khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết nấm tre phallus indusiatus lên tế bào ung thư vú

Ngoài giá trị về dinh dưỡng, một số loại nấm cũng là nguồn cung cấp các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe ví dụ như chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, giảm cholesterol, kích

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA

DỊCH CHIẾT NẤM TRE (PHALLUS INDUSIATUS) LÊN

TẾ BÀO UNG THƯ VÚ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

Xác nhận của CBHD CBHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Hà Hoàng Trà My

MSSV: 1553010111 Khóa: 2015

Bình Dương ngày 14 tháng 5 năm 2019 Lê Huyền Ái Thúy

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng thí nghiệm Sinh hóa thuộc trường Đại học Kasetsart, Thái Lan và thầy hướng dẫn Kiattawee Choowongkomon và các anh chị trong lab đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Cảm ơn Khoa Công nghệ sinh học, Đại học Mở Tp.HCM cùng các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện cho em tham gia chương trình trao đổi ngắn hạn này

Cảm ơn cô Lê Huyền Ái Thúy đã hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng là cảm ơn gia đình và bạn bè đã ủng hộ giúp đỡ em trong thời gian qua

Do thời gian và kiến thức có hạn nên khóa luận không tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót nhất định Em xin cảm ơn và tiếp thu những ý kiến đóng góp của các thầy giáo, cô giáo và các bạn

Em xin cảm ơn

Sinh viên

Hà Hoàng Trà My

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 6

1.1.5 Môi trường tủ nuôi 8

1.1.6 Môi trường nuôi cấy 8

1.1.7 Sinh trưởng của tế bào nuôi cấy 11

1.3.3 Kĩ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow Cytometry) 17

1.4 Sơ lược về Nấm tre (Phallus indusiatus) 19

1.4.1 Nguồn gốc 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 25

2.2.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 27

2.2.3 Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy 28

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Nuôi cấy tế bào động vật 31

3.2 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 32

3.2.1 MTT assay 32

3.2.2 Colony forming unit assay (CFU assay) 37

3.3 Phân tích dòng chảy tế bào 40

3.3.1 Kết quả apoptosis phụ thuộc nồng độ 40

3.3.2 Kết quả apoptosis phụ thuộc thời gian 44

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

4.1 Kết luận 50

4.2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Hình 1.1 Phosphatidylserine (PS) liên kết với Annexin V ở ngoài màng tế bào

Hình 1.2 Kết quả phân tích dòng chảy tế bào

Hình 1.3 Nấm tre lúc nhỏ (trái) và lúc trưởng thành (phải)

Hình 2.1 Buồng đếm hồng cầu

Hình 3.1 Tế bào ung thư vú MCF-7 với độ phóng đại 4x (trái) và 40x (phải)

Hình 3.2 Tế bào biểu mô vú MCF-10A (4x)

Hình 3.3 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ nước cất

Hình 3.4 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ ethanol

Hình 3.5 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-7 sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ hexan

Hình 3.6 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ nước

Hình 3.7 Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ ethanol

Hình 3.8.Tỉ lệ sống sót (%) của tế bào MCF-10A sau khi xử lí với dịch chiết nấm từ hexan

Hình 3.9 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ nước cất

Hình 3.10 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ Ethanol

Hình 3.11 Số lượng khuẩn lạc tế bào MCF-7 hình thành sau khi xử lí tế bào với các nồng độ khác nhau của các dịch chiết nấm chiết từ Hexan

Hình 3.12 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ nước cất với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml

Hình 3.13 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ nước cất với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml

Hình 3.14 Phân tích cytometry dòng chảy của apoptosis tế bào MCF-7 gây ra bởi dịch chiết nấm từ nước cất với ba nồng độ 20ug/ml, 200ug/ml, 500ug/ml

Hình 3.15 Tỉ lệ apoptosis ở tế bào MCF-7 sau khỉ xử lí với dịch chiết nấm ở 20ug/ml trong 24, 48h và 72h (time-dependent)

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú là ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở các nước đang phát triển Ước tính có 1,7 triệu trường hợp mới (25% tổng số ung thư ở phụ nữ) và 0,5 triệu tử vong do ung thư vú (15% tử vong do ung thư ở phụ nữ) vào năm 2012 [23] Theo WHO, ung thư vú có tỷ lệ chữa khỏi cao nếu được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp

Ngoài phác đồ điều trị thông thường và các liệu pháp miễn dịch, sử dụng thực phẩm hoặc các chất bổ sung có nguồn gốc từ tự nhiên trong điều trị ung thư đang là một hướng mới hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong chẩn đoán và điều trị ung thư mà không ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh Một loạt các chất bổ sung bao gồm chiết xuất từ thực vật, trái cây và rau quả, vitamin, khoáng chất và các thành phần dinh dưỡng đang được đánh giá là nguồn cung cấp đầy hứa hẹn của các tác nhân chống ung thư Trong đó, nấm đang là nguồn thực phẩm tiềm năng với hàm lượng cao các chất xơ, chất khoáng, vitamin và protein Ngoài giá trị về dinh dưỡng, một số loại nấm cũng là nguồn cung cấp các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe ví dụ như chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, giảm cholesterol, kích thích miễn dịch,…Quả thế và thể sợi là hai bộ phận chứa nhiều hợp chất chống oxi hóa và kháng khuẩn ở nấm [9], [11], [15].

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về các loại nấm có tác dụng trong điều trị y học

ví dụ như nấm hương (Lentinus edodes) đã được chứng minh là có chứa các hợp chất chống ung thư và kháng khuẩn, các nấm trong bộ Agaricales, nấm Ganoderma

lucidum được chứng minh là có khả năng ngăn cản sự tăng sinh tế bào và sự phát

triển khổi u ở tế bào ung thư vú [17], [26] Tuy nhiên đối với hoạt tính gây độc tế

bào ung thư của nấm tre (Phallus indusiatus) vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi Do

vậy chúng tôi thực hiện đề tài khóa luận: “Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của dịch

chiết nấm tre (Phallus indusiatus) lên tế bào ung thư vú” với mục tiêu:

- Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú của các dịch chiết nấm để tìm ra các dịch chiết có khả năng ức chế tế bào ung thư vú nhưng không ảnh hưởng đến tế bào thường

- Xác định các mẫu dịch chiết nấm có khả năng cảm ứng gây apoptosis (chết theo lập trình) ở tế bào ung thư vú

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về nuôi cấy tế bào động vật [2], [3], [13]

1.1.1 Khái niệm

Nuôi cấy tế bào động vật là quá trình duy trì và tăng sinh các tế bào, mô hoặc cơ

quan động vật ở bên ngoài cơ thể (in vitro) trong môi trường nhân tạo Môi trường

nhân tạo bao gồm các yếu tố như nhiệt độ, pH và các thành phần dinh dưỡng được

thiết kế sao cho tương đồng nhất với các điều kiện trong cơ thể sinh vật (in vitro) để

tế bào có thể tồn tại và tăng sinh

Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở hai dạng chính:

- Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào), có hình cầu và nằm lơ lửng trong môi trường nuôi cấy Ví dụ như dòng tế bào thu từ máu: leukamia, lymphoma

- Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi, sau một thời gian nuôi cấy, đáy của dụng cụ nuôi cấy sẽ được phủ hết bởi lớp tế bào đơn liên tục Hầu hết các tế bào động vật đều là tế bào bám dính ví dụ như tế bào nguyên bào sợi và tế bào biểu mô

1.1.2 Đặc điểm của tế bào động vật

- Tính cơ học yếu: Tế bào động vật không có lớp vách tế bào như vi sinh vật hay tế bào thực vật nên dễ bị biến dạng và vỡ Trong quá trình nuôi cấy cần thao tác nhẹ nhàng, tránh những tác động cơ học mạnh

- Tăng trưởng chậm: Quá trình trao đổi chất ở tế bào động vật chậm hơn nhiều so với vi sinh vật, dẫn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào động vật cũng chậm hơn Vì vậy, thời gian nuôi cấy tế bào động vật thường kéo dài, gây kéo dài và tăng nguy cơ nhiễm

- Cơ chế kìm hãm ngược: Sau một thời gian nuôi cấy, nồng độ cao của chất cần biểu hiện được tích lũy trong môi trường sẽ ức chế tế bào tổng hợp tiếp chất đó

- Có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình: Nếu tế bào động vật được nuôi cấy trong thời gian dài có thể xảy ra các quá trình như dung hợp và biến nạp Dẫn đến các tế bào bị biến đổi kiểu gen và kiểu hình

- Có thế bảo quản và lưu trữ trong nitơ lỏng: Tế bào động vật có thể được bảo quản và lưu trữ trong nhiều năm ở nitơ lỏng (-1960C) Khi được rã đông, tế bào vẫn có khả năng tăng sinh và phân chia như lúc đầu

- Kém thích nghi với môi trường: Khi được chuyển sang nuôi cấy trong một môi trường hoàn toàn mới, tế bào động vật thường thích nghi chậm và có thể chết Cần có quá trình để tế bào thích nghi với môi trường mới Quá trình thích nghi có thể thực hiện bằng cách chuyển tế bào từ môi trường cũ sang môi trường có 50% môi trường cũ + 50% môi trường mới Khi tế bào ổn định mới chuyển sang môi trường mới 100% Đa số tế bào động vật nhạy cảm với ion kim loại, cần huyết thanh và hormone để tăng trưởng và phân chia

