Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây lá lốt (piper sarmentosum roxb ) ở vùng thọ xuân, tỉnh thanh hóa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, chưa cơng bố có nguồn gốc rõ ràng trích dẫn đầy đủ theo quy định Thanh Hóa, ngày 01 tháng năm 2020 Tác giả Phạm Văn Vĩnh i LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Quang Huy ĐHKH Tự nhiên ĐHQG Hà Nội người trực tiếp hướng dẫn tôi, tạo điều kiện giúp đỡ cho lời khuyên qúy báu để tơi hồn thành đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, thuộc Bộ mơn Hóa họcTrường Đại học Hồng Đức tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian làm thí nghiệm hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ đo phổ mẫu chất sau thí nghiệm thực đề tài nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè tơi - người ln động viên, khích lệ tơi sống học tập để tơi hồn thành tốt đề tài nghiên cứu này./ Thanh Hóa, ngày tháng năm 2020 Tác giả Phạm Văn Vĩnh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tƣợng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Nghiên cứu thực vật họ Hồ tiêu (Piperaceae) 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Ở Việt Nam 1.2 Giá trị sử dụng loài họ Hồ tiêu (Piperaceae) 1.3 Tinh dầu 1.3.1 Khái niệm chung tinh dầu 1.3.2 Khái niệm tinh dầu 1.4 Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu họ Hồ tiêu (Piperaceae) 11 1.4.1 Trên giới 11 1.4.2 Ở Việt Nam 16 1.5 Cây lốt 17 1.5.1 Đặc điểm thực vật 17 1.5.2 Thành phần hoá học 18 1.5.3 Sử dụng 18 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu tinh dầu 21 2.1.1 Thu mẫu chƣng cất tinh dầu 21 2.1.2 Phƣơng pháp định lƣợng tinh dầu 21 iii 2.1.3 Phƣơng pháