp, tế bào sẽ tiết ra các chất chuyển hóa có tính acid Các chất này tích lũy ngày càng nhiều trong môi trường và làm giảm pH môi trường Hoặc trong trường hợp môi trường bị nhiễm, vi khuẩn và nấm phát triển nhanh trong môi trường cũng sẽ làm cho pH giảm xuống nhanh chóng Khi pH thay đổi đột ngột, tế bào sẽ không thích ứng kịp và có thế chết Do đó, để duy trì ổn định của môi trường nuôi cấy, cần thiết phải sử dụng hệ đệm trong môi trường

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để tế bào phát triển phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ cơ thế mà tế bào được thu nhận Ví dụ, nhiệt độ tối ưu của hầu hết tế bào động vật có vú và người là 37 0 C, tế bào côn trùng phát triển tốt ở 27 0 C, các dòng tế bào của chim phát triển ở 38,5 0 C hay các dòng tế bào động vật máu lạnh phát triển ở khoản nhiệt độ từ 15 -26 0 C Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tế bào động vật có thể chịu được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu mà không bị ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển Tuy nhiên, tế bào lại rất nhạy cảm với nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu Trong quá trình nuôi cấy, thường cài đặt nhiệt độ thấp hơn một chút so với nhiệt độ tối ưu để tránh trường hợp nhiệt độ tăng lên và gây chết tế bào

- Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu là lực đẩy của các phân tử dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp đến dung dịch có nồng độ cao Trong quá trình nuôi cấy tế bào động vật, nếu áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trường quá cao, nước từ trong tế bào sẽ đi ra ngoài và làm tế bào co lại Ngược lại, nếu áp suất thẩm thấu bên ngoài quá thấp, nước từ môi trường bên ngoài đi vào trong tế bào làm cho tế bào căng phồng lên Cả hai trường hợp đều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của tế bào và có thể làm chết tế

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 8 bào.Vì vậy, cần nuôi cấy tế bào trong môi trường có áp suất thẩm thấu thích hợp để duy trì trạng thái cân bằng cho tế bào Áp suất thẩm thấu tối ưu cho hấu hết tế bào động vật nuôi cấy nằm trong khoảng

260 – 320 mOsm/kg Trong đó áp suất thẩm thấu tối ưu đối với tế bào động vật có vú và người là 290 mOsm/kg

CO 2 là loại khí được nghiên cứu sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy tế bào động vật Thường được duy trì ở mức 5% hoặc có thế dao động từ 4 – 10% Nồng đọ CO 2 5% tương đồng với nồng độ CO 2 trong cơ thể

CO 2 là loại khí được nghiên cứu sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy tế bào động vật Thường được duy trì ở mức 5% hoặc có thế dao động từ 4-10% Nồng độ CO 2 5% tương đồng với nồng độ CO 2 trong cơ thể Mặt khác, pH của các môi trường nuôi cấy sử dụng hệ đệm bicarbonate (HCO 3 -) phụ thuộc vào sự cân bằng giữa CO 2 hòa tan trong môi trường và bicarbonate Thay đổi nồng độ CO 2 sẽ ảnh hưởng đến pH của môi trường Vì vậy, nếu sử dụng hệ đệm bicarbonate thì phải sử dụng khí CO 2 để duy trì pH cho môi trường

Thông thường, yêu cầu về độ ẩm khi nuôi cấy tế bào là vào khoảng 95% Đôi khi tế bào được nuôi cấy trong các dụng cụ dễ bay hơi như dĩa nuôi cấy hoặc flask thì có thế yêu cầu độ ẩm lên tới 99 – 100% Độ ẩm cao sẽ ngăn chặn sự bay hơi của môi trường nuôi cấy, giúp duy trì ổn định nồng độ các chất trong môi trường.

Môi trường tủ nuôi

Tránh chồng các đĩa, chai trong tủ cấy để tránh làm đổ môi trường lên nắp trong miệng chai tăng nguy cơ gây nhiễm và nhiễm cả môi trường bên trong tủ cấy Tránh sự rung lắc, dao động tủ cấy làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Nhiệt độ tủ cấy nên ổn định không đổi trong khoảng 36,5 ± 0,5 0 C.

Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường phù hợp với dòng tế bào cần nuôi cấy là bước cực kì quan trọng Nó ảnh hưởng lớn rất lớn đến sự thành công của các thí nghiệm hay quy trình sản xuất Môi tường nuôi cấy cung cấp nguồn năng lượng, các hợp chất điều hòa chu trình tế bào cũng với các chất duy trì pH và áp suất thẩm thấu

Tế bào động vật được nuôi cấy trong môi trường có nguồn gốc hoàn toàn tự nhiên hoặc môi trường tổng hợp nhân tạo có bổ sung một vài sản phẩm tự nhiên

Môi trường tự nhiên chỉ bao gồm các dịch sinh học tự nhiên nên rất hữu ích và thuận tiện cho việc nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật khác nhau Tuy nhiên, hạn chế chính của của môi trường tự nhiên đó là do quy trình nuôi cấy khó kiểm soát và khó lặp lại do các thành phần của môi trường không xác định

Môi trường nhân tạo được tổng hợp từ các chất dinh dưỡng cả vô cơ và hữu cơ, gồm có các amino acid, vitamin, muối, protein, huyết thanh, carbohydrate và các cofactor Nhiều loại môi tường nhân tạo đã được tạo ra nhằm mục đích nuôi cấy khác nhau như duy trì và tăng sinh tế bào hoặc thực hiện các chức năng chuyên biệt Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật:

- Môi trường cơ bản (Basal Medium): Đây là môi trường cơ bản do H Eagle thiết lập, ở dạng bột hoặc dạng lỏng Môi trường cơ bản bao gồm các thành phần ổn định như: muối vô cơ, vitamin, amino acid, yếu tố vi lượng, hệ đệm, carbohyrate, acid béo và lipid Trước khi sử dụng, cần phải thêm các thành phần không ổn định hoặc dễ phân hủy vào môi trường cơ bản để tạo thành môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh Các thành phần không ổn định cần thêm vào đó là L-glutamine, các protein và peptide, kháng sinh và huyết thanh

- Môi trường MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium): Còn gọi là môi trường tối thiểu, do H Eagle thiết lập Đây là môi trường cơ bản có chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung L-glutamine, các protein và peptide, kháng sinh và huyết thanh

- Môi trường DMEM (Dulbecco’s – Modifiled Eggle Medium): Là môi trường MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 10 một số viatamin cao gấp 4 lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn

- Ham’s F-10 (1963): Có thể giúp sự hình thành quần thể tế bào từ một tế bào buồng trứng chuột hamster Trung Quốc dưới điều kiện nuôi cấy không huyết thanh, phát triển bởi bổ sung hai protein huyết thanh tinh khiết (albumin huyết và fetuin), thay vì huyết thanh, và bởi kiểm tra chi tiết nồng độ amino acid và các thành phần dạng vết (rất ít – trace elements) Đây là môi trường đầu tiên chứa các phần tử dạng vết, đồng và kẽm (sắt đã được bao gồm trong môi trường khác) Tế bào CHO có khả năng tăng sinh kém chỉ trong môi trường này, được so sánh với môi trường khác có chứa huyết thanh

- Ham’s F-12 (1965) Albumin huyết thanh và fuitein (được sử dụng trong Ham’s F-10) được thay thế bằng hai hợp chất khác với thành phần hóa học xác định: axit linoleic và putrescine, có thể giúp hình thành quần thể tế bào từ một tế bào CHO dưới điều kiện nuôi cấy không protein Môi trường này thường được trích dẫn như là môi trường xác định về mặt hóa học đầu tiên trên thế giới, mức độ một số amino acid là cao hơn trong Ham’s F-10, trong khi mức độ vitamin (trừ choline và inositol) và Kali phosphate là ít hơn Thành phần của nó phải được cải tiến (ví dụ, giảm nồng độ kẽm) cho nuôi cấy không protein với các tế bào không phải CHO MCDB301, trong đó 20 phân tử dạng vết được bổ sung, được phát triển sau và sau đó trở thành các phân tử vết chứa trong nước hoặc vật liệu thô cần thiết cho nuôi cấy không protein của CHO trong Ham’s F-12

- Môi trường DMEM/ F12: Pha trộn một hỗn hợp tỷ lệ 50:50 của môi trường Ham’s F-12 giàu thành phần và môi trường DMEM giàu dinh dưỡng và tương thích với các yêu cầu của nhiều tế bào khác nhau, nó được sử dụng thường xuyên nhất như môi trường cơ bản cho nuôi cấy không huyết thanh

- Môi trường RPMI – 1640: Dựa trên môi trường 5A (được phát triển bởi McCoy và cộng sự năm 1959) và được biến đổi cho nuôi cấy lâu dài tế bào lympho máu ngoại vi, nó có đặc tính có mức độ thấp của canxi và magie, và mức độ cao của

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 11 phosphate Nhiều môi trường được phát triển trên con đường dẫn tới môi trường này (ví dụ, RPMI 1629, 1630, và 1634) Nó được sử dụng rộng rãi như môi trường cho nuôi cấy huyền phù; ví dụ, tế bào máu, tế bào bạch cầu và tế bào lai (hybridoma).

Sinh trưởng của tế bào nuôi cấy

Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 4 pha:

- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được lấy tế bào

- Pha logarit (Log Phase) hay Pha tiến triển (Exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học tế bào Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng hợp với tốc độ tương đối ổn định Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều

Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới

- Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại Số lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân tố khác Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại Cũng có thể sự sinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại Sau

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 12 nữa là, một số chứng cứ cho thấy, khi số lượng tế bào đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị dừng lại

- Giai đoạn tử vong (Death Phase): Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm ảnh hưởng đến môi trường sống của tế bào, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của tế bào cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi) Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới.

Dòng tế bào

Dòng tế bào là một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu Các tế bào trong dòng tế bào có số lần phân chia giới hạn và sẽ lão hóa sau một số lần cấy chuyền nhất định

1.1.8.1 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 [8], [29]

MCF-7 là một dòng tế bào được phân lập lần đầu tiên vào năm 1970 từ mô vú của một phụ nữ da trắng 69 tuổi Trong số hai lần phẫu thuật, lần đầu tiên tiết lộ rằng các mô bị loại bỏ là lành tính Năm năm sau, một ca phẫu thuật thứ hai cho thấy ung thư biểu mô tuyến ác tính trong dịch tràn màng phổi từ đó mô được lấy sẽ dẫn đến dòng tế bào MCF-7 Bệnh nhân sau đó đã được điều trị ung thư vú bằng xạ trị và liệu pháp hormone

MCF-7, một dòng tế bào ung thư nghiên cứu rộng rãi có nguồn gốc từ ung thư biểu mô tuyến vú, có đặc điểm của biểu mô tuyến vú đã biệt hóa Các tế bào MCF7 có thể được sử dụng để phát hiện sự liên quan của PI3K và MAPK, cùng với việc phát hiện dễ dàng phsophorylation ERK và Akt Ngoài ra, thông qua các thụ thể estrogen tế bào chất, các tế bào này có khả năng xử lý estradiol

Các tế bào MCF-7 rất hữu ích cho các nghiên cứu ung thư vú in vitro do kết quả của dòng tế bào giữ lại một số đặc điểm lý tưởng riêng biệt cho biểu mô tuyến vú Chúng bao gồm khả năng cho các tế bào MCF-7 xử lý estrogen dưới dạng estradiol thông qua các thụ thể estrogen trong tế bào chất của tế bào Điều này dẫn đến dòng

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 13 tế bào MCF-7 là dòng tế bào dương tính với thụ thể estrogen (ER) MCF-7 cũng là thụ thể progesterone dương tính và HER2 âm tính

Ngoài việc duy trì độ nhạy estrogen, các tế bào MCF-7 cũng nhạy cảm với cytokeratin Chúng không được chấp nhận với desmin, endothelin, GAP và vimentin Khi được nuôi cấy trong ống nghiệm, dòng tế bào có khả năng hình thành các vòm và biểu mô giống như các tế bào phát triển trong các đơn lớp Tăng trưởng có thể bị ức chế bằng cách sử dụng yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF alpha) và điều trị các tế bào ung thư MCF-7 bằng thuốc chống estrogen có thể điều chỉnh các protein yếu tố tăng trưởng giống như insulin, cuối cùng có tác dụng làm giảm sự phát triển của tế bào Các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng mặc dù các tế bào MCF-7 rất dễ nhân giống, nhưng nhìn chung chúng là một quần thể phát triển chậm Thời gian nhân đôi MCF-7 thường là 30-40 giờ