1.1.3 Enzyme sử dụng để tách tế bào

Trypsin có cấu trúc chuỗi polypeptide gồm 249 amino acid, trọng lượng phân tử 22,6 – 23,4 kDa Cấu trúc bậc ba, hoạt động trong môi trường pH từ 6 – 9, rất bền vững ở môi trường acid yếu, được sử dụng để tách tế bào

Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của Lysin hoặc Arginin và gốc amin (-NH2) của acid amin bất kỳ đứng liền kề với nó trong polypeptide, ngoại trừ liên kết giữa Lysin và Arginin Khi được xử lí với trypsin, các liên kết protein giữa các tế bào bị phá vỡ, tế bào co lại và thường có dạng hình cầu Khi tế bào co lại, các tế bào trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học

Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi có mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ Ngoài ra hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh, nên cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu được tế bào đơn

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào [2], [3], [20] 1.1.4.1 Ảnh hưởng của môi trường bên ngoài lên quá trình nuôi cấy tế bào thể hiện qua:

- Cơ chất tế bào bám: Giá thể phù hợp thì tế bào tăng trưởng mạnh, tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trên nhiều giá thể khác nhau như: đĩa plastic, giá thể bán rắn (gel, collagen, agar)

- Sự cấu thành của các yếu tố lý hóa và sinh lý của môi trường - Thành phần của pha khí

- Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ

1.1.4.2.Yếu tố bề mặt của chai nuôi

Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển, dụng cụ phổ biến hiện nay là polystyrene plastic Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào:

- Khả năng sinh sản của tế bào

- Sự tăng sinh của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn - Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín

pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào thay đổi tùy vào loại tế bào hoặc dòng tế bào cần nuôi cấy Thông thường, pH tối ưu khi nuôi cấy tế bào động vật là 7,2 và có thể dao động từ 7,0 -7,4 Trong qua trình nuôi cấy, pH môi trường có thế thay đổi và vượt quá giới hạn tối ưu so với lúc ban đầu Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự thay đổi của môi trường Ví dụ như trong quá trình phát triển, đặc biệt là trong môi trường có mức oxy thấp, tế bào sẽ tiết ra các chất chuyển hóa có tính acid Các chất này tích lũy ngày càng nhiều trong môi trường và làm giảm pH môi trường Hoặc trong trường hợp môi trường bị nhiễm, vi khuẩn và nấm phát triển nhanh trong môi trường cũng sẽ làm cho pH giảm xuống nhanh chóng Khi pH thay đổi đột ngột, tế bào sẽ không thích ứng kịp và có thế chết Do đó, để duy trì ổn định của môi trường nuôi cấy, cần thiết phải sử dụng hệ đệm trong môi trường

- Nhiệt độ

Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để tế bào phát triển phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ cơ thế mà tế bào được thu nhận Ví dụ, nhiệt độ tối ưu của hầu hết tế bào động vật có vú và người là 370C, tế bào côn trùng phát triển tốt ở 270C, các dòng tế bào của chim phát triển ở 38,50C hay các dòng tế bào động vật máu lạnh phát triển ở khoản nhiệt độ từ 15 -260C Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, tế bào động vật có thể chịu được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu mà không bị ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển Tuy nhiên, tế bào lại rất nhạy cảm với nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu Trong quá trình nuôi cấy, thường cài đặt nhiệt độ thấp hơn một chút so với nhiệt độ tối ưu để tránh trường hợp nhiệt độ tăng lên và gây chết tế bào

- Áp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu là lực đẩy của các phân tử dung môi từ dung dịch có nồng độ thấp đến dung dịch có nồng độ cao Trong quá trình nuôi cấy tế bào động vật, nếu áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trường quá cao, nước từ trong tế bào sẽ đi ra ngoài và làm tế bào co lại Ngược lại, nếu áp suất thẩm thấu bên ngoài quá thấp, nước từ môi trường bên ngoài đi vào trong tế bào làm cho tế bào căng phồng lên Cả hai trường hợp đều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của tế bào và có thể làm chết tế

- Khí

CO2 là loại khí được nghiên cứu sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy tế bào động vật Thường được duy trì ở mức 5% hoặc có thế dao động từ 4 – 10% Nồng đọ CO2 5% tương đồng với nồng độ CO2 trong cơ thể

