Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của mật ong hoa cà phê tại tỉnh đắk lắk

Do đó, tính khả thi của đề tài có thể được đáp ứng cao.Các phương pháp đượcáp dụng cụ thể như sau:Nội dung 1: Phân tíchcác chỉ tiêu hóalý• Xác định đường tổng bằng phenol - sulfuric theo

Bộ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÃI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THựC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOẤ HỌC CÁP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của mật ong hoa cà phê tại tỉnh Đắk Lắk

Mã số đề tài: 21.2SHTPSV02

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Nữ Trinh

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường và ban lãnh đạo

Viện Công nghệ sinh học - Thực phẩm đã tạo điều kiện cho tôi về cơ sở vật chất,

máy móc thiết bị cũng như phòng thí nghiệm để tôi hoàn thành nghiên cứu này

Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt sâu sắc đến tập thể giảng viên hướng dẫn

TS Nguyễn Ngọc Tuấn và PGS.TS Nguyễn Quang Vinh đã hướng dẫn tận tình,góp ý và truyền đạt kiến thức bổ ích về nghiên cứu khoa học trong quá trình thực

hiện nghiên cứu này Đồng thời tôi xin cảm ơn Nhà trường đã hỗ trợ kinh phí đểthực hiện đềtài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn và những lời chúc tốt đẹp, thành công đến quý thầy cô, ban lãnh đạo Viện và nhà trường

Xin chân thành cảm ơn!

PHẦN I THÔNG TIN CHƯNG

1.5 Thòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 03 năm 2023

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm

1.5.3 Thựchiện thực tế: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng03 năm 2023

(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tẻ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tỗng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 50 triệu đồng.

II Kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề

Mật ong là mộtsản phẩmthực phẩm rất phổ biến ở mọi nơi trên thế giới Đặc tínhcủa mật ong nổi bật ởvị ngọt,mùi thơm dễ chịu,hàm lượng dinh dưỡng cao, hoạt tính sinh học đặctrưng như hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa Con người đãsử dụngmật ong từ rất lâuđời Mậtong được bổ sung vào nhiều loạithực phẩm và đồ uốngvới vai trò chất làmngọt

để lấy mật Ngoài ra, các đặc tính về vậtlý và hoáhọc của mật ongcòn tuỳ thuộc vào điều

kiện khí hậu và thổ nhưỡng [2, 3] Hiệnnay trên thế giới, rất nhiều nghiên cứu vềđặc điểm

hoálý, hoá học và hoạt tính sinh học của mật ong đã được côngbố Một số nghiên cứu chothấy, mật ong có khả năng chốngoxy hoá, khángviêm, kháng khuẩn, khángvirút, điều trị bệnh tiểu đườngvàkháng ung thư[4-6]

Đắk Lắk được xem là thủ phủ càphêRobusta của Việt Nam Cùng với sựpháttriển về cà phê, thì nghề nuôiong lấy mậthoacà phê tạiĐắk Lắk đang phát triển rất mạnhtheohướngcông nghiệp hóa Tuy nhiên, hiện nay cácnghiên cứu về các đặc điểmhóa lý, thành phầnhóa học và hoạt tính chống oxy hoá của mật ong hoa cà phê ở Đắk Lắk còn chưa được

nghiên cứu nhiều Nghiên cứu này nhằm xác định tínhchất hoá lý, thành phầnhóa học và

hoạt tính kháng oxy hoá của mật ong hoacà phê ởmột số cơ sở nuôi ong tại tỉnh ĐắkLắk

Vì vậy, chúng tôi lựa chọnđề tài “Nghiêncứu thànhphần hóa học và hoạt tính chống oxyhóa của mật ong hoa cà phê tại tỉnh Đắk Lắk”

2 Mục tiêu

• Xác địnhtính chất hóa lý của mậtong hoa cà phê tại Đắk Lắk

• Nghiên cứu thành phần polyphenol và alkaloid của mật ong hoa cà phê tại Đắk

Lắk

• Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của mật ong hoa cà phê tại Đắk Lắk

3 Phuong pháp nghiên cứu

Đe tài nghiên cứu tiếp cận dựa trên các phương pháp phân tích hóa lý theo TCVN 12605:2019, phân tích hàm lượng các hợp chất chuyển hóa bậc hai dựa trên các

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đồng thời kết hợp các tài liệu cải tiến phương pháp đã được công bố trong thời gian gần đây Đây là các phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao Do đó, tính khả thi của đề tài có thể được đáp ứng cao

Các phương pháp đượcáp dụng cụ thể như sau:

Nội dung 1: Phân tíchcác chỉ tiêu hóalý

• Xác định đường tổng bằng phenol - sulfuric theo Michel Dubois Và Cs(1956)

• Tổng đường khử bằng phương pháp DNS

• Hàm lượng hydroxymetylfurfural theo TCVN 5270:2008

• Hàm lượng acid tự do theo Ligia et al(2013)

• Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháo nung

Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần polyphenol và alkaloid của mật ong hoa cà phê

Đắk Lắk

• Xác định tổng polyphenol theo Follin and Ciocalteu (1927)

• Xác định tổng flavonoid bằng phương pháp quang phổ theo Jia và cộng sự

(1999)

• Phân tích hàm lượng mộtso phenolic acid trong mật ong bằng máy HPLC

• Phân tích hàm lượng trigonelline và caffeine trong mật ong hoa cà phê Đắk Lắk

Nội dung 3: Xác định hoạt tính khángoxy hóabằng DPPH,ABTS

4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu lần đầu tiên công bố các số liệu đặc trưng của mật ong hoa càphê tại Đắk Lắk về hàm lượng đườngtổng, đường khử, tổng phenolic vàflavonoid Đồngthời, các hợp chất chuyển hóa bậc hai bao gồm bảy loại phenolic acid và hai

alkaloid (trigonelline, caffeine) được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xử lý số liệu bằng phương pháp phân tích thành phần chính

hydroxymethylfurfural (HMF) (0,048-2,933 mg/kg) và hàm lượng axit tự do (20,326-31,163 meq/kg) của mậtong hoa cà phê thấp phản ánh độ tưoi của mật ong

khi tiến hành nghiên cứu Mật ong cà phê có hàm lượng đường tổng và đường khử

trung bình lần lượt là 831,711 g/kg và 697,903 g/kg Hàm lượng tổng phenolic(0,642 mg GAE/g) và flavonoid (0,034 mg GE/g) trong mật ong hoa cà phê đã gópphần vào khả năng chốngoxy hóa củacác mẫu mật ong Trong số các mẫu mật ong

hoa cà phê khảo sát về hoạt tính chống oxy hóa, giá trị IC50 của mật ong đối vóiDPPH là 1,134-17,031 mg/mL, trong khi IC50 đối vói ABTS là 115,381-213,769

mg/mL Kết quả phân tích thành phần phenolic acid cho thấy gallic acid

(0,367-10,124 mg/kg) và ferulic acid (0,236 - 2,977 mg/kg) đều có hàm lượng cao trong tất

cả các mẫu mật ong Hàm lượng trigonelline và caffeine trong các mẫu mật ong càphê dao động từ 0,314-2,399 mg/kg và 8,946-37,977 mg/kg Các số liệu trong luậnvăn góp phần cung cấp thêm thôngtin về các đặc tính hóalý, thành phần hóahọc và

hoạt tính chống oxyhóa của mậtong hoa cà phê tại Đắk Lắk

5 Đánh giá các két quả đã đạt được và két luận

Nghiên cứu này lần đầu tiên đã đưa ra các giátrị nhằm xác định các đặc tính hóa lý,

tổng hàm lượng phenolic và tổng hàm lượng flavonoid, cũng như định lượng bảy

phenolic acid riêng lẻ, hai alkaloid có trong mật ong hoa càphê (CoffeaRobusta) từ

Đắk Lắk và một số loại mật ong hoa khác Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các

mẫu mật ong hoa cà phê (Coffea robusta) ở Đắk Lắk được đặc trưng bởi hàm lượng

gallic acid (1,067 - 1,935 mg/kg), ferulic acid (1,927 - 2,766 mg/kg) và hàm lượng caffeine (8,946 - 37,977 mg/kg), cũng như hàm lượng tổng phenolic (0,519 - 0,893

mgGAE/g) vàflavonoid (0,032 - 0,037 mgQE/g) cao Sự hiện diện đồngthời tấtcả

bảy loại phenolic acid, hàm lượng đường tổng và đường khử là những yếu tố đáng

lưu ý trong kết quả thu được Đồng thời, kết quả thu được chothấy chất lượng của

mật ong hoa cà phê (Coffea Robusta) từ Đắk Lắk ở mức độ tốt Những đặc điểm cụthể này của mật ong hoa cà phê (Coffea Robusta) ở Đăk Lắk cho thấy chúng có thể

là một nguồn năng lượng tiềm năng vì hàm lượng đường tổng và đường khử tưong đối cao được xem nguồn cung cấp chất dinh dưỡng tốt Hoạt tính chống oxy hóa

của mậtong hoa cà phê ỏ mức cao với giá trị IC50 đối vói khả năng bắt giữ gốc tự

do DPPH dao động từ 1,134 đến 17,031 mg/mL và giá trị IC50 đối vói gốc tự do

ABTS dao động từ 115,381 đến 213,769 mg/mL mang lại lợi ích cho sức khỏe con

người Dữ liệu trong nghiên cứu này nhấn mạnh sự liên quan của mật ong hoa cà

phê (Coffea Robusta) ở Đắk Lắk đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt cho sức khỏe của người tiêu dùng

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Nghiên cứu tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu mật ong hoa cà phê (Coffea robusta) từ Đắk Lak Kết quả nghiên cứu

lần đầu tiên công bố các số liệu đặc trưng của mật ong hoa cà phê tại Đắk Lắk về

hàm lượng đường tổng, đường khử, tổng phenolicvà flavonoid Đồngthời, các hợp

chất chuyển hóa bậc hai bao gồm bảy loại phenolic acid và hai alkaloid(trigonelline, caffeine) được định lượng bằng phưong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xử lý số liệu bằng phưong pháp phân tích thành phần chính (PCA)nhằm phân biệt các mẫu mật ong nghiên cứu Hàm lượng hydroxymethylfurfural(HMF) (0,048-2,933 mg/kg) và hàm lượng axit tự do (20,326-31,163 meq/kg) của

mật ong hoa cà phê thấp phản ánh độ tươi của mật ong khi tiến hành nghiên cứu.Mật ong cà phê có hàm lượng đường tổng và đường khử trung bình lần lượt là 831,711 g/kg và 697,903 g/kg Hàm lượng tổng phenolic (0,642 mg GAE/g) và ílavonoid (0,034 mg GE/g) trong mật ong hoa cà phê đã góp phần vào khả năng

chống oxy hóa củacác mẫu mật ong Trong sốcácmẫu mậtong hoacàphê khảo sát

về hoạt tính chống oxy hóa,giátrị IC50 của mật ong đối với DPPH là 1,134-17,031

mg/mL, trong khi IC50 đối với ABTS là 115,381-213,769 mg/mL Kết quả phân tích thành phần phenolic acid cho thấy gallic acid (0,367-10,124 mg/kg) và ferulic

acid (0,236 - 2,977 mg/kg) đều có hàm lượng cao trong tất cả các mẫu mật ong.Hàm lượng trigonelline và caffeine trong các mẫu mật ong cà phê dao động từ

0,314-2,399 mg/kg và 8,946-37,977 mg/kg Các số liệu trong luận văn góp phần cung cấp thêm thông tin về các đặc tính hóa lý, thành phần hóa học và hoạt tínhchống oxy hóa của mật ong hoacàphê tại Đắk Lắk

The thesis was focused on the chemical compositions and antioxidants from Monofloral honey samples (Coffea robusta) in Dak Lak This is the first report onthe contents oftotal and reducing sugars, total phenolic contents, and total flavonoid

contents The contents of seven phenolic acids and two alkaloids (trigonelline and

caffeine) were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) andanalyzed with the assistance ofprinciple component analysis(PCA) to differentiate

the honey samples into groups The hydroxymethylfurfural (HMF) (0,048-2,933mg/kg) and free acid contents (20,326-31,163 meq/kg) ofcoffee honey were lower

honey in Nepal, which reflected the freshness of the honey when conducting this

survey The coffee honey had total sugar and reducing sugar contents 831,711 g/kgand 697,903 g/kg, respectively The high level oftotal phenolic (0,642 mg GAE/g)

and flavonoid (0,0341 mg GE/g) contents of coffee honey contributed to their

antioxidant activity of this honey sample Among the coffee honey tested, the IC50

of DPPH radical-scavenging activities value was 1,134-17,031 mg/mL, while the

IC50 of ABTS radical-scavenging activities value was 115,381-213,769 mg/mL

The phenolic acids composition analysis displayed that gallic acid appeared in high

concentrations in all studied honey samples, ranging from 0,367-10,124 mg/kg, andferulic acid content ranged from 0,236 to 2,977 mg/kg The content of trigonelline and caffeine in coffee honey samples ranged from 0,314-2,399 mg/kg and 8,946-

37,977 mg/kg The data in this study highlight the relevance ofcoffee honey as a healthy substance

III Sản phẩm đề tài, công bố và két quả đào tạo

cấpkính phí thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định

Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối

báo cáo (đối với ấn phẩm là sách, giáotrình cần có bản photo trang bìa, trang chính

và trang cuối kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)

Ghi chú:

- Kèm bản photo trang bìa chuyên đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận và bằng/giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công luận án/ luận văn; (thể hiện tại phần cuối trong báo cáo khoa học)

2 Nguyên, nhiênvật liệu, cây con

V Kiến nghị ( về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)

Tiếp tục nghiêncứuvàđánhgiá sựbiến đổi cáchợp chấtcóhoạt tính sinh học trong mật ong hoa cà phê nhằm cung cấp bộ dữ liệutrọn vẹn về đánh giá giátrị của mật ong hoa cà

phê

VI Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

foods

Nguyen Thi Mu Trinh 11 , Nguyen Ngoc Tuan l'* , Tran Dinh Thang Ping-Chung Kuo 2

bỉg uyen Ba Thanh „ Le Nhat Tam \ Le Hong Tuoi 1, Trang H D Nguyen \ Danh C- Vu 3, Thi L Ho 4 ,

Le Ngoc Anh 5 and Nguyen Thi Thu Thuy 6

th ill 1 clrri@mard.gov

Article

Chemical Composition Analysis and Antioxidant Activity of

Coffea robusta Monofloral Honeys from Vietnam

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐÈ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC

(báo cáo tổng kết sau khi nghiệm thu, đã bao gồm nội dung góp ỷ của hội đồng nghiệm thu)

TÓM TẤT

Nghiên cứu tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu mật ong hoa cà phê (Coffea robusta) từ Đắk Lak Kết quảnghiên cứu lần đầu tiên công bố các số liệu đặc trưng của mật ong hoa cà phê tại Đắk Lắk về

hàm lượng đường tổng, đường khử, tổng phenolic và flavonoid Đồngthời, các hợp

chất chuyển hóa bậc hai bao gồm bảy loại phenolic acid và hai alkaloid

(trigonelline, caffeine) được định lượng bằng phưong pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xử lý số liệu bằng phưong pháp phân tích thành phần chính (PCA)

nhằm phân biệt các mẫu mật ong nghiên cứu Hàm lượng hydroxymethylfurfural(HMF) (0,048-2,933 mg/kg) và hàm lượng axit tự do (20,326-31,163 meq/kg) của

mật ong hoa cà phê thấp phản ánh độ tưoi của mật ong khi tiến hành nghiên cứu.Mật ong cà phê có hàm lượng đường tổng và đường khử trung bình lần lượt là 831,711 g/kg và 697,903 g/kg Hàm lượng tổng phenolic (0,642 mg GAE/g) và

