Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của cao N-Hexane từ lá Thiết Đinh Cà Ná (Markhamia stipulata Var. canaense V.S. Dang).pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGƯYẺN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG KHÓA LƯẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TRÊN DỊNG TÉ BÀO UNG THU vú MCF-7 CỦA CAO 2V-HEXANE TÙ LÁ THIẾT ĐINH CÀ NÁ (MARKHAMIA STIPULATA VAR CANAENSE v.s DANG) Sinh viên thực hiện: Đoàn Hoài Thanh Mã số sinh viên: 1411527227 Lóp: 14DSH02 Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Giáo viên hướng dần: TS Nguyễn Tất Phát TP.HCM, tháng năm 2018 LỜI CẢM ƠN Lời em xin cảm ơn Thầy, Cô Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại học Nguyễn Tất Thành truyền đạt kiến thức tận tình em có nhừng kiến thức bồ ích thời gian học tập trường Đe có thành báo cáo em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Tấn Phát, giảng viên trực tiếp hướng dần người bỏ thời gian, cơng sức dìu dắt điểm thiếu sót truyền cho em dam mê nghiên cứu để em hoàn thành báo cáo cách tốt Em xin gửi lời cảm ơn tới Viện Cơng nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt nhất, giúp đỡ em suốt thời gian qua em xin cảm ơn đến anh chị, bạn làm việc phịng Các chất có hoạt tính sinh học Đặc biệt anh ThS Ngơ Trọng Nghía nhiệt tình giúp đờ, hướng dần động viên em lúc khó khăn thời gian thực đề tài Cuối em xin cảm ơn gia đình, cha mẹ bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên, hồ trợ chia suốt thời gian làm khóa luận năm Đại học Em xin chân thành cảm ơn! Đồn Hồi Thanh Khoa Cơng nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii TÓM TẮT V DANH MỤC BẢNG ix 1.1 Thiết đinh Cà Ná 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.2 Nghiên cứu nước 1.3 Nghiên cứu nước 1.3.2 Các nghiên cứu dược lý 10 1.4 Ung thư vú 11 1.4.1 Ung thư 11 1.4.2 Ung thư vú 11 1.4.3 Phân loại 11 1.4.5 Giai đoạn phát triển 12 1.4.6 Điều trị 13 1.4.7 Phòng ngừa bệnh 13 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 14 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 14 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ .14 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.3.1 Điều chế cao chiết 14 2.3.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 14 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 15 2.4 Thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) 15 2.4.1 Quy trình 15 2.4.2 Đọc kết .16 2.4.3 Xử lý kết 16 2.5 Phương pháp sắc ký 17 iii 2.5.1 Chẩn bị sắc ký cột 17 2.5.2 Nạp cao vào cột 18 CHƯƠNG KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Điều chế cao chiết 19 3.2 Ket thử hoạt tính gây độc tế bào ung thu vú MCF-7 21 3.3 Ket phân lập hợp chất từ cao /7-hexane sắt ký cột 22 3.3.1 Xác định cấu trúc MSH05 25 3.3.2 Xác định cấu trúc MSH06 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 TÀI LIỆU KHAM KHAO 33 iv TĨM TẤT Đe tài “Khảo sát hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 thành phần hóa học cao n-hexane tù’ lồi thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var canaense v.s Dang)” thực phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, địa số 01 Mạc Đĩnh Chi, Phường Ben Nghé, Quận 1, TP Hồ Chí Minh Đề tài thực từ tháng 02/2018 đen tháng 07/2018 với mục tiêu khảo sát số hoạt tính Thiết đinh Cá Ná gây độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 phân lập thành phần hóa học cùa họp chất có Thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipuỉata NSĨ canaense v.s Dang) Nội dung thực hiện: Điều chế cao chiết từ Thiết đinh Cá Ná bang ethanol 96° Điều chế cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau: cao /7-hexane, ethyl acetate dịch nước Điều chế phân đoạn từ cao /7-hexane Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 Phân lập 02 hợp chất phưong pháp sắc ký phân đoạn có hoạt tính gây độc tốt Xác định cấu trúc hố học hợp chất phân lập phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Ket đạt sau tháng: Hồ sơ gây độc dòng te bào ung thư vú MCF-7 phân đoạn cao /?-hexane Cấu trúc họp chất tinh khiết xác định MSH05 (dihydroapigenin hay gọi Naringenin) MSH06 ( Luteolin) V SUMMARY Topic “Investigation of cytotoxic activity against breast cancer cell line MCF-7 and chemical composition of the /7-hexane extract from Markhamia stipulata var canaense v.s Dang” was carried out in the laboratory of Vietnam Academy of Science and Technology, address: 01 Mac Dinh Chi Street, Ben Nghe Ward, District 1, Ho Chi Minh City The subject was studied from February 2018 to July 2018 to skim cytotoxic activitiy of Markhamia stipulate! var canaense v.s Dang toxic on the breast cancer cell line MCF-7 and isolated the chemical compositions of the leaves from Markhamia stipulata var canaense v.s Dang Content includes: Prepared the crude ethanol 96° extract from Markhamia stipulata var canaense v.s Dang leaves Prepared extract different: 77-hexane extract, ethyl acetate extract and aqueous solution Prepared fractions from 77-hexane extract Tested the cytotoxic effect on the breast cancer cell line MCF-7 Two compounds were isolated by chromatographic method with the best activity Determined the chemical structures of the compounds isolated by chemical and biological methods (NMR) Result achieved after months: Records of toxicity on MCF-7 breast cancer cell lines of the 77-hexane extract The structures of two pure compounds were identified as Dihydroapigenin (Naringenin) (MSH05) and Luteolin (MSH06) VI DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT S: Độ dịch chuyển hóa học (Chemical Shift) 13C-NMR: Phô cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon Nuclear Magnetic Resonance) 'H-NMR: Pho cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) CC: Sac ký cột (Column Chromatography) d: Mũi đôi (Doublet) dd: Mũi đôi đôi (Doublet of Doublet) DMSO: Dimethyl sulfoxyde g: gram HMBC: Pho tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) IC50: Nồng độ ức chế ( Half maximal Inhibitory Concentration ) J: Hang so ghép (Coupling Constant)kg: mg: milligram NMR: Phương pháp phố cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic kilogram Resonance) 5: Mũi đơn (Singlet) SRB: Sulforhodamine B TCA: Trichloroacetic acid TLC: Sac ký lớp mỏng (Thin layer Chromatography) TLTK: Tài liệu tham khảo C: Cloroform EA: Ethyl Acetate H: Hexane ME: Methyl Acetate V11 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh Markhamia stỉpulata var canaense v.s Dang Hình 1.2 Ung thư vú Hình 3.1 Quy trình điều chế cao chiết Hình 3.2 Quy trình chạy sắc ký cột Hình 3.3 Các tương tác HMBC cấu trúc hợp chat MSH05 Hình 3.4 Các tương tác HMBC cấu trúc hợp chat MSH06 viii DANH MỤC BANG Bảng 3.1 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 phân đoạn cao n- hexane nong độ 100 pg/mL Bảng 3.2 Kết giá trị ICsocủa mẫu dòng ung thư vú MCF-7 Bảng 3.3 Kết khảo sát phân đoạn MSHIV Bảng 3.4 Kết khảo sát phân đoạn MSHIV.4 Bảng 3.5 Kết khảo sát phân đoạn MSHIV.6 Bảng 3.6 Dừ liệu phổ 13c, 'H-NMR, HMBC MSH05 so sánh với TLTK Bảng 3.7 Dừ liệu phổ 13c, 'H-NMR, HMBC MSH06 so sánh với TLTK IX ĐẶT VÁN ĐÈ Đặt vấn đề Việt Nam nước nằm vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có nguồn thực vật vô phong phú đa dạng Từ xa xưa người dân biết sử dụng cỏ xung quanh đe làm dược liệu chừa bệnh thơng thường bệnh khó trị, bệnh nan y Các dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên ngày phát triên Việt Nam giới dược phẩm khơng gây tác dụng phụ lại chứa nhiều hợp chất quý Với phát triển mạnh mè khoa học công nghệ che biến dược liệu, nhiều hợp chất thiên nhiên phân lập ứng dụng rộng rãi nhờ vào phương pháp sắc ký Sắc ký đời từ năm 1903 nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) Các cột sắc ký thường dùng phịng thí nghiệm vơ hữu đế phân lập sản phẩm mong muốn khỏi sản phẩm phụ sau phản ứng hoàn thành Ta cho hồn hợp phản ứng qua ống thủy tinh thăng đứng, bên có nhồi hạt silica alumina, chất thu lại thành phần nhỏ hay phân đoạn nhỏ đầu cột Các thành phần khác mầu phân tách thành loại hợp chất khác tương tác hồn họp với silica Nhờ có khả tách riêng rè chất cho kết phân tích định tính định lượng rõ ràng Trong sản xuất nơng nghiệp, sắc ký góp phần tách định lượng chất dinh dưỡng sản phấm, phân tích độc tố, hóa chất bảo vệ thực vật, kim loại nặng thực phẩm, nước uống Trong chừa bệnh, sắc ký góp phần phân tích thuốc kháng sinh, phân tích dược phàm, dược liệu Các nhà khoa học đặc biệt quan tâm chi Markhamia có nhiều dược tính sinh học có the điều trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, làm thuốc chữa đau răng, đau dày, nhức đầu, co giật trẻ em, chừa tiêu chảy, kháng khuẩn, chống oxy hóa, giảm đau, bệnh ký sinh trùng, ... thành phần hóa học Thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipuỉata var canaense v.s Dang) giới Do đó, nhóm nghiên cứu đề xuất đề tài “Khảo sát hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư vú MCF-7 thành phần hóa học. .. bệnh trở thành vấn đề cấp bách không Việt Nam mà giới Phạm vi nghiên cứu Tập trung nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 thành phần hóa học cùa Thiết đinh Cà Ná (Markhatnia stipulata. .. sát hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư vú MCF-7 thành phần hóa học cao n-hexane tù’ loài thiết đinh Cà Ná (Markhamia stipulata var canaense v.s Dang)” thực phịng thí nghiệm Viện Cơng nghệ Hóa