CO2 là loại khí được nghiên cứu sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy tế bào động vật Thường được duy trì ở mức 5% hoặc có thế dao động từ 4-10% Nồng độ CO2 5% tương đồng với nồng độ CO2 trong cơ thể Mặt khác, pH của các môi trường nuôi cấy sử dụng hệ đệm bicarbonate (HCO3-) phụ thuộc vào sự cân bằng giữa CO2 hòa tan trong môi trường và bicarbonate Thay đổi nồng độ CO2 sẽ ảnh hưởng đến pH của môi trường Vì vậy, nếu sử dụng hệ đệm bicarbonate thì phải sử dụng khí CO2để duy trì pH cho môi trường

- Độ ẩm

Thông thường, yêu cầu về độ ẩm khi nuôi cấy tế bào là vào khoảng 95% Đôi khi tế bào được nuôi cấy trong các dụng cụ dễ bay hơi như dĩa nuôi cấy hoặc flask thì có thế yêu cầu độ ẩm lên tới 99 – 100% Độ ẩm cao sẽ ngăn chặn sự bay hơi của môi trường nuôi cấy, giúp duy trì ổn định nồng độ các chất trong môi trường

1.1.5 Môi trường tủ nuôi

Tránh chồng các đĩa, chai trong tủ cấy để tránh làm đổ môi trường lên nắp trong miệng chai tăng nguy cơ gây nhiễm và nhiễm cả môi trường bên trong tủ cấy Tránh sự rung lắc, dao động tủ cấy làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm Nhiệt độ tủ cấy nên ổn định không đổi trong khoảng 36,5 ± 0,50C

1.1.6 Môi trường nuôi cấy

Lựa chọn môi trường phù hợp với dòng tế bào cần nuôi cấy là bước cực kì quan trọng Nó ảnh hưởng lớn rất lớn đến sự thành công của các thí nghiệm hay quy trình sản xuất Môi tường nuôi cấy cung cấp nguồn năng lượng, các hợp chất điều hòa chu trình tế bào cũng với các chất duy trì pH và áp suất thẩm thấu

Tế bào động vật được nuôi cấy trong môi trường có nguồn gốc hoàn toàn tự nhiên hoặc môi trường tổng hợp nhân tạo có bổ sung một vài sản phẩm tự nhiên

Môi trường tự nhiên chỉ bao gồm các dịch sinh học tự nhiên nên rất hữu ích và thuận tiện cho việc nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật khác nhau Tuy nhiên, hạn chế chính của của môi trường tự nhiên đó là do quy trình nuôi cấy khó kiểm soát và khó lặp lại do các thành phần của môi trường không xác định

Môi trường nhân tạo được tổng hợp từ các chất dinh dưỡng cả vô cơ và hữu cơ, gồm có các amino acid, vitamin, muối, protein, huyết thanh, carbohydrate và các cofactor Nhiều loại môi tường nhân tạo đã được tạo ra nhằm mục đích nuôi cấy khác nhau như duy trì và tăng sinh tế bào hoặc thực hiện các chức năng chuyên biệt

Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật: - Môi trường cơ bản (Basal Medium): Đây là môi trường cơ bản do H Eagle thiết lập, ở dạng bột hoặc dạng lỏng Môi trường cơ bản bao gồm các thành phần ổn định như: muối vô cơ, vitamin, amino acid, yếu tố vi lượng, hệ đệm, carbohyrate, acid béo và lipid Trước khi sử dụng, cần phải thêm các thành phần không ổn định hoặc dễ phân hủy vào môi trường cơ bản để tạo thành môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh Các thành phần không ổn định cần thêm vào đó là L-glutamine, các protein và peptide, kháng sinh và huyết thanh

- Môi trường MEM (Eagle’s Minimum Essential Medium): Còn gọi là môi trường tối thiểu, do H Eagle thiết lập Đây là môi trường cơ bản có chứa nồng độ cao hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung L-glutamine, các protein và peptide, kháng sinh và huyết thanh

- Môi trường DMEM (Dulbecco’s – Modifiled Eggle Medium): Là môi trường MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và

- Ham’s F-12 (1965) Albumin huyết thanh và fuitein (được sử dụng trong Ham’s F-10) được thay thế bằng hai hợp chất khác với thành phần hóa học xác định: axit linoleic và putrescine, có thể giúp hình thành quần thể tế bào từ một tế bào CHO dưới điều kiện nuôi cấy không protein Môi trường này thường được trích dẫn như là môi trường xác định về mặt hóa học đầu tiên trên thế giới, mức độ một số amino acid là cao hơn trong Ham’s F-10, trong khi mức độ vitamin (trừ choline và inositol) và Kali phosphate là ít hơn Thành phần của nó phải được cải tiến (ví dụ, giảm nồng độ kẽm) cho nuôi cấy không protein với các tế bào không phải CHO MCDB301, trong đó 20 phân tử dạng vết được bổ sung, được phát triển sau và sau đó trở thành các phân tử vết chứa trong nước hoặc vật liệu thô cần thiết cho nuôi cấy không protein của CHO trong Ham’s F-12