ílavonoid (0,034 mg GE/g) trong mật ong hoa cà phê đã góp phần vào khả năng

chống oxy hóa củacác mẫu mật ong Trong số các mẫu mậtong hoa cà phê khảo sát

về hoạt tính chống oxy hóa, giátrị IC50 của mậtong đối với DPPH là 1,134-17,031

mg/mL, trong khi IC50 đối với ABTS là 115,381-213,769 mg/mL Kết quả phân tích thành phần phenolic acid cho thấy gallic acid (0,367-10,124 mg/kg) và ferulic

acid (0,236 - 2,977 mg/kg) đều có hàm lượng cao trong tất cả các mẫu mật ong.Hàm lượng trigonelline và caffeine trong các mẫu mật ong cà phê dao động từ0,314-2,399 mg/kg và 8,946-37,977 mg/kg Các số liệu trong luận văn góp phần cung cấp thêm thông tin về các đặc tính hóa lý, thành phần hóa học và hoạt tínhchống oxy hóa của mật ong hoacà phê tại Đắk Lắk

The thesis was focused on the chemical compositions and antioxidants from Monofloral honey samples (Coffea robusta) in Dak Lak This is the first report onthe contents of total and reducing sugars, total phenolic contents, and total flavonoid

contents The contents of seven phenolic acids and two alkaloids (trigonelline and

caffeine) were quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and

analyzed with the assistance ofprinciple component analysis(PCA) to differentiate

the honey samples into groups The hydroxymethylfurfural (HMF) (0,048-2,933mg/kg) and free acid contents (20,326-31,163 meq/kg) ofcoffee honey were lowerhoney in Nepal, which reflected the freshness of the honey when conducting this

survey The coffee honey had total sugar and reducing sugar contents 831,711 g/kg

and 697,903 g/kg, respectively The high level oftotal phenolic (0,642 mg GAE/g)

and flavonoid (0,0341 mg GE/g) contents of coffee honey contributed to their

antioxidant activity ofthis honey sample Among the coffee honey tested, the IC50

of DPPH radical-scavenging activities value was 1,134-17,031 mg/mL, while the IC50 of ABTS radical-scavenging activities value was 115,381-213,769 mg/mL

The phenolic acids composition analysis displayed that gallic acid appeared in high

concentrations in all studied honey samples, ranging from 0,367-10,124 mg/kg, andferulic acid content ranged from 0,236 to 2,977 mg/kg The content of trigonelline

and caffeine in coffee honey samples ranged from 0,314-2,399 mg/kg and 8,946-

37,977 mg/kg The data in this study highlight the relevance ofcoffee honey as a

healthy substance

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined.

TÓM TẮT xii

ABSTRACT xiii

LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC xiii

DANH MỤC HÌNH ẢNH xvi

DANH MỤC BẢNG BIỂU xvii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xviii

MỞ ĐẦU 19

1 Đặtvấn đề 19

2 Mục tiêu nghiên cứu 19

3 Đốitượng và phạm vi nghiên cứu 19

4 Cách tiếpcận và phương pháp nghiên cứu 20

5 Ýnghĩathực tiễn của đề tài 20

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 21

1.1 Mậtong 21

1.2 Các loại mật ong: 22

1.3 Thành phần của mật ong: 22

1.4 Hoạt tính chống oxy hóa 24

1.5 Các phương pháp phân tích mật ong: 25

1.6 Mậtong hoacà phê 27

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 29

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu: 29

2.1.1 Mau mật ong hoa cà phê ở Đắk Lắk 29

2.1.2 Mau mật ong so sánh 31

2.2 Hóachất- dụngcụ và thiết bị: 33

2.2.1 Hoáchất phân tích: 33

2.2.2 Thiếtbị phân tích: 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Phân tích các chỉ tiêu hóalý mậtong: 34

2.3.2 Phân tích thành phần polyphenol và alkaloid của mậtong hoa cà phê Đăk Lắk 39

2.3.3 Xác định hoạt tính chốngoxy hóa của mật ong hoa Càphê 45

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu: 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 48

3.1 Kết quả phân tích hóalý của mậtong: 48

3.1.1 Đườngtổng và đường khử tự do 48

3.1.2 Hàm lượng HMF 51

3.1.3 Hàm lượng acid tự do: 53

3.1.4 Hàm lượng khoáng tổng: 54

3.2 Hàm lượngtổng phenolic và tổng ílavonid: 55

3.2.1 Hàm lượngtổng phenolic 56

3.2.2 Hàm lượngtổng flavonoid: 57

3.3 Hoạt tính chốngoxy hóa: 58

3.4 Thành phần phenolic acid trongmật ong 59

3.5 Hàm lượng trigonelline và caffein trong mật ong 62

3.6 Phân tích thànhphần chính (PCA) 63

KẾTLUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh về mật ong 21

Hình 2.1 Hình ảnh tại nơi thu mật 29

Hình 2.2 Mau mật ong hoacà phê Đắk Lắk 30

Hình 2.3 Vịtrí trên bản đồ của các điểm thu mật ong hoacà phê Đăk Lăk 31

Hình 2.4 Mau mật ong hoa khácloại mật ong rừng, mậtong hoa cúc quỳ, mật ong hoa nhãn) 32

Hình 2.5 Mau mật ong thương mại 33

Hình 3.1 Biểu đồ hàm lượng đường tổng 50

Hình 3.2 Biểu đồ hàm lượng đường khử 51

Hình 3.3 Biểu đồ hàm lượng HMF của các mẫu mật ong 52

Hình 3.4 Biểu đồ hàm lượng acid tự docủa các mẫu mật ong 54

Hình 3.5 Biểu đồ hàm lượng khoáng của cácmẫu mật ong 55

Hình 3.6 Sắc kí đồ phân tích phenolic acid trong mẫu mật ong 60

Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồtrigonelline và caffein của mẫu Coffee HC1 63

Hình 3.8 Kết quả phân tích PCA của thành phần 7 phenolic của mật ong 64

Hình 3.9 Kết quả phân tích PCAvề thành phần hóalý, 7 phenolic acid, trigonelline vàcaffein của mẫu mật ong 65

DANH MỤC BẢNG BIÊU

Bảng 2.1 Thông tin về vị trí và tọa độ thu mẫu mật ong hoa cà phê ở Đắk Lắk 30

Bảng 2.2 Mau mật ong so sánh 32

Bảng 2 3 Thiếtbị phân tích 33

Bảng 2.4 Thiết lập thangnồng độ glucose 0-100 ppm 34

Bảng 2.5 Xây dựng đường chuẩn glucose 0-100 ppm 35

Bảng 2.6 Phân tích hàm lượng đường tổngtrong mật ong 36

Bảng 2.7 Xây dựng đường chuẩn glucose 0-100 ppm 37

Bảng 2.8 Phân tích hàm lượng đường khửtự do trong mật ong 38

Bảng 2.9 Thiết lập thangnồng độ 0- 0,09 mg/ml 39

Bảng 2.10 Xây dựng đường chuẩn gallic acid 0 - 0,09 mg/ml 40

Bảng 2.11 Phân tích hàm lượng polyphenol trong mật ong 40

Bảng 2.12 Thiết lập thang nồngđộ quercetin 0 - 100 ppm 42

Bảng 2.13 Xây dựng đường chuẩn quercetin 0-100 ppm 42

Bảng 2.14 Phân tích hàm lượng flavonoid trong mật ong 43

Bảng 3.1 Kết quảchỉ tiêu hóalý của các mẫu mật ong 48

Bảng3.2 Hàm lượng tổng phenolic, flavonoid vàchỉ số kháng oxy hóa của các mẫu mật ong 56

Bảng 3.3 Hàm lượng các phenolic acid trong mậtong 60

Bảng3.4 Hàm lượng trigonelline và caffeine trong mật ong 62

HMF 5 -hydroxymethyl fu rfural

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography

MS Mass spectrometry

NMR Nuclear magnetic resonance

PAD Pulsedamperometry detector

PCA PrincipalComponents Analysis

SOD Superoxide dismutase

SPME Solid-Phase Microextraction

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Mậtong là một sản phẩm thựcphẩm rấtphồ biến ở mọi nơitrên thế giới Đặctính của mật ong nồi bật ở vịngọt, mùi thơm dễ chịu, hàm lượng dinh dưỡng cao, hoạt tính sinh học đặctrưngnhưhoạttính kháng khuẩn, chống oxy hóa Conngười đã sử dụng mật ong từ rất lâu đời Mậtong được bổsung vào nhiềuloại thực phẩmvà đồ uốngvới vai tròchất làm ngọt và tạo vị [1]