Các tế bào MCF-7 là các tế bào bám dính khá lớn, với kích thước tế bào điển hình đo được là 20-25 micron Môi trường được khuyến nghị là EMEM chứa 2 mM L- glutamine, 0.01 mg / mL insulin bò (90%), huyết thanh nhau thai bò (10%) và BSS của Earle chứa 1.5 g / L sodium bicarbonate, 0.1 mM axit amin không thiết yếu và 1 mM natri pyruvate

Về mặt di truyền, dòng MCF-7 không hoàn toàn giống với dòng được phân lập ban đầu Ban đầu, nó được mô tả là có một kiểu nhân có chứa 85 nhiễm sắc thể đã bị giảm 16 nhiễm sắc thể Ngày nay, dòng tế bào MCF-7 có kiểu nhân có chứa 69 nhiễm sắc thể Hơn nữa, có sự khác biệt di truyền giữa dòng tế bào MCF-7 từ Tổ chức Ung thư Michigan và dòng tế bào ATCC

1.1.8.2 Dòng tế bào biếu mô tuyến vú MCF-10A

Dòng tế bào MCF-10A có nguồn gốc từ mô vú của một phụ nữ da trắng bị bệnh u xơ Dòng tế bào là không phải khối u, và được sử dụng như một mô hình để nghiên cứu sự phát triển biểu mô tuyến vú và chuyển đổi tân sinh [22]

Các tế bào MCF-10A là tế bào bất tử, là dòng tế bào biểu mô không bị biến đổi có nguồn gốc từ mô tuyến vú của con người Các tế bào này được định nghĩa là các

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 14 tế bào biểu mô vú "bình thường" vì chúng có kiểu nhân gần giống lưỡng bội và phụ thuộc vào các yếu tố tăng trưởng ngoại sinh để tăng sinh Chúng cũng thiếu khả năng hình thành khối u ở chuột và thiếu khả năng phát triển trong các thử nghiệm độc lập Các tế bào MCF-10A là một hệ thống mô hình tuyệt vời để hiểu sinh học tế bào biểu mô Khi được nuôi trong hỗn hợp collagen và laminin, chúng tạo thành các cấu trúc 3D giống với cấu trúc acini của vú người [5], [19].

Độc tính tế bào

Khái niệm

Độc tính tế bào chỉ ra khả năng của một số hóa chất hoặc tế bào trung gian phá hủy các tế bào sống Bằng cách sử dụng hợp chất gây độc tế bào, các tế bào sống khỏe mạnh có thể được cảm ứng để trải qua hoại tử (necrosis) hoặc tế bào chết theo lập trình (apoptosis) Khả năng đo độc tính tế bào có thể chứng minh là một công cụ rất có giá trị trong việc xác định các hợp chất có thể gây ra những rủi ro nhất định đối với sức khỏe ở người và khá cần thiết trong quá trình phát triển các loại thuốc điều trị ung thư Bằng cách xác định mức độ độc tế bào của tế bào ung thư, thuốc chống ung thư có thể cản trở sự tăng sinh của tế bào đích bằng cách làm rối loạn vật liệu di truyền của chúng hoặc bằng cách ngăn chặn các chất dinh dưỡng mà tế bào cần để tồn tại [6].

Ngoài ra, việc hiểu các cơ chế liên quan đến độc tế bào cũng có thể giúp các nhà nghiên cứu hiểu biết sâu hơn về các quá trình sinh học (cả bình thường và bất thường) chi phối sự phát triển của tế bào, tăng sinh tế bào và tử vong.

Các phương pháp xác định độc tính tế bào

Độc tính tế bào được xác định bằng nhiều cách khác nhau, đánh giá khả năng sống của tế bào thông qua việc sử dụng thuốc nhuộm formazan là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong việc xác định độc tính tế bào Thuốc nhuộm formazan là các sản phẩm tạo màu được hình thành do sự khử muối tetrazolium bởi dehydrogenase, chẳng hạn như lactate dehydrogenase (LDH) và

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 15 reductase được giải phóng khi chết tế bào Các muối tetrazolium phổ biến bao gồm INT, MTT, MTS và XTT [33].

Phương pháp MTT

Là một xét nghiệm đo màu để đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế bào, phương pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu tím bởi enzyme hô hấp ở ti thể của tế bào Số lượng tế bào tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang OD 570 của dung dịch [21].

IC50

Là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp, IC50 được xác định qua MTT assay.

CFU (Colony forming assay)

Sự tăng sinh tế bào là quá trình dẫn đến sự gia tăng số lượng tế bào và được xác định bởi sự cân bằng giữa sự phân chia tế bào và sự mất tế bào thông qua sự chết hoặc biệt hóa tế bào Tăng sinh tế bào được tăng lên trong các khối u Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit – CFU) là một tham số đánh giá số lượng các khuẩn lạc có thể nhìn thấy được hình thành từ các tế bào thể hiện dưới dạng CFU/ml Sau khi xử lí tế bào với thuốc, sẽ có một số tế bào được duy trì đủ để tăng sinh và hình thành khuẩn lạc [34]

Xét nghiệm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) là một trong những xét nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất cho các tế bào gốc và tế bào gốc tạo máu Các xét nghiệm CFU cho phép đo lường khả năng tăng sinh và biệt hóa của từng tế bào trong một mẫu Tiềm năng của các tế bào này được đo bằng cách quan sát các khuẩn lạc (bao gồm các tế bào khác biệt hơn) được tạo ra bởi mỗi tế bào tiền thân đầu vào Khoảng 14 ngày nuôi cấy là đủ để cho phép các khuẩn lạc phát triển đến một kích

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 16 thước cho phép đếm và nhận dạng chính xác, mặc dù thời gian ngắn hơn có thể được sử dụng trong một số tình huống [34].