- Môi trường DMEM/ F12: Pha trộn một hỗn hợp tỷ lệ 50:50 của môi trường Ham’s F-12 giàu thành phần và môi trường DMEM giàu dinh dưỡng và tương thích với các yêu cầu của nhiều tế bào khác nhau, nó được sử dụng thường xuyên nhất như môi trường cơ bản cho nuôi cấy không huyết thanh

- Môi trường RPMI – 1640: Dựa trên môi trường 5A (được phát triển bởi McCoy và cộng sự năm 1959) và được biến đổi cho nuôi cấy lâu dài tế bào lympho máu ngoại vi, nó có đặc tính có mức độ thấp của canxi và magie, và mức độ cao của

phosphate Nhiều môi trường được phát triển trên con đường dẫn tới môi trường này (ví dụ, RPMI 1629, 1630, và 1634) Nó được sử dụng rộng rãi như môi trường cho nuôi cấy huyền phù; ví dụ, tế bào máu, tế bào bạch cầu và tế bào lai (hybridoma)

1.1.7 Sinh trưởng của tế bào nuôi cấy [2]

Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 4 pha:

- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được lấy tế bào

- Pha logarit (Log Phase) hay Pha tiến triển (Exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh số lượng tế bào Trong giai đoạn này, tế bào sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau, cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học tế bào Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng hợp với tốc độ tương đối ổn định Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới

- Pha dừng (Stationary phase): Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng sẽ dừng lại Số lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh dưỡng, chủng loại và các nhân tố khác Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất Nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại Cũng có thể sự sinh trưởng dừng lại khi môi trường có nhiều các sản phẩm trao đổi chất có hại Sau

1.1.8 Dòng tế bào

Dòng tế bào là một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu Các tế bào trong dòng tế bào có số lần phân chia giới hạn và sẽ lão hóa sau một số lần cấy chuyền nhất định

1.1.8.1 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 [8], [29]

MCF-7 là một dòng tế bào được phân lập lần đầu tiên vào năm 1970 từ mô vú của một phụ nữ da trắng 69 tuổi Trong số hai lần phẫu thuật, lần đầu tiên tiết lộ rằng các mô bị loại bỏ là lành tính Năm năm sau, một ca phẫu thuật thứ hai cho thấy ung thư biểu mô tuyến ác tính trong dịch tràn màng phổi từ đó mô được lấy sẽ dẫn đến dòng tế bào MCF-7 Bệnh nhân sau đó đã được điều trị ung thư vú bằng xạ trị và liệu pháp hormone

MCF-7, một dòng tế bào ung thư nghiên cứu rộng rãi có nguồn gốc từ ung thư biểu mô tuyến vú, có đặc điểm của biểu mô tuyến vú đã biệt hóa Các tế bào MCF7 có thể được sử dụng để phát hiện sự liên quan của PI3K và MAPK, cùng với việc phát hiện dễ dàng phsophorylation ERK và Akt Ngoài ra, thông qua các thụ thể estrogen tế bào chất, các tế bào này có khả năng xử lý estradiol

Các tế bào MCF-7 rất hữu ích cho các nghiên cứu ung thư vú in vitro do kết quả

của dòng tế bào giữ lại một số đặc điểm lý tưởng riêng biệt cho biểu mô tuyến vú Chúng bao gồm khả năng cho các tế bào MCF-7 xử lý estrogen dưới dạng estradiol thông qua các thụ thể estrogen trong tế bào chất của tế bào Điều này dẫn đến dòng

Các tế bào MCF-7 là các tế bào bám dính khá lớn, với kích thước tế bào điển hình đo được là 20-25 micron Môi trường được khuyến nghị là EMEM chứa 2 mM L-glutamine, 0.01 mg / mL insulin bò (90%), huyết thanh nhau thai bò (10%) và BSS của Earle chứa 1.5 g / L sodium bicarbonate, 0.1 mM axit amin không thiết yếu và 1 mM natri pyruvate

Về mặt di truyền, dòng MCF-7 không hoàn toàn giống với dòng được phân lập ban đầu Ban đầu, nó được mô tả là có một kiểu nhân có chứa 85 nhiễm sắc thể đã bị giảm 16 nhiễm sắc thể Ngày nay, dòng tế bào MCF-7 có kiểu nhân có chứa 69 nhiễm sắc thể Hơn nữa, có sự khác biệt di truyền giữa dòng tế bào MCF-7 từ Tổ chức Ung thư Michigan và dòng tế bào ATCC