Trong mật ong có chứa gần 200 hợp chất hoáhọc khác nhau bao gồm đường glucose và fructose chiếm 80-85%, nước 15-17%, khoáng 0,2%, proteinvàamino acid 0,1 - 0,4%, các enzyme, vitamin

và các thành phần khác như các hợp chat phenolic ở dạng vết Tuy nhiên, thànhphần của mật ongthay đổi tuỳ theo từng loại cây trồngmà con ong sửdụng để lấy mật Ngoài ra, các đặc tính về vật

lý vàhoá học củamật ong còntuỳ thuộc vào điều kiện khí hậu vàthồ nhưỡng [2, 3] Hiện nay trên

thế giới, rất nhiều nghiên cứu về đặc điểm hoá lý, hoá học và hoạt tính sinh học của mật ong đãđược công bố Một số nghiên cứu cho thấy, mật ong có khả năng chống oxy hoá, kháng viêm,

kháng khuẩn, kháng virút, điềutrịbệnhtiểu đườngvà kháng ungthư [4-6]

Đắk Lắk được xem là thủphủ cà phê Robusta của Việt Nam Cùng với sựpháttriển về cà phê, thìnghề nuôi ong lấy mật hoa cà phê tại Đắk Lắk đang phát triển rất mạnhtheo hướng công nghiệphóa Tuy nhiên, hiện nay các nghiên cứu về các đặc điểm hóa lý, thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hoá của mật ong hoa cà phê ở Đắk Lắk còn chưa được nghiên cứunhiều Nghiên cứu này nhằm xác định tính chất hoá lý, thành phần hóa học và hoạttính kháng oxy hoá của mật ong

hoa cà phê ở một sốcơ sởnuôi ong tại tỉnh ĐắkLak Vìvậy, chúng tôi lựa chọn đề tài“Nghiêncứu

thành phần hóa học và hoạttính chống oxyhóacủamật ong hoacàphêtại tỉnh Đắk Lak”

• Xác định tính chất hóalý củamật ong hoa cà phê tại ĐắkLắk

• Nghiên cứu thành phần polyphenol và alkaloid của mậtong hoacàphê tại Đắk Lắk

• Nghiên cứu hoạt tínhchốngoxy hóa của mật ong hoacà phê tại Đắk Lắk

• Đối tượng nghiên cứu là: mậtong hoa cà phê ở tỉnh Đắk Lắk

• Phạm vi nghiên cứu là: thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của mật ong hoa

cà phê

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Đe tài nghiên cứu tiếp cận dựa trên các phương pháp phân tích hóa lý theo TCVN 12605:2019, phân tích hàm lượng các hợp chất chuyển hóa bậc hai dựa trên các phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đồng thời kết hợp cáctài liệu cải tiến phương pháp

đã được công bố trong thời gian gần đây Đây là các phương pháp hiện đại, có độ tin cậy

cao Do đó, tính khả thicủa đề tài cóthể được đáp ứng cao Các phương pháp được áp dụng

cụ thể như sau:

Nội dung 1: Phân tích các chỉ tiêu hóa lý

• Xác định đường tổng bằng phenol - sulfuric theo Michel Dubois Và Cs (1956)

• Tổng đườngkhử bằng phương pháp DNS

• Hàm lượng hydroxymetylfurfural theo TCVN 5270:2008

• Hàm lượng acid tự do theo Ligia et al (2013)

• Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháo nung

Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần polyphenol và alkaloid của mật ong hoa cà phê ĐắkLắk

• Xác định tổng polyphenol theo Follin and Ciocalteu (1927)

• Xác định tổng flavonoid bằng phương pháp quang phổ theo Jia và cộng sự (1999)

• Phân tích hàm lượng một so phenolic acid trong mật ong bằng máy HPLC

• Phân tích hàm lượng trigonelline và caffeine trong mật ong hoa cà phê Đắk Lắk bằng

Nội dung 3: Xác định hoạt tính khángoxy hóabằng DPPH, ABTS

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

• Làm sáng tỏ đặc tính hóalý của mật ong hoacà phê Đắk Lắk

• Làm sáng tỏ thành phần một so phenolic acid và alkaloid có trong mật ong hoa cà phê

Đăk Lăk

• Đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của mật ong hoacà phê DakLắk

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN

Mật ong là một sản phẩm thực phẩm rấtphổbiến ởmọi nơi trên thếgiới Đặc tính của mật

ong nỗi bật ở vị ngọt, mùi thơm dễ chịu, hàm lượng dinh dưỡng cao, hoạttính sinh học đặc trưng như hoạt tínhkháng khuẩn, chống oxy hóa Con người đã sử dụng mật ong từrất lâu đời Mật ong được bổ sung vào nhiều loại thực phẩm và đồ uống với vai trò chất làmngọt

và tạo vị [1],

Mật ong bao gồm nước (15-20%) và carbohydrate (75-80%) Trong đó, carbohydrate chủ

yếu là glucose và fructose, và một lượng nhỏ củaítnhất22loại đườngphức tạp khác Ngoài

ra, mật ong còn chứa các thành phần phụ khác: protein, chat chong oxy hóa phenol, acidaminvà hữu cơ, phenolic acid, flavonoid, khoáng chat, vitamin và các chat có nguồn gốc từ thực vật khác [7],

Hình 1.1 Hình ảnhvề mật ong

Chất lượng tốngthể của mật ong như mùi vị, màu sắc và các đặc tính khác được tạo nên bởi

các họp chất không bay hơi như đường, acid amin, khoáng chất và các hợp chat phenolic Trong khi đó, hương thơm của mật ong chủyếu tạo bởi các thành phần dễ bay hơi [8], Cáctiêu chí thành phan được quy định trong chỉ thị mật ong làcác yêu cầu liên quan đen nong

độ acid, đường khử và đường tổng, 5-hydroxymethylfurfural (HMF), hàm lượng khoáng chất, độ ẩm và chất rắn không tan trong nước [9], HMF được hình thành từ đường khử củamật ong trong môi trường acid và thường được sử dụng đễ đánh giá chất lượng mật ong vì

nó có tương quanchặt chẽ vớisự lão hóa và quá nhiệt của mật ong [10],

Mật ong được báo cáo là có các đặc tính sinhhọc khác nhau bao gồm kháng khuẩn, chống

vi rút, chống viêm, chữa lành vết thương, chong oxy hóa, chongký sinh trùng, cáchoạt tính

chống tiểu đường, chống đột biến và chống khối u Các đặc tính sinh học của mật ong được

công bố có liên quan đến các thành phần hóa học như acid amin, phenolic acid, flavonoid, khoáng chat, vitamin, [11, 12] Tuy nhiên, thành phần của mật ong phụ thuộc vào các yếu

tố như nguồn hoa, vùng địa lý, điều kiện khí hậu, mùa khai thác cũng như điều kiện chế

biến và bảo quản [12] Trong một thời gian trước đây, mật ong không được sử dụng trong chế độ ăn của bệnh nhân tiểu đường vì hàm lượng đường cao Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu

đã được thực hiện để đánh giá công dụng chữa bệnh hiệu quả của mật ong, nhưng kết quảvẫn còn đang tranh cãi, đặc biệt là đối với nhữngngười bị tổn thương về chuyển hóa khácnhau trong đó cóchuyển hóa đường [33]