Apoptosis

Khái niệm

Apoptosis là một quá trình của sự chết tế bào được lập trình (programmed cell death) xảy ra trong các sinh vật đa bào Các sự kiện hóa sinh dẫn đến những thay đổi đặc trưng về hình thái của tế bào và dẫn tới cái chết của tế bào đó [7]

Chết theo lập trình của tế bào xảy ra thông qua apoptosis (chết rụng) Sự chết của tế bào theo lập trình đặc trưng bởi chuỗi thay đổi về hình thái đã được biết rõ, gọi là apoptosis, tiếng Hy Lạp có nghĩa là “rụng xuống”, từ một cái cây Tế bào chết co lại, cô đặc, và sau đó phân mảnh, giải phóng các apoptosome có màng bao bọc và thường được các tế bào khác thu nạp Ở các tế bào đang chết, nhân tế bào cô đặc DNA phân mảnh Điều quan trọng là các thành phần nội bào không bị giải phóng vào môi trường ngoại bào, vì chúng có thể gây hại cho các tế bào lân cận

Các gen liên quan đến việc điều khiển sự chết của tế bào mã hóa cho những protein với ba chức năng chính sau:

- Các protein “sát thương” cần thiết để tế bào bắt đầu quá trình apoptosis

- Các protein “phá hủy” làm nhiệm vụ như phân hủy ở các tế bào đang chết

Các protein “nuốt chửng” cần thiết cho quá trình thực bào các tế bào đang chết bởi các tế bào khác

Ngược lại với quá trình apoptosis, tế bào chết đáp ứng lại tổn thương mô thể hiện sự thay đổi hình thái rất khác, được gọi là necrosis (hoại tử) Tế bào diễn ra necrosis thường căng lên và vỡ ra, giải phóng các thành phần nội bào, làm tổng thương các tế bào xung quanh và gây ra phản ứng viêm [13]

Cơ chế

Quá trình chết rụng tế bào được điều tiết bởi nhiều tín hiệu, những tín hiệu này có thể đến từ bên ngoài tế bào hoặc ngay ở bên trong tế bào Các tác động bên ngoài có thể bao hàm các chất độc, kích hãm tố, chất kích thích, monoxit nitơ, hay cytokine; chúng có thể đi xuyên qua lớp màng tế bào hay tác động theo cơ chế truyền tín hiệu để kích thích một phản ứng Các tín hiệu này có thể là tích cực (khơi mào, kích thích) hoặc tiêu cực (ngăn chặn, ức chế, ) đối với quá trình chết rụng

Trước khi quá trình chết thật sự của tế bào được kích thích bởi các enzyme, các tín hiệu chết rụng phải khiến cho các protein khơi mào chu trình chết rụng Kết quả của bước này sẽ quyết định việc tín hiệu chết rụng sẽ gây ra cái chết cho tế bào hay quá trình chết rụng sẽ bị đình lại Một số protein tham gia vào quá trình này, tuy nhiên hiện nay mới có hai quá trình điều tiết chính được nhận diện: tác động vào ti thể về mặt chức năng hay truyền tín hiệu chết rụng trực tiếp thông qua các protein tiếp hợp tới cơ chế chết rụng Một chu trình ngoại bào cho việc khơi mào được nhận diện trong một vài nghiên cứu về chất độc, đó là việc tăng nồng độ canxi trong tế bào bởi các tác động của thuốc, điều này sẽ gây ra sự chết rụng thông qua calpain, một enzyme dạng protase có hoạt tính phụ thuộc vào việc canxi bám vào nó [7].

Kĩ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow Cytometry)

Kỹ thuật Flow Cytometry hay còn gọi là phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân tích biểu hiện bề mặt tế bào và các phân tử nội bào, mô tả và xác định các loại tế bào khác nhau trong quần thể tế bào không đồng nhất, đánh giá độ tinh khiết của các phân nhóm con bị cô lập và phân tích kích cỡ và khối lượng tế bào Nó cho phép phân tích nhiều tham số đồng thời các tế bào đơn [16].

Flow cytometry được ứng dụng trong: Đếm tế bào, Phân loại tế bào, Phát hiện chỉ thị sinh học, Kỹ thuật protein

Flow cytometry là kỹ thuật cho phép phân lọai tế bào (tế bào riêng rẽ) khác nhau dựa trên các đặc điểm khác nhau của chúng, việc xác định dựa trên cơ sở cách chúng

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 18 di chuyển trong một dòng dung dịch Thiết bị sử dụng trong kỹ thuật này cho phép thu thập các thông tin về tế bào thông qua dạng tế bào, sự phát xạ huỳnh quang, cho phép sắp xếp tế bào dựa trên cơ sở đặc tính vật lý, hóa học và đặc tính của kháng nguyên

Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào dòng chảy là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và một điện trường Nguyên lí này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng tế bào

Hình 1.1 Phosphatidylserine (PS) liên kết với Annexin V ở ngoài màng tế bào

Xét nghiệm Muse Annexin V và Cell Dead dựa trên phát hiện phosphatidylserine (PS) trên bề mặt các tế bào apoptotic, sử dụng Annexin V có nhãn huỳnh quang trong kết hợp với cell dead marker, 7-AAD Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2 + có ái lực cao với PS, một thành phần của màng xuất hiện ở mặt trong của màng tế bào Ở giai đoạn apoptotic sớm, các phân tử của PS được chuyển ra bề mặt ngoài của màng tế bào nơi Annexin V có thể dễ dàng liên kết Các tế bào apoptotic giai đoạn muộn cho thấy mất tính toàn vẹn của màng Thuốc nhuộm màng 7-AAD được sử dụng để phân biệt các tế bào chết với các tế bào apoptotic ở gian đoạn sớm Do đó, xét nghiệm có thể phân biệt bốn quần thể:

• Các tế bào sống, không trải qua quá trình apoptosis có thể: Annexin V (-) và dead cell marker (-)

• Các tế bào apoptotic sớm: Annexin V (+) và dead cell marker (-)

• Tế bào apoptotic muộn: Annexin V (+) và dead cell marker (+)

• Các tế bào đã chết không thông qua con đường apoptotic: Annexin V (-) và dead cell marker (+)

Hình 1.2 Kết quả phân tích dòng chảy tế bào (Muse™ Annexin V & Dead Cell

Sơ lược về Nấm tre (Phallus indusiatus)