1.1.8.2 Dòng tế bào biếu mô tuyến vú MCF-10A

Dòng tế bào MCF-10A có nguồn gốc từ mô vú của một phụ nữ da trắng bị bệnh u xơ Dòng tế bào là không phải khối u, và được sử dụng như một mô hình để nghiên cứu sự phát triển biểu mô tuyến vú và chuyển đổi tân sinh [22]

Các tế bào MCF-10A là tế bào bất tử, là dòng tế bào biểu mô không bị biến đổi có nguồn gốc từ mô tuyến vú của con người Các tế bào này được định nghĩa là các

tế bào biểu mô vú "bình thường" vì chúng có kiểu nhân gần giống lưỡng bội và phụ thuộc vào các yếu tố tăng trưởng ngoại sinh để tăng sinh Chúng cũng thiếu khả năng hình thành khối u ở chuột và thiếu khả năng phát triển trong các thử nghiệm độc lập Các tế bào MCF-10A là một hệ thống mô hình tuyệt vời để hiểu sinh học tế bào biểu mô Khi được nuôi trong hỗn hợp collagen và laminin, chúng tạo thành các cấu trúc 3D giống với cấu trúc acini của vú người [5], [19]

1.2 Độc tính tế bào

1.2.1 Khái niệm

Độc tính tế bào chỉ ra khả năng của một số hóa chất hoặc tế bào trung gian phá hủy các tế bào sống Bằng cách sử dụng hợp chất gây độc tế bào, các tế bào sống khỏe mạnh có thể được cảm ứng để trải qua hoại tử (necrosis) hoặc tế bào chết theo lập trình (apoptosis) Khả năng đo độc tính tế bào có thể chứng minh là một công cụ rất có giá trị trong việc xác định các hợp chất có thể gây ra những rủi ro nhất định đối với sức khỏe ở người và khá cần thiết trong quá trình phát triển các loại thuốc điều trị ung thư Bằng cách xác định mức độ độc tế bào của tế bào ung thư, thuốc chống ung thư có thể cản trở sự tăng sinh của tế bào đích bằng cách làm rối loạn vật liệu di truyền của chúng hoặc bằng cách ngăn chặn các chất dinh dưỡng mà tế bào cần để tồn tại [6].

Ngoài ra, việc hiểu các cơ chế liên quan đến độc tế bào cũng có thể giúp các nhà nghiên cứu hiểu biết sâu hơn về các quá trình sinh học (cả bình thường và bất thường) chi phối sự phát triển của tế bào, tăng sinh tế bào và tử vong

1.2.2 Các phương pháp xác định độc tính tế bào

Độc tính tế bào được xác định bằng nhiều cách khác nhau, đánh giá khả năng sống của tế bào thông qua việc sử dụng thuốc nhuộm formazan là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong việc xác định độc tính tế bào Thuốc nhuộm formazan là các sản phẩm tạo màu được hình thành do sự khử muối tetrazolium bởi dehydrogenase, chẳng hạn như lactate dehydrogenase (LDH) và

1.2.4 IC50

Là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp, IC50 được xác định qua MTT assay

1.2.5 CFU (Colony forming assay)

Sự tăng sinh tế bào là quá trình dẫn đến sự gia tăng số lượng tế bào và được xác định bởi sự cân bằng giữa sự phân chia tế bào và sự mất tế bào thông qua sự chết hoặc biệt hóa tế bào Tăng sinh tế bào được tăng lên trong các khối u

Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony forming unit – CFU) là một tham số đánh giá số lượng các khuẩn lạc có thể nhìn thấy được hình thành từ các tế bào thể hiện dưới dạng CFU/ml Sau khi xử lí tế bào với thuốc, sẽ có một số tế bào được duy trì đủ để tăng sinh và hình thành khuẩn lạc [34]

Xét nghiệm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) là một trong những xét nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất cho các tế bào gốc và tế bào gốc tạo máu Các xét nghiệm CFU cho phép đo lường khả năng tăng sinh và biệt hóa của từng tế bào trong một mẫu Tiềm năng của các tế bào này được đo bằng cách quan sát các khuẩn lạc (bao gồm các tế bào khác biệt hơn) được tạo ra bởi mỗi tế bào tiền thân đầu vào Khoảng 14 ngày nuôi cấy là đủ để cho phép các khuẩn lạc phát triển đến một kích