Có khoảng 320 loại mật ong khác nhau với thành phần thay đổi phụ thuộc chủ yếu vàonguồn gốc thực vật Mật ong có thể được phân thành các loại như: (1) mật ong hoa do ong

thu được chủ yếu từ mật hoa; (2) mật ong do ongthu được từ việc thu thập chất tiếtcủa côn

trùng Rhynchota, qua các tế bào thực vật, nhựa cây; (3) mật ong đơn bội do ong chủ yếu

kiếm ăn trên một loại thực vật và được đặt tên theo loại thực vật; (4) mậtong đa bội hoặc đa

hệ do ong thu thập được từ một số nguồn thực vật, không có nguồn nào là chủ yếu

1.3 Thành phần của mật ong:

Mật ong là một loại thực phẩm chứa khoảng200 chất và chủ yếu bao gồm đường, nước và

các chất khác như protein (enzyme), acid amin tự do, khoáng chất thiết yếu, vitamin, hợp

chat phenolic, hợp chất dễ bay hơi (như monoterpen, dẫn xuất benzen), các hạt (phấn hoa)

có nguồn gốc từ việc thu mật của ong Vì vậy, mật ong còn là nguồn dinh dưỡng vi lượng quan trọng [13]

Protein, chủ yếu là các enzyme, chẳng hạn như invertase, diastase, glucose oxidase,

catalase, peroxidase và acid phosphatase Hàm lượng của các protein thay đổi tùy theo

loài ong mật từ 0,1% đến 3,3% Các acid amin thiết yếu và không thiết yếu chiếm 1%, đặctrưng là proline mộtacid amin chiếm chủ yếu trong mật ong [12]

Mật ong chứa một lượng nhỏ vitamin, chẳng hạn như tocopherol (E), vitamin chống xuất

huyết (K), acid ascorbic (C), thiamine (Bl), riboflavin (B2), niacin (B3), acid pantothenic(B5), và pyridoxine (B6) Các vitamin của phức hợp B và vitamin c chủ yếu có nguồn gốc

từ phấn hoavàchúng có thể bị ảnh hưởng bởi các quá trình lọc hoặc phản ứngoxy hóa [12]

Mật ong có khoảng 0,57% acid hữu cơ Các axit góp phần vào hương vị mật ong và hoạt tính kháng khuẩn Acid chủ yếu trong mậtong là gluconic acid, ngoài ra còn có các aspartic

acid, acetic, fomic, fumaric, galacturonic, malonic, formic, axetoglutaric, glutamic, butyric, glutaric, propionic, pyruvic, glyoxylic, 2-hydroxybutyric, a-hydroxyglutaric, isocitric lactic,

malic, metylmalonic, quinic, succinic,tartaric, oxalic acid [14]

Hàm lượng khoáng chat trong mật ong dao động từ 0,04% đối với mật ong sáng màu đến

0,2% đối với mật ong sẫm màu Trong đó, kali lànguyên tố chiếm hàm lượng nhiều nhất.Tuy nhiên, các phân tử chính có hoạt tính sinh học trong mật ong được đại diện bởi lớp

polyphenol Polyphenol là một nhóm hợp chất chuyển hóa bậc hai được chia thành flavonoid (flavonols, flavon, flavanols, flavanones, anthocyanin, chaicones và isoflavone)

và không phải flavonoid (phenolic acid), cấu hình của các hợp chat polyphenol trong mật ong đã được nghiên cứu rộng rãi, và nó bao gồm các phenolic acid khác nhau như vanillic,

caffeic, syringic, p-coumaric, ferulic, ellagic, 3-hydroxybenzoic, chlorogenic, genistic, gallic, benzoic acid vàcác flavonoid khác nhau chủ yếu làquercetin, kaempferol, myricetin, chrysin, galangin, hesperetin [15], số lượng và loại polyphenol phần lớn phụ thuộc vàonguồn hoa hoặc giống ong mật Một mối tương quan chặt chẽ giữa hoạt tính chống oxy hóa

và tổng hàm lượng phenolic đã được thiết lập [15] Đặc biệt, hàm lượng phenolic acid dao

động từ một vài ( chlorogenic, p-coumaric và ferulicacid) đến hàng chục mg/kg (axit gallic

12-53 mg/kg) trong mật ong của Ý [16] Trong mật ong Serbia, p-coumaric acid chiếm ưuthế (lên đến 9,97 mg/kg), tiếp theo là ellagic acid (0,28-8,48 mg/kg) và các phenolic acid

khác được đại diện với lượng lên đến khoảng 1 mg/kg [17] Trong các loại mật ong Malaysia khác nhau, hàm lượng phenolic thay đổi từ 15 đến 42 mg/kgtrong khi hàm lượng flavonoid từ 11,5 đến 25 mg/kg [18]

Các yếu tố môi trường, theo mùa cũng có thể ảnh hưởng đến thành phần mật ong [19, 20], Màu của mật ong có thể từ vàng đến nâu đậm Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiềm năng

chống oxy hóacủamật ong cótương quan chặt chẽ không chỉ với nồng độ của tổng các hợp

chat phenolic mà còn liên quan đến màu sắc của mật Mật ong có màu sẫm được báo cáo là

cótổng hàm lượng phenoliccao hơn, khảnăng chống oxy hóa caohơn [20]

Thành phần hóa học của mật ong cũng có thể phụ thuộc vào loài ong mật được sử dụng

trong sản xuất mật Hàm lượng chính của tổng số polyphenol (kaempferol và quercetin), cókhảnăng khử cao hơn sẽ ảnh hưởng đến đặc tính chống oxy hóa và kháng khuẩn tốt hơn đã

được công bố dựa trên việc so sánh mật ong được tạo ra từ ong mật đen Sicilian (Apismellifera ssp Sicilian) và ong mật (A mellifera) [21, 22] Ong mật đen Sicilian chịu được nhiệt độ trên 40°C mà các loài khác không chịu được Ngoài ra, chúng còn có khả

năng thụ phấn rấttốt, đảm bảo sự tồn tại của nhiều loài rau quả [21]

1.4 Hoạt tính chống oxy hóa

Stress oxy hóa đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh các rối loạn liên quan đến béo phì do sự phát triển bệnh lý ở mô mỡ trắng Một số nghiên cứu đã chỉ ra mối quan hệ trực tiếp giữa sựhình thành mỡ và sự gia tăng mứcđộ phản ứngoxy (ROS) dẫn đến sựphát triển của bệnh tiểu đường Trên thực tế, ROS tăng cao hoặc tiếp xúc với hydrogen peroxide sẽ

làm thay đổi tín hiệu insulin và chúng làm giảm sự hấp thu glucose của các mô ngoại vi Sự giảm hấp thu glucose đi kèm với sự gia tăng sản xuấtglucose ở gan, tạo gánh nặng cho tế

bào p tuyến tụy tiết ra nhiều insulin hơn dẫn đến suy giảm và rối loạn chức năng của tế bào

p [23] Trong các nghiên cứu, mật ong thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ Hoạttínhchống oxy hóa của mật ong là kết quả của tác động tổng hợp của các hợp chất khác nhau [15] Các thành phần chính của mật ong biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa là polyphenol (phenolic acid và flavonoid), vitamin c, vitamin E, các enzyme (ví dụ, catalase, peroxidase)

và các nguyên tovi lượng [24] Do đó, mật ong được sử dụng trực tiếp hoặc kếthợp với cácliệu pháp thông thường, nhằm đạt đượchiệu quả kiểm soát các bệnh mãn tính liên quan đếnstress oxy hóa Chính vì vậy, một số nghiên cứu đã chothấy mật ong có thể ngăn ngừa các

tìnhtrạng bệnh lýdo stress oxy hóagây ra Các thử nghiệm in vitro cho thấy mật ong có thể

thu gom các gốc tự do, gốc peroxyl, oxit nitric, cũngnhư khử các cation sat, chelate các ion

kim loại và ức chế quá trình peroxy hóa lipid và p-caroten [15] Ngoài ra, cácnghiên cứu in

vivo đã cung cấp những dẫn chứng khoa học về đặc điểm mật ongcó thể kích thích hệthống

bảo vệ chống oxy hóa trong các mô của động vật gặm nhấm (cụ thể làtuyến tụy, máu, thận

và gan) bằng cách tăng cường hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa té bào, chẳng hạn như superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase và glutathione S- transferase, bang cách tăng mức độ giảm glutathione [25] Điều này đã được công bố trong

các nghiên cứu ở chuột mắc bệnh tiểu đường do streptozotocin, dùng mật ong trong bốn tuần đãcải thiện tình trạng stress oxy hóa ở thận dựa trên việc đánh giá sự tăng đáng kể cáchoạt tính chống oxy hóa của CAT, glutathione peroxidase, glutathione reductase và glutathione-S-transferase và phục hoi hoạt tính SOD, cũng như mức độ peroxid hóa lipid [25] Tác dụng chống oxy hóa của mật ong cũng đã được chứng minh ở tuyến tụy và gan

Trên thực tế, việc bổ sung mật ong làm giảm đáng kể mức độ cao của malondialdehyde

(MDA) và phục hồi hoạt tính của SOD và CAT ở tuyến tụy củachuột mắc bệnh tiểu đường

hoặc trong gan của chuột bị vàng da tắc nghẽn, dựa trên đánh giá sự hình thành ROS ở gan

[4] Tácdụng chốngoxy hóa cólợi của mật ongcũng đã được đánh giáỏ các vận động viên,

vì hoạt động thể chất cường độ cao và kéo dài có thể dẫn đến sản sinh quá mức ROS Mức

MDA được xác định trong huyếtthanh ở nhữngngười tình nguyện khỏe mạnh, trải qua một

bài tập ngắn nhưng cường độ cao trên máy đo chu kỳ, đã giảm đáng kể khi họ có sử dụngmật ong (1 g/kg thể trọng hàng ngày trong 1, 2 hoặc 3 tuần) so với nhóm đối chứng [26]

Hon nữa, uống mật ong tự nhiên (70 g), trước mỗi buổi tập, trong tám tuần tập luyện đạpxe,làm giảm đáng kể mức độ gia tăng của ROS và MDA cũng như các chất trung gian gây

viêm, chẳng hạn như interleukin (IL) - Ip, IL- 6, IL-8, yếu tố hoại tử khối u (TNF) -a, trong

tinh dịch của người cho thấy rằng mật ong khoảng 1 g/Kg bw hàng ngày sẽ có hiệu quả trong việc làm giảm các tác động trầm trọng có thể xảy ra của việc tập luyện đạp xe tăng cường đối với quá trình sinh tinh [27], Mặc dù một nghiên cứu thí điểm trên các vận động

viên nữ tham gia vào các môn thể thao khác nhau cho thấy không có sự khác biệt đáng kể

về khả năng chống oxy hóa giữa liều cao mật ong (1,5 g/Kg bw) và liều thấp (0,75 g Kgbw) [1], việc tối ưu liều dùng cho ngườinhư tác nhân chốngoxy hóa cần được thiết lập.Khả năng chống oxy hóa của mật ong được cho rằng phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol [15] Khả năng chống oxy hóa được coi là hiệu quả của polyphenol như là chất chelat kim

loại và là chất thu gom gốc tự do hiệu quả, cũng như chất điều biến gen có thể ảnh hưởng đến các hệ thống enzyme và không enzyme liên quan đến cân bằng oxy hóa khử của tế bào [28]

Mặc dù mật ong có hàm lượng polyphenol thấp,nhưng mộtnghiên cứu liên quan đãbáo cáorằng sau khi tiêu thụ 1,5 g mật ong/Kg bvv ở người trưởng thành khỏe mạnh, tổng hàmlượng phenol trong huyết tưong tăng lên đáng kể tưong tự như khả năng chống oxy hóa trong huyết tưong tăng, phù hợp vói giả thuyết rằng các chat polyphenol là các chất tạo nên

hoạt tính chống oxyhóa trong mật ong [29]

Phưong pháp phân tíchcổ điển trongcác nghiên cứu phân tích mật ong được sửdụng để xác

định đặc tínhcủa mật ong thườnglà các phép phân tích cảm quan và hóa lý

Do những hạn chế của các kỹ thuật phân tích cổ điển, các phương pháp phân tích hiện đạiđáng tin cậy hơn được sử dụng để phân tích và nghiên cứu về thành phần cũng như đặc tính

của mật ong Các nghiên cứu bao gồm đo lường cấu hình carbohydrate (đường) [30], hàmlượng khoáng chất [31], thành phần phenolic và flavonoid [32], các chất mùi [33, 34] và

thành phần acid amin [35] bằng cách sử dụng các công cụ phân tích tiên tiến như kỹ thuật

sắc ký [30], kỹ thuật khối phổ (MS) [36, 37], các kỹ thuật hồng ngoại (IR) và Raman [14],

cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [38], phân tích đồng vị ổn định [39, 40] và các phân tíchkhác nhưđầu dò ion hóa ngọn lửa(FID) [41, 42] Một số tác giả đã nghiên cứu về việc phát hiện các chất tạp nhiễm như đường ngoại sinh hoặc bổ sung siro đường bằng cách đánh giá

carbohydrate với các kỹ thuật phân tích khác nhau [43, 44] Mật ong chủ yếu được tạothànhbởi một hỗn hợp của các saccharide như glucose, fructose, tri- và tetrasaccharidetrong khi các thành phần chỉ hiện diện với số lượng rất tối thiểu [45] Các phân tích về mật ong trước đây đã được nghiên cứu như phân tích cấu hình carbohydrate, gần đây là sắc ký lỏng hiệunăng cao (HPLC) và phân tích hóa học được sử dụng để xác định cấu hình đường của mật ong [46, 47] Nghiên cứu về thành phần dễ bay hơi của mật ong được xác định bằng cách

sử dụng vi chiết pha rắn (SPME) và sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC - MS) [48] Cácnhà nghiên cứu cũng đã tích hợp các kỹ thuậtnày với phân tích hóa học để phân loại nguồn gốc thực vật của mật ong [48, 49], Trong kỹ thuật hóa học, phân tích thành phần chính(PCA) và phân tích phân biệt tuyến tính (LDA) được sử dụng để xác định các biến ảnhhưởng và sự tương đồng trong các mẫu mật ong nghiên cứu [50, 51], Các nghiên cứu gần

đây đã chứng minh việc sử dụng phương pháp tiếp cận di truyền học phân tử trong việc xác

định thành phần vànguồn gốc địa lý của mật ong [52], và côn trùng học nguồn gốc của mật ong [53, 54],

Các thông số hóa lý như pH, hàm lượng đường, proline, hoạt độ enzyme, độ ẩm, hàm lượng

tro, hoạt tính diastase, độ acid tự do và hàm lượng - hydroxymethylfufural (HMF) có thể cung cấp về đặc tính của các loại mật ong Nozal Nalda và cộng sự [46] nhận thấy sự khác biệt đáng kể của các mẫu mật ong trong việc khảo sát đối với 15 thông số hàm lượng khoáng chất (trừ sắt và kẽm) và 8 thông số hàm lượng hóa lý (ngoại trừ sucrose và HMF)

trong nghiên cứu quy mô lớn củahọ trên 73 mật ong của7 nguồn gốc thực vật của linh chi,thạch nam, hương thảo, cỏ xạ hương, honeydew, mật ong hoa oải hương và hoa oải hương của Pháp Mật ong của Serbia, cây keo, hoa hướng dương và cây bồ đề cóthể dựa trên các

biến số như độ dẫn điện (0,10-0,76 mS/cm), độ axit tự do (7,80-42,70 meq/kg) và pH

(3,17-5,85) [55] [57] Silvano và cộng sự[56] đã báo cáo sự khác biệt đáng kể về giá trị

trung bình của HMF, màu sắc, độ dẫn điện và hàm lượng sacarose đối với mật ong đượcthuhoạch từ các vườn khác nhau như các khu nông nghiệp, đồi và đồng cỏ của khu vực phía đông nam của tỉnh Buenos Aires ở Argentina

Các kỹ thuật sắc ký khác nhau được sử dụng xác định cấu hình của đường, acid amin,

phenolic và flavonoid của các mẫu mật ong Puscas và cộng sự [57] đã phát triển một

phương pháp phân tích đơn giản và kinh tế để phát hiện sự tạp nhiễm của một số loại mật ong Romania dựa trên sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) kết hợp với phân tích hình

ảnh Sau đó, phương pháp này được áp dụng để phân tích định lượng hàm lượng glucose,fructose và sucrose từ cácloại mật ong Rumani có bán trên thị trường Cotte và cộng sự[58]

đã phát triển một phương pháp sử dụng LC kết hợp với detector đo metric xung (PAD) đểphát hiện fructose và glucose, và GC kết hợp với detector ion hóa ngọn lửa (FID) để xác

định toàn bộ hồ sơ củadi- và trisaccharid Cotte và cộng sự [59] tuyên bố là người đầu tiên

sử dụng hệ thống HPLC phân tích acid amin và thành công trong việc mô tả đặc tính củamật ong hoa oải hương Hiện nay, các nghiên cứuchủ yếu tập trung vàoviệc xác định dữ

liệu về các phenolic vàflavonoid do tính chất dược lý của chúng Nhiều nghiên cứu đãbáo cáo thành phần phenolic và flavonoid của mật ong bằng cách sử dụng các kỹ thuật sắc kýkhác nhau [8, 16, 60, 61].Pemavà cộngsự[16] đã xác định vàđịnh lượng thành phần

phenolic acid, flavonoid và vitamin c trong 90 loại mật ong ở Ý có nguồn gốc thực vậtkhácnhau (hạt dẻ, sulla,bạch đàn, cam quýt) bằng phân tích HPLC - uv Các kết quả chothấy một sự tương tự nhưng có số lượng khác nhau về hồ sơ phenolic acid của các mật ong được nghiên cứu Zhang và cộng sự [62] mô tả việc định lượng thành phần chín loại

phenolic acid có mặt trong năm mẫu mật ong bằng cách sử dụng HPLC- DAD

Cây cà phê là một loài thực vật thân thụ, chúngtrải qua quá trình thụ phấn chéo với sự can

thiệp của côn trùng Phần lớn các giống cà phê có hoa rất thơm, tạo ra nhiều mật hoa vàphấn hoa để thu hút côn trùng Sự thụ phấn của hoa cà phê nhờ ong có thể làm tăng khả

năng đậu trái so với tự thụ phấn hoặc thụ phấn nhờ gió Cà phê là một trong những đồ uống được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến nhất trên thế giới [63] Ngành công nghiệp cà phê có tầm

quan trọng sống còn ở một số nền kinh tế và đóng vai trò quan trọng trong ba quốc gia sản

xuấtcà phê lớn nhấtthế giới: Brazil, Việt Nam và Indonesia (Tổ chức Nông lươngthuộc Bộ

phận Thống kê Liên hợp quốc, 2015) Tại ViệtNam thì Đắk Lắk được xem là thủ phủ cà

phê Robustacủa Việt Nam Cà phê Buôn MaThuột không chỉ nổi tiếng vì năng suấtcao vàsản lượng lớn trong cảnước mà còn ở chất lượng và hưong vị đặc trưng đã đượcnhìn nhậnbởi các chuyên gia về cà phê Việt Nam và thế giói Cùng với sự phát triển về cà phê, thì

nghề nuôi ong lấy mật hoa cà phê tại Đắk Lẳk đang phát triển rất mạnh theo hưóng nuôi

công nghiệp Và sản phẩm mật ong hoa cà phê tại Đắk Lắk cũng dần phát triển Mật ong

hoa cà phê là loại mật được lấy từ loài ong hút mật của hoa cà phê Mật ong hoa cà phê

thường đượcthu hoạch từ tháng hai đến tháng tư hằng năm là thời điểm núi rừng phủ trắng

như tuyết bởi màu hoa cà phê Mật ong hoacà phê không phải là sản phẩm thông thường;

nó cực kỳ hiếm và đắt, và chứa các yếu tố dinh dưỡng và sinh học

Đối với mật ong hoa cà phê thì vẫn còn khá ít nghiên cứu về đối tượng này như nghiên cứu xác định nguồn gốc thực vật của mật ong cà phê sử dụng cộng hưởng từ hạt nhân proton định lượng đồng thời caffeine, theobromine và trigonelline, cũng như các hợp chấtkhác của Elisabetta Schievano và cộng sự (2015) [63] Cùng với đó là nghiên cứu về đặc điểm của mật ong đon hoa Coffea arabica từ Espirito Santo, Brazil (2015) định lượng hàmlượng caffein và nghiên cứu các đặc điểm hóa lý của mật ong Coffea arabica[64] Vì vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định đặctính về thành phần hóa học của mật ong hoa

cà phê

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu:

Mật ong hoa càphê được lấy từ 7 địa điểm khác nhau trên địa bàn tỉnh Đắk Lắk Bên cạnh

đó, đề tài sử dụng 6 mẫu mật ong để làm mẫu so sánh trongđó có 3 mẫu mật onghoa cà phêđến từ 3 thương hiệu khác nhau đang được lưu hành trênthị trường và 3 mẫu mật ong khác

(mật ongrừng, mật ong hoa cúc quỳ, mật ong hoanhãn) Thông tincác mẫu được trình bày

cụ thể trongbảng 2.1 và bảng 2.2

Hình 2.1 Hình ảnh tại nơi thu mật

2.1.1 Mẩu mật ong hoa cà phê ở Đắk Lắk.

Các mẫu mật ong hoa cà phê được thutại 7 nông hộ nuôi ong trongnhững vườnhoa càphê

có diện tích đủ lớn (4-5 ha) của huyện Cư Kuin, Cư M'gar và thành phố Buôn Mê Thuột

thuộc địa phận tỉnh Đắk Lắk.Tiêu chí lựa chọn địa điểm lấy mật ong là dựa vào diệntích

vườn cà phê đượcnuôi ong phải rộng từ 4 ha trở lênvà có thời gian quay mật trong khoảng

từ ngày 1-10 tháng 3 năm 2021.Thời gian thu nhận mẫu nghiên cứu là ngày 5-10 tháng 3

năm 2021, thời gian này được xem là giữamùa hoa cà phê để đảm bảo mật được ong lấymật có trên 80% làtừ mật hoa cà phê

Cách thức bảo quản: nhận mẫumật ong (2 lít) từ nông hộ vàvận chuyển bằng thùng xốp về trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Tại phòng thí nghiệm mẫu sẽ được

chiêt sang hủthủy tinh nhỏ 100 ml, bao băng giây bạc, bảo quản ở nhiệt độ phòng đên kill

tiên hành phân tích

Bảng 2.1 Thông tin vê vị trí và tọa độ thumẫu mật ong hoa cà phê ở ĐăkLăk

EaKao, Thànhphô Buôn

Ma Thuột, ĐẳkLak 12°34'46.5"N 108°0339.8"E

EaKao, Thànhphô Buôn

Ma Thuột, ĐẳkLak 12°34'47.1"N 108°05'01.5"E

6 CoffeeHM 1 Quảng Phú,Cư M'gar,

Hình 2.3 Vị trí trên bản đồ của các điểm thu mật ong hoa cà phê Đăk Lăk.