Nguồn gốc

Phallus indusiatus, thường được gọi là nấm tre, nấm nữ hoàng, stinkhorn lưới dài, là một loại nấm trong họ Phallaceae Nó thường phân bố ở các khu vực nhiệt đới, và được tìm thấy ở miền nam châu Á, châu Phi, châu Mỹ và Úc, mọc trong rừng, mọc trên đất gần các gốc cây lớn, có lớp lá mục dày, ẩm ướt [14]

Khi còn nhỏ: Phần chóp của nấm thường có màu nâu đậm hoặc đen Ở chóp nấm thường có một lớp chất nhầy bao phủ

Khi trưởng thành: Từ chóp nấm bung nở ra một lớp mạng giống như những mắt lưới được đan vào nhau Lớp mạng này thường có màu vàng hoặc trắng, bao phủ từ chóp xuống chân nấm Ở phần chóp nấm có chất nhầy phát ra mùi khó chịu, thường thu hút ruồi, muỗi đến đậu, vì vậy, khi nấm trưởng thành nếu không thu hái kịp lúc, nấm sẽ rất nhanh chóng bị thôi rữa

Thời gian sinh trưởng khá nhanh, thông thường, nấm chỉ mất khoảng hơn hai tháng để phát triển thành quả thể Thời gian từ khi nấm có quả thế đến khi trưởng thành chỉ tầm 4 – 5 ngày Nấm trưởng thành cao khoảng 8 -10cm

Hình 1.3 Nấm tre lúc nhỏ (trái) và lúc trưởng thành (phải)

Hoạt tính sinh học

Quả thể của nấm có chứa polysaccharide có hoạt tính sinh học Một β-D-glucan được gọi là T-5-N và được điều chế từ dung môi có tính kiềm đã được chứng minh là có đặc tính chống viêm [10] Polysaccharide có hoạt tính ức chế khối u S180 (sacroma 180) ở chuột [30]

Polysaccharide trong nấm tre cũng được chứng minh có hiệu quả trong chống nhiễm trùng, chống viêm, tăng cường miễn dịch và chống tăng đường huyết Loại nấm này từ lâu đã được công nhận là có đặc tính kháng khuẩn Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng chiết xuất của nấm tre có chất chống oxy hóa bên cạnh đặc tính kháng khuẩn Tính chất chống oxy hóa của chiết xuất nấm tre từ methanol đã được báo cáo Chiết xuất nấm đã được thử nghiệm chống lại nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh cho người, và trong một số trường hợp có hoạt tính kháng khuẩn tương đương với kháng sinh ampicillin, tetracycline và nystatin Hơn nữa, đặc tính kháng khuẩn của chiết xuất nấm tre từ ethyl acetate, ethanol, acetone và dầu chưng cất cũng được đề cập ở một vài nghiên cứu [18], [14]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

- Dòng tế bào ung thư vú ở người MCF-7 và dòng tế bào biểu mô vú ở người MCF-10A

- Bamboo mushrom fresh-mycelium (bbmf)

- Bamboo mushroom dried-mycelium (bmd)

- Bamboo dried-mushroom (bbd) Được tách chiết từ 3 loại dung môi khác nhau là nước cất (DW), Ethanol (Et) và Hexan (H) thành 12 dịch chiết nấm Dbbmf, Dbbmd, Dbbf, Dbbd, Etbbmf, Etbbmd, Etbbf, Etbbd, Hbbmf, Hbbmd, Hbbf, Hbbd

- Ống ly tâm 10ml, 50ml

- Kính hiển vi quang học

- Máy đếm dòng chảy tế bào

- DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)

- Anexin V and Cell Dead Kit

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật

Dòng tế bào ung thư vú ở người MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường MEM (Minimum Essential Medium) chứa 10% FBS (Fetal bovine serum) và 1% Penicillin/Streptomycin Dòng tế bào biểu mô vú ở người MCF-10A được nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) chứa 10% huyết thanh ngựa (Horse serum) và 1% Penicillin/Streptomycin Tất cả các dòng tế bào được duy trì ở 37 0 C, 5% CO 2

Các bước cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật:

Dòng tế bào (lạnh) cần được làm ấm nhanh nhất có thể sau đó cho vào môi trường hoàn chỉnh và flask thích hợp, tế bào cần vài ngày để có thể phục hồi hoàn chỉnh

- Chuẩn bị môi trường (T-75 flask) chứ 10ml môi trường thích hợp cân bằng về nhiệt độ và pH

- Lấy ống tế bào ra khỏi tủ đông -80 0 C và đặt vào bể ổn nhiệt đã làm ấm đến

37 0 C Rã đông nhanh đến khi các tinh thế đá trong ống tan hết (khoảng 2 phút)

- Khử trùng với 70% ethanol sau khi lấy ra khỏi nước

- Chuyển dịch tế bào vừa rã đông vào ống ly tâm chứa 9ml môi trường, ly tâm để loại bỏ môi trường chứa DMSO (10 phút, 125xg)

- Loại bỏ dịch nổi, hòa tế bào vào 2ml môi trường hoàn chỉnh, dùng pipet trộn nhẹ nhàng

- Chuyển tế bào vào T-75 flask và ủ trong tủ nuôi cấy

- Loại bỏ môi trường cũ khỏi bình nuôi cấy

- Dùng PBS rửa bề mặt tế bào

- Thêm trypsin vào bình nuôi cấy, lắc bình để enzyme phủ hết lớp tế bào và ủ trong tủ nuôi cấy trong 5 phút

- Thêm môi trường nuôi cấy đã được làm ấm vào bình nuôi cấy

- Dùng pipet hút môi trường và bơm lên bề mặt lớp tế bào nhiều lần đế tách tế bào khỏi khỏi bề mặt bình nuôi cấy

- Chia tế bào vào bình nuôi cấy có chứa môi trường nuôi cấy mới

+ Các bước đếm tế bào:

- Lau sạch bề mặt của buồng đếm bằng ethanol 70% sau đó lau khô bằng giấy thấm

- Lau sạch coverslip và đặt nó lên các rãnh ở vùng trung tâm

- Thu nhận tế bào bằng cách xử lí với trypsin Hòa tế bào trong một thế tích thích hợp với môi trường nuôi cấy đã làm ấm

- Trộn mẫu tế bào cho thật đều Dùng pipet hút 10ul chuyển vào một buồng đếm và tương tự với buồng đếm còn lại

- Đặt buồng đếm và kính hiển vi và quan sát ở độ phóng đại 100x Đếm số tế bào ở bốn 4 ô vuông ở bốn góc

Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu

Tế bào trong 1ml = ổ ố ế à đế đượ x độ pha loãng x 10 4 tế bào/ml

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào biểu mô MCF-10A được nuôi cấy trong đĩa

96 giếng với số lượng 7000 tế bào/giếng và để qua đêm ở 37 0 C, 5% CO 2 Sau khi để qua đêm, tế bào được được xử lí với dịch chiết nấm ở những nồng độ khác nhau (bắt đầu với 1mg/ml và giảm một nửa ở giếng tiếp theo) trong 72h Sau đó, mỗi giếng được thay thế với môi trường mới chứa MTT 0,5 mg/ml và ủ thêm 3h.Số lượng tinh thể formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm, sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy Phần trăm tỉ lệ sống của tế bào được tính theo công thức:

% Sống sót của tế bào = ủ ế à đượ ử í ủ ế à đố ứ ∗ 100%

Tế bào không được xử lí với dịch chiết được sử dụng như đối chứng Tất cả kết quả được biểu diễn bằng phần mềm GraphPad Prism 6

2.2.2.2.Colony forming unit assay (CFU)

Tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi cấy trong dĩa 6 giếng với số lượng tế bào

1000 tế bào/giếng và để qua đêm ở 37 0 C, 5% CO 2 Sau khi để qua đêm, tế bào được xử lí với dịch chiết nấm ở những nồng độ khác nhau là 10ug/ml, 100ug/ml và 500ug/ml trong 14 ngày (môi trường được thay mới sau mỗi ba ngày) Sau đó tế bào được nhuộm với 0,1% Crystal Violet và số khuẩn lạc tạo thành được xác định bằng phần mềm ImageJ

2.2.3 Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy

Phương pháp này được sử dụng xác định tỉ lệ apoptosis của tế bào ung thư vú MCF-7 sau khi xử lí với các dịch chiết nấm ở các nồng độ (dose-dependent) và thời gian khác nhau (time-dependent)

2.2.3.1 Dose-dependent (phụ thuộc nồng độ)

Tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với số lượng tế bào

40000 tế bào/giếng và để qua đêm ở 37 0 C, 5% CO 2 Sau khi để qua đêm, tế bào được xử lí với dịch chiết nấm ở những nồng độ khác nhau là 20ug/ml, 200ug/ml và 500ug/ml trong 24h Sau khi xử lí 24h giờ, tế bào được trypsinized và lượng tế bào thu được được ủ với annexin V and dead cell reagent trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng trước khi phân tích bằng Cell Analyzer MUSE để xác định tỷ lệ apoptosis của tế bào được xử lí với dịch chiết nấm ở những nồng độ khác nhau, tế bào không được xử lí được sử dụng như đối chứng

2.2.3.2 Time-dependent (phụ thuộc thời gian)

Tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi cấy trong đĩa 6 giếng với số lượng tế bào

40000 tế bào/giếng và để qua đêm ở 37 0 C, 5% CO 2 Sau khi để qua đêm, tế bào được xử lí với dịch chiết nấm ở 20ug/ml trong 24h, 48h và 72h Sau xử lí, tế bào được trypsinized và lượng tế bào thu được được ủ với Annexin V and Dead Cell reagent trong 20 phút ở nhiệt độ phòng trước khi phân tích bằng Cell Analyzer MUSE, tế bào không được xử lí được sử dụng như đối chứng

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Nuôi cấy tế bào động vật

Hình ảnh tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào biểu mô tuyến vú MCF-10A sau một thời gian nuôi cấy:

Hình 3.1 Tế bào ung thư vú MCF-7 với độ phóng đại 4x (trái) và 40x (phải)

Hình 3.2 Tế bào biểu mô vú tuyến vú MCF-10A (4x)

Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Sau khi xử lí tế bào ung thư vú MCF-7 với các mẫu dịch chiết nấm khác nhau chúng tôi tiến hành thử nghiệm MTT và thu được kết quả về tác dụng ức chế của cao chiết được thế hiện như các hình dưới đây:

Hình 3.3 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ nước cất

Hình 3.3 là kết quả tỉ lệ sống sót của tế bào ung thư vú MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ nước cất với các nồng độ khác nhau (bắt đầu từ 1mg/ml và giảm một nửa ở nồng độ kết tiếp), ta thấy tất cả các mẫu nấm Dbbmd, Dbbmf, Dbbf, Dbbd đều không thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư vì đều không có IC50 hay nói cách khác IC50> 1mg/ml

Hình 3.4 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ ethanol

Hình 3.4 là kết quả tỉ lệ sống sót của tế bào ung thư vú MCF-7 sau khi được xử lí với dịch chiết nấm từ ethanol Theo như trên hình ta thấy các mẫu đều thể hiện hoạt tính gây độc với tế bào MCF-7 với IC50 của các mẫu Etbbmd, Etbbmf, Etbbf, Etbbd lần lượt là 441ug/ml, 390ug/ml, 527ug/ml và 993ug/ml Mẫu Etbbmf có hoạt tính cao nhất với IC50 là 390ug/ml và mẫu có hoạt tính thấp nhất là Etbbd với IC50 là 992ug/ml

Hình 3.5 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ hexan

Hình 3.5 là kết quả tỉ lệ sống sót của tế bào ung thư vú MCF-7 sau khi được xử lí với dịch chiết nấm từ hexan Theo như trên hình ta thấy các mẫu đều thể hiện hoạt tính gây độc với tế bào MCF-7 với IC50 của các mẫu Hbbmd, Hbbmf, Hbbf, Hbbd lần lượt là 194ug/ml, 239ug/ml, 519ug/ml và 518ug/ml Mẫu Hbbmf có hoạt tính cao nhất với IC50 là 390ug/ml và mẫu có hoạt tính thấp nhất là Hbbf với IC50 là 519ug/ml Hơn nữa, tuy các mẫu nấm được tách chiết từ ethanol và hexan đều có khả năng ức chế tế bào ung thư vú nhưng các mẫu nấm được tách chiết từ hexan thể hiện hoạt tính mạnh hơn các mẫu nấm được tách chiết từ ethanol bởi IC50 của các mẫu nấm tách chiết từ hexan thấp hơn nhiều so với IC50 của các mẫu nấm tách chiết từ ethanol