Chết theo lập trình của tế bào xảy ra thông qua apoptosis (chết rụng) Sự chết của tế bào theo lập trình đặc trưng bởi chuỗi thay đổi về hình thái đã được biết rõ, gọi là apoptosis, tiếng Hy Lạp có nghĩa là “rụng xuống”, từ một cái cây Tế bào chết co lại, cô đặc, và sau đó phân mảnh, giải phóng các apoptosome có màng bao bọc và thường được các tế bào khác thu nạp Ở các tế bào đang chết, nhân tế bào cô đặc DNA phân mảnh Điều quan trọng là các thành phần nội bào không bị giải phóng vào môi trường ngoại bào, vì chúng có thể gây hại cho các tế bào lân cận

Các gen liên quan đến việc điều khiển sự chết của tế bào mã hóa cho những protein với ba chức năng chính sau:

- Các protein “sát thương” cần thiết để tế bào bắt đầu quá trình apoptosis - Các protein “phá hủy” làm nhiệm vụ như phân hủy ở các tế bào đang chết Các protein “nuốt chửng” cần thiết cho quá trình thực bào các tế bào đang chết bởi các tế bào khác

Ngược lại với quá trình apoptosis, tế bào chết đáp ứng lại tổn thương mô thể hiện sự thay đổi hình thái rất khác, được gọi là necrosis (hoại tử) Tế bào diễn ra necrosis thường căng lên và vỡ ra, giải phóng các thành phần nội bào, làm tổng thương các tế bào xung quanh và gây ra phản ứng viêm [13]

1.3.2 Cơ chế

Quá trình chết rụng tế bào được điều tiết bởi nhiều tín hiệu, những tín hiệu này có thể đến từ bên ngoài tế bào hoặc ngay ở bên trong tế bào Các tác động bên ngoài có thể bao hàm các chất độc, kích hãm tố, chất kích thích, monoxit nitơ, hay cytokine; chúng có thể đi xuyên qua lớp màng tế bào hay tác động theo cơ chế truyền tín hiệu để kích thích một phản ứng Các tín hiệu này có thể là tích cực (khơi mào, kích thích) hoặc tiêu cực (ngăn chặn, ức chế, ) đối với quá trình chết rụng

Trước khi quá trình chết thật sự của tế bào được kích thích bởi các enzyme, các tín hiệu chết rụng phải khiến cho các protein khơi mào chu trình chết rụng Kết quả của bước này sẽ quyết định việc tín hiệu chết rụng sẽ gây ra cái chết cho tế bào hay quá trình chết rụng sẽ bị đình lại Một số protein tham gia vào quá trình này, tuy nhiên hiện nay mới có hai quá trình điều tiết chính được nhận diện: tác động vào ti thể về mặt chức năng hay truyền tín hiệu chết rụng trực tiếp thông qua các protein tiếp hợp tới cơ chế chết rụng Một chu trình ngoại bào cho việc khơi mào được nhận diện trong một vài nghiên cứu về chất độc, đó là việc tăng nồng độ canxi trong tế bào bởi các tác động của thuốc, điều này sẽ gây ra sự chết rụng thông qua calpain,

một enzyme dạng protase có hoạt tính phụ thuộc vào việc canxi bám vào nó [7]

1.3.3 Kĩ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow Cytometry)

Kỹ thuật Flow Cytometry hay còn gọi là phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy là một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân tích biểu hiện bề mặt tế bào và các phân tử nội bào, mô tả và xác định các loại tế bào khác nhau trong quần thể tế bào không đồng nhất, đánh giá độ tinh khiết của các phân nhóm con bị cô lập và phân tích kích cỡ và khối lượng tế bào Nó cho phép phân tích nhiều tham số đồng thời các tế bào đơn [16].

Flow cytometry được ứng dụng trong: Đếm tế bào, Phân loại tế bào, Phát hiện chỉ thị sinh học, Kỹ thuật protein

Flow cytometry là kỹ thuật cho phép phân lọai tế bào (tế bào riêng rẽ) khác nhau dựa trên các đặc điểm khác nhau của chúng, việc xác định dựa trên cơ sở cách chúng

di chuyển trong một dòng dung dịch Thiết bị sử dụng trong kỹ thuật này cho phép thu thập các thông tin về tế bào thông qua dạng tế bào, sự phát xạ huỳnh quang, cho phép sắp xếp tế bào dựa trên cơ sở đặc tính vật lý, hóa học và đặc tính của kháng nguyên

Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào dòng chảy là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và một điện trường Nguyên lí này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng tế bào