Bảng2.2 Mau mật ong so sánh

Commercial H Công ty Cổ PhầnOng Mật Tiền Giang Siêuthi E-Mart

Commercial K Công ty TNHHQuốc tế DKH Siêu thi E-Mart

CommercialT Công ty TNHH Mật ong TracyBee Siêu thi E-Mart

Hình 2.5 Mầu mật ong thưong mại

Chuẩn phenolic aicd (gallic acid, cinnamic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, coumaric

acid, ferulic acid, 2,4-dihydroxybenzoic acid), quercetin, caffein, trigonelline, glucose,

2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) vàthuốc thử Folin-Ciocalteu đã được muatừ Sigma-Aldrich (Mỹ) Các hóa chất

được sử dụng đễ phân tích hóa lý được mua từ Merck (Darm-stadt, Đức) Tất cả các hóachấtđược sử dụng làhóa chất phân tích

Bảng 2 3 Thiết bị phân tích

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Bộ chiết SPE 12-PortVisiprep™ VacuumSPE Manifolds Mỹ

Máy đo pH cầm tay Smartsensor AS218 (0,00-14,00pH; ±0,05) Trung Quốc

2.3.1.1 Xác định đường tổng bằng phenol - sulfuric theo Michel Dubois Và Cs (1956) [65]

Đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol - sulfuric Glucose được sử dụng để

xây dựng đườngchuẩn với thangnồng độ 0; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100 ppm

Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Chuẩn glucose stock 1000 ppm được pha bằng cách cách cân 0,1 g chuẩn glucose vào cốc

thủy tinh, thêm 20 ml nước cất 2 lần và lắc đều đến khi glucose tan hoàn toàn Sau đóchuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần

Thiết lập dãy nồng độ: 0; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100 ppm từ dung dịch chuẩn 1000 ppm Quátrình thực hiện được mô tả cụ thể trong bảng 2.4

Bảng 2.4 Thiết lập thang nồng độ glucose 0-100 ppm

Đường chuẩn glucose được xây dựng với nồng độ 0 - 100 ppm Lần lượt hút 1 ml dung dịch

glucose có nồng độ 0; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100 ppm đã pha san vào ống nghiệm cónắp Sau

đó, thêm 1 ml phenol 5 % và lắc đều hỗn dịch, tiếp đó thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc rồi lắc

đều Sau khi để phản ứng 10 phút ỏnhiệt độ phòng, tiếptục làm nguội dung dịch trong bể ủ

nhiệt ở 25 °C trong 10 phútrồi đo quang ởbước sóng 490 nm Quá trình thực hiện được mô

|im Lay 1 ml dịch lọc tiến hành định mức 100 ml bằng nước cắt 2 lần được dung dịch B.

Tiếp đó hút 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm rồi thêm 1 ml phenol 5 % và thứ tự như với glucose Tiếnhành đo quang ởbước sóng490 nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, thực

hiện tương tự đối với tắt cả các mẫu

Bảng 2.6 Phân tíchhàm lượng đường tồng trong mật ong

Tiến hành đo quang ở 490 nm

Đường tồng trong mật ongđược xác định thông quaphương trìnhđường chuẩncủa glucose

theo công thức sau:

Trong đó: T là hàm lượng đường tổng (%); cx: Nồng độ đường tồng từ đường chuẩn (ppm);

m: Khối lượng mẫu cân (g); Vđmi:Thể tích địnhmức lần 1 (ml); Vđnứ: Thể tích định mức lằn

2 (ml); 1 oổ: Quyđồi nồng độppm sang g/ml, Vxđ: Thể tích mẫu phân tích(ml)

2.3.1.2 Tổng đường khử bằng phương pháp DNS

Đường khử tự do có trong mật ong được xác định bằng phương pháp bằng phương pháp DNS Glucose được sử dụng để xây dựng đường chuẩn với thang nồng độ 0; 1; 2,5; 5; 10;

25; 50, 100 ppm

Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc glucose 1000 ppm và thang nồng độ 0 - 100 ppm được xây dựng tương tự bảng 2.4 ở mục 2.3.1.1 Đường chuẩn glucose để xác định hàm lượng đường khử

tự do trong mậtong đượcmôtả trong bảng 2.7

Bảng 2.7 Xây dựng đường chuân glucose 0-100 ppm

Cân 0,5 g mật ong vào cốcthủy tinh, thêm 20 ml nước cất2 lần vàlắc đều đến khi mật ong

tan hoàn toàn Sau đó chuyển dung dịch vào bình định mức 50 ml và định mức tói vạchbằng nước cất2 lần được dung dịch A Tiếp đó lọc dung dịch A quagiấy lọc 11 Jim và pha loãng mẫu bằng cách hút 1 ml dịch lọc sau đó định mức 25 ml (dung dịch B) Các bước tiếp

theo tiến hành như bảng 2.8 Thí nghiệm đượclặplại 3 lần

Bảng 2.8 Phân tích hàm lượng đường khửtự do trong mật ong.

Tiến hành đo quang ở 5*4Onm

Hàm lượng đường khử của mật ong xác định thông qua phương trinh đường chuẳn củaglucosetheo công thức sau:

glu(%) = c ^ml^đm2^đO-100

10*.^.^.™

(2-2)

Trong đó: cx: Nồng độ từ đường chuẩn (ppm); Vđmi: Thể tích định mức lần 1 (ml); Vđnứ:

Thể tíchđịnh mức lần 2 (ml); Viút: Thể tích mẫu hút định mức lần 2; 10ổ: Quy đổi nồng độ

(ppm) sang (g/ml); Vxđ: Thể tích mẫu phân tích (ml); Vđc.: Thể tích mẫu đem đi đo quang;

m: Khối lượngmẫu (g)

2.3 ỉ 3 Hàm lượng hỹdraxymeỉylfuĩfural [66]

ml Thêm 0,50 ml dung dịch Carrez I, cho tiếp 0,50 ml dung dịch Carrez II, sau định mức bang nước cất đến vạch Lọc qua giấy lọc Dùng pipet cho vào hai ong nghiệm mỗi ong 5 ml dịch lọc Thêm 5ml nước vào ong nghiệm thứ nhất (dung dịch thử nghiệm) và 5ml dung dịch NaHSO3 vào ong còn lại (dung dịch đoi chúng) Lắc đều dung dịch và xác định hệ so hap thụ A của dung dịch thử nghiệm và dung dịch đoi chứng đo ở bước sóng 28*4 nm và 336 nm Neu A > 0,6, thì pha loãng

chỉnh A theo độ pha loãng.

Hàm lượng hydroxymetylfurfural (HlvíB), X, được biếu thị bang mi li g am trên 100 g mật ong, tính bang công thức sau đây:

v (>>284 - 4336).14,97.rđo (2-3)

A —

m

Trong đó: A284: Hệ sổ hấp thụ đo được ở bước sóng 284 nm; A33 ố : Hệ số hấp thụ đo được ở

bước sóng 33Ố nm; m: Khối lượng mẫu (g);Vđo: Thểtích mẫu đo

2.3.1.4 Hàm lượng acid tự do[66].

Cân 10 gmật ong cho vào cốcthủy tinh 250 ml, thêm 75 ml nước cất, khuấy đều dung dịch

bằng máy khuấy từ đến khi dung dịch tan hoàn toàn Sau đó nhúng điện cực pH vào dung

dịch và tiến hành chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến pH = 8,30, ghi nhận thề tích NaOH tiêu tổn

Trong đó: VNaOH: thề tích NaOH dùngđể chuẩn độ (ml); m: Khối lượng mẫu cân (g)

2.3.1.5 Xác định hàm lượng khoáng theo M s Finola và cộng sự (2007) [67].

Cân Ig mẫu mật ong cho vào chén nung, nung ở 550°C trong 6h Sau đó cân lại khôi lượng.

m2

%khoảng = —- X 100%

Trong đó: mi là khôi lượng mẫu ban đâu; m2 là khôi lượng mẫu sau nung.

2.3.2 Phân tích thành phần polyphenol và alkaloid của mật ong hoa cà phê Đăk Lak

2.3.2.1 Xác định tổ ng p oly ph eno l the o Fo Hin a nd Cioc alte u [68]

Tồng hàm polyphenol có trong mật ong được xác định theo phưong pháp Follin and

Ciocalteu Gallic acid được sử dụng để xây dựng đường chuẩn với thang nồng độ: 0; 0,01;0,03; 0,05; 0,07; 0,09 mg/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Chuẩn gốc gallic acid được chuẩn bị bằng cách cân 0,01ggallic acidbằng giấy cân, sau dó

chuyền toàn bộ chất rắn vào bình (Ịnh mức 10 mlvà (finh mứcbằng ethanol tói vạch Thang

nồng độtừ 0 - 0,09 mg/ml được thiết lập theo bảng2.9

Bảng 2.9 Thiết lập thang nồng độ 0 - 0,09 mg/ml

Các bước xây dựng đường chuân gallic acid được tiên hành như bảng 2.10

Bảng 2.11 Phân tích hàm lượng polyphenol trong mật ong