Nhận xét: Kết quả thử nghiệm MTT cho thấy với mẫu nấm được tách chiết bằng nước cất không ức chế tế bào ung thư vì IC50>1mg/ml, còn đối với mẫu nấm được tách chiết với Ethanol (B) và Hexan (C) cho thấy khả năng gây độc tế bào ung thư

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 35 với nồng độ ức chế 50% tế bào lần lượt là Etbbmd (441ug/ml), Etbbmf (390ug/ml), Etbbf (527ug/ml), Etbbd (993ug/ml), Hbbmd (194ug), Hbbmf (239ug/ml), Hbbf (519ug/ml), Hbbd (518ug/ml) Một số mẫu như Etbbmd, Etbbmf, Hbbmd, Hbbmf cho thấy hoạt tính mạnh khi IC50 khá thấp

Sau khi thử hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết nấm trên mẫu ung thư vú, ta tiến hành thử nghiệm trên tế bào biểu mô vú bình thường để xác định các dịch chiết có gây độc đối với tế bào thường như đối với tế bào ung thư vú không Kết quả được thể hiện ở hình dưới

Hình 3.6 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ nước

Hình 3.7 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ ethanol

Hình 3.8 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ hexan

Nhận xét: Kết quả ghi nhận sau khi xử lí với dịch nấm ở các nồng độ khác nhau không làm ảnh hưởng lên tế bào vú bình thường, thậm chí một số dịch chiết còn cho thấy sự gia tăng tỉ lệ sống sót của tế bào khi tăng nồng độ Có hai mẫu nấm được tách chiết từ hexan là Hbbmd và Hbbf có khả năng gây độc cho tế bào thường khi có IC50 lần lượt là 554ug/ml và 554ug/ml nhưng so sánh với IC50 của mẫu nấm trên tế bào ung thư lần lượt là 194ug/ml và 519ug/ml vẫn cao hơn nên chúng ta vẫn có thể sử dụng nồng độ thấp hơn của hai mẫu này để tránh gây độc cho tế bào

3.2.2 Colony forming unit assay (CFU assay)

Tế bào ung thư vú MCF-7 sau 14 ngày xử lí với các dịch chiết nấm ở các nồng độ 10ug/ml, 100ug/ml, 500ug/ml để xác định khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư vú, khuẩn lạc tạo thành được nhuộn bằng Crystal Violet 0,1% và số lượng khuẩn lạc sau đó được đếm bằng phần mềm ImageJ (1 khuẩn lạc >50 tế bào)

Bảng 3.1 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí với các nồng độ khác nhau của dịch chiết nấm (đối chứng: 120 khuẩn lạc)

Hình 3.9 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ nước cất

Hình 3.10 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ Ethanol

Hình 3.11 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ Hexan Ở thí nghiệm CFU, kết quả được thể hiện trên bảng 3.1, ta thấy ở nồng độ 10ug/ml ở hầu hết các đĩa tế bào được xử lí với các mẫu dịch chiết đều xuất hiện khuẩn lạc, số khuẩn lạc ở các mẫu là Dbbmd (3), Dbbmf (60), Dbbf (12), Dbbd (33), Hbbmd (17), Hbbmf (14), Hbbf (36), Hbbd (5), Etbbmd (90), Etbbmf (4), Etbbf (10), Etbbd (2) chứng tỏ ở nồng độ này không thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, nhưng khi tăng nồng độ lên 100ug/l, sự xuất hiện của khuẩn lạc ít dần, chủ yếu xuất hiện ở các mẫu được xử lí với dịch tách chiết từ nước cất Dbbmd (86), Dbbmf (109), Dbbf (18), Dbbd (12) Đặc biệt, ở nồng độ 500ug/ml đối với các mẫu dịch chiết từ Ethanol và Hexan hoàn toàn ức chế sự hình thành của khuẩn lạc hay nói cách khác là ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú

Phân tích dòng chảy tế bào

3.3.1 Kết quả apoptosis phụ thuộc nồng độ

Chú thích: Ô phía trên bên trái: Tế bào chết Ô phía dưới bên trái: Tế bào sống Ô phía trên bên phải: Late apoptosis/Tế bào chết Ô phía dưới bên phải: Early apoptosis

Hình 3.12 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ nước cất với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml

Hình 3.12 thể hiện tỉ lệ apoptosis của tế bào MCF-7 sau khi xử lí tế bào với các nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml của dịch chiết nấm từ nước cất Kết quả cho thấy:

Mẫu Dbbmd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 2.26%, ở 200ug/ml là 7.32%, ở 500ug/ml là 3.06%

Mẫu Dbbmf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 2.54% , ở 200ug/ml là 8.48%, ở 500ug/ml là 3.3.%

Mẫu Dbbf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 5.36%, ở 200ug/ml là 18.89%, ở 500ug/ml là 3.78%

Mẫu Dbbd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 2.78%, ở 200ug/ml là 23.79%, ở 500ug/ml là 4.94%

Dựa vào kết quả trên thì các mẫu dịch chiết nấm từ nước cất không có khả năng cảm ứng gây apoptosis ở tế bào ung thư vú, tỉ lệ apoptosis đều rất thấp và không tăng theo chiều tăng nồng độ

Hình 3.13 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ hexan với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml,

Hinh 3.13 thể hiện tỉ lệ apoptosis của tế bào MCF-7 sau khi xử lí tế bào với các nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml của dịch chiết nấm từ Hexan Kết quả cho thấy:

Mẫu Hbbmd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 13.18%, ở 200ug/ml là 30.98%, ở 500ug/ml là 16.82%

Mẫu Hbbmf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 2.26%, ở 200ug/ml là 37.44%, ở 500ug/ml là 34.02%

Mẫu Hbbf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 8.37%, ở 200ug/ml là 25.05%, ở 500ug/ml là 58.84%