Hình 1.1 Phosphatidylserine (PS) liên kết với Annexin V ở ngoài màng tế bào

Xét nghiệm Muse Annexin V và Cell Dead dựa trên phát hiện phosphatidylserine (PS) trên bề mặt các tế bào apoptotic, sử dụng Annexin V có nhãn huỳnh quang trong kết hợp với cell dead marker, 7-AAD Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2 + có ái lực cao với PS, một thành phần của màng xuất hiện ở mặt trong của màng tế bào Ở giai đoạn apoptotic sớm, các phân tử của PS được chuyển ra bề mặt ngoài của màng tế bào nơi Annexin V có thể dễ dàng liên kết Các tế bào apoptotic giai đoạn muộn cho thấy mất tính toàn vẹn của màng Thuốc nhuộm màng 7-AAD được sử dụng để phân biệt các tế bào chết với các tế bào apoptotic ở gian đoạn sớm Do đó, xét nghiệm có thể phân biệt bốn quần thể:

• Các tế bào sống, không trải qua quá trình apoptosis có thể: Annexin V (-) và dead cell marker (-)

Phallus indusiatus, thường được gọi là nấm tre, nấm nữ hoàng, stinkhorn lưới

dài, là một loại nấm trong họ Phallaceae Nó thường phân bố ở các khu vực nhiệt

đới, và được tìm thấy ở miền nam châu Á, châu Phi, châu Mỹ và Úc, mọc trong

rừng, mọc trên đất gần các gốc cây lớn, có lớp lá mục dày, ẩm ướt [14]

1.4.2 Đặc điểm [31], [32]

Khi còn nhỏ: Phần chóp của nấm thường có màu nâu đậm hoặc đen Ở chóp nấm

thường có một lớp chất nhầy bao phủ

Khi trưởng thành: Từ chóp nấm bung nở ra một lớp mạng giống như những mắt lưới được đan vào nhau Lớp mạng này thường có màu vàng hoặc trắng, bao phủ từ chóp xuống chân nấm

Ở phần chóp nấm có chất nhầy phát ra mùi khó chịu, thường thu hút ruồi, muỗi đến đậu, vì vậy, khi nấm trưởng thành nếu không thu hái kịp lúc, nấm sẽ rất nhanh chóng bị thôi rữa

Thời gian sinh trưởng khá nhanh, thông thường, nấm chỉ mất khoảng hơn hai tháng để phát triển thành quả thể Thời gian từ khi nấm có quả thế đến khi trưởng thành chỉ tầm 4 – 5 ngày Nấm trưởng thành cao khoảng 8 -10cm

Hình 1.3 Nấm tre lúc nhỏ (trái) và lúc trưởng thành (phải)

1.4.3 Phân loại khoa học

Giới: Fungi

Ngành: Basidiomycota Lớp: Agaricomycetes Bộ: Phallales

Họ: Phallaceae Chi: Phallus Loài: P indusiatus

1.4.4 Hoạt tính sinh học

Quả thể của nấm có chứa polysaccharide có hoạt tính sinh học Một β-D-glucan được gọi là T-5-N và được điều chế từ dung môi có tính kiềm đã được chứng minh là có đặc tính chống viêm [10] Polysaccharide có hoạt tính ức chế khối u S180

(sacroma 180) ở chuột [30]

Polysaccharide trong nấm tre cũng được chứng minh có hiệu quả trong chống nhiễm trùng, chống viêm, tăng cường miễn dịch và chống tăng đường huyết Loại nấm này từ lâu đã được công nhận là có đặc tính kháng khuẩn Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng chiết xuất của nấm tre có chất chống oxy hóa bên cạnh đặc tính kháng khuẩn Tính chất chống oxy hóa của chiết xuất nấm tre từ methanol đã được báo cáo Chiết xuất nấm đã được thử nghiệm chống lại nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh cho người, và trong một số trường hợp có hoạt tính kháng khuẩn tương đương với kháng sinh ampicillin, tetracycline và nystatin Hơn nữa, đặc tính kháng khuẩn của chiết xuất nấm tre từ ethyl acetate, ethanol, acetone và dầu chưng cất cũng được đề cập ở một vài nghiên cứu [18], [14]

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Bamboo dried-mushroom (bbd)

Được tách chiết từ 3 loại dung môi khác nhau là nước cất (DW), Ethanol (Et) và Hexan (H) thành 12 dịch chiết nấm Dbbmf, Dbbmd, Dbbf, Dbbd, Etbbmf, Etbbmd, Etbbf, Etbbd, Hbbmf, Hbbmd, Hbbf, Hbbd

2.1.2 Dụng cụ - thiết bị

Dụng cụ:

- Đĩa 96 giếng, 6 giếng - Ống ly tâm 10ml, 50ml - Buồng đếm hồng cầu - Flask T75, T25

- Pipetteman 10ul, 100ul, 1000ul - Eppendorf 1.5ml

- Giấy nhôm

Thiết bị:

- Tủ lạnh

- Tủ cấy vô trùng