Mẫu Hbbd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 12.44%, ở 200ug/ml là 27.82%, ở 500ug/ml là 47.88

Hình 3.14 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ ethanol với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml

Hình 3.14 thể hiện tỉ lệ apoptosis của tế bào MCF-7 sau khi xử lí tế bào với các nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml của dịch chiết nấm từ ethanol Kết quả cho thấy:

Mẫu Etbbmd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 14.02%, ở 200ug/ml là 35.32%, ở 500ug/ml là 48.66%

Mẫu Etbbmf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 7.44%, ở 200ug/ml là 45.3%, ở 500ug/ml là 39.14%

Mẫu Etbbf: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 3.14%, ở 200ug/ml là 12.88%, ở 500ug/ml là 13.26%

Mẫu Etbbd: Tổng apoptosis ở 20ug/ml là 2.16%, ở 200ug/ml là 27.38%, ở 500ug/ml là 18.38%

Nhận xét: Kết quả Apoposis của tế bào MCF-7 được xử lí với các nồng độ khác nhau của dịch chiết nấm từ hexan và ethanol cho thấy cho thấy ở 20ug/ml, không có sự apoptosis ở tế bào, tổng tỉ lệ apoptosis của tế bào đều dưới 15% Khi tăng nồng độ lên 200ug/ml, tỉ lệ tổng apoptosis tăng trên 30% ở các mẫu Hbbmd (30.98%), Hbbmf (37.44%), Etbbmd (35.32%), Etbbmf (45,3%) và khi tăng nồng độ lên 500ug/ml, tỉ lệ tổng apoptosis tăng trên 40% ở các mẫu Hbbf (58.84%), Hbbd (47.88%), Etbbmd (48,66%) Kết quả trên cho thấy có sự ảnh hưởng của nồng độ các dịch chiết nấm lên khả năng cảm ứng gây apoptosis của dịch chiết ở tế bào ung thư, nồng độ càng cao thì tỉ lệ tế bào apoptosis càng cao

3.3.2 Kết quả apoptosis phụ thuộc thời gian

Tế bào MCF-7 được xử lí với nồng độ 20ug/ml các dịch chiết nấm và ủ lần lượt 24h, 48h, 72h Tổng tỉ lệ apoptosis được thể hiện ở các biểu đồ phía dưới (Hình 3.12)

Hình 3.15 So sánh tỉ lệ apoptosis ở tế bào MCF-7 sau khỉ xử lí với dịch chiết nấm ở 20ug/ml trong 24, 48h và 72h (time-dependent)

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 46 Ở nồng độ 20ug/ml ủ trong 24h , như ở thí nghiệm trước thì tất cả các mẫu nấm đều không có khả năng cảm ứng gây apoptosis ở tế bào ung thư, tổng tỉ lệ apoptosis đều

1mg/ml, còn đối với mẫu nấm được tách chiết với Ethanol và Hexan cho thấy khả năng gây độc tế bào ung thư với nồng độ ức chế 50% tế bào lần lượt là Etbbmd (441ug/ml), Etbbmf (390ug/ml), Etbbf (527ug/ml), Etbbd (993ug/ml), Hbbmd (194ug), Hbbmf (239ug/ml), Hbbf (519ug/ml), Hbbd (518ug/ml) Một số mẫu như Etbbmd, Etbbmf, Hbbmd, Hbbmf cho thấy hoạt tính mạnh khi IC50 khá thấp

Các chất chống ung thư có tác dụng ngăn ngừa ung thư chủ yếu bằng cách điều hoà chu kỳ tế bào và hoạt hoá con đường chết tế bào kiểu apoptosis Vì vậy gây apoptosis cho các tế bào ung thư được xem như một tiêu chí đánh giá đáp ứng điều trị ung thư, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư Kết quả Apoposis của tế bào MCF-7 được xử lí với các nồng độ khác nhau của dịch chiết nấm được cho thấy ở 20ug/ml, không có sự apoptosis ở tế bào, tổng tỉ lệ apoptosis của tế bào đều dưới 15% Khi tăng nồng độ lên 200ug/ml, tỉ lệ tổng apoptosis tăng trên 30% ở các mẫu Hbbmd (30.98%), Hbbmf (37.44%), Etbbmd (35.32%), Etbbmf (45,3%) và khi tăng nồng độ lên 500ug/ml, tỉ lệ tổng apoptosis tăng trên 40% ở các mẫu Hbbf (58.84%), Hbbd (47.88%), Etbbmd (48,66%) Tuy nhiên, nếu xử lí dịch chiết nấm với nồng độ 20ug và tăng thời gian ủ lên 48h và 72h thì có mẫu dịch chiết từ Ethanol là Etbbmf cho thấy khả năng cảm ứng gây apoptosis với tỉ lệ trên 30% sau 48h ủ và 83% sau 72h ủ

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 48 Ở thí nghiệm CFU, ta thấy ở nồng độ 10ug/ml ở hầu hết các đĩa tế bào được xử lí với các mẫu dịch chiết đều xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ ở nồng độ này không thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú, nhưng khi tăng nồng độ, sự xuất hiện của khuẩn lạc ít dần Đặc biệt, ở nồng độ 500ug/ml đối với các mẫu dịch chiết từ Ethanol và Hexan hoàn toàn ức chế sự hình thành của khuẩn lạc hay nói cách khác là ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú

Tóm lại, trong 12 mẫu nấm được tách chiết từ ba loại dung môi khác nhau là nước cất, ethanol và hexan (mỗi dung môi bốn mẫu nấm), chúng tôi nhận thấy các mẫu nấm được tách chiết từ nước cất là không có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú trong khi 8 mẫu nấm còn lại được chiết xuất từ ethanol và hexan (Etbbmd, Etbbmf, Etbbf, Etbbd, Hbbmd, Hbbmf, Hbbf, Hbbd) thể hiện khả năng gây độc tế bào ung thư vú đồng thời có khả năng gây cảm ứng chết theo lập trình ở tế bào ung thư vú, một số mẫu có hoạt tính mạnh hơn hẳn các mẫu còn lại như Etbbmd, Etbbmf, Hbbmf, Hbbmd

Định dạng
Số trang	63
Dung lượng	1,98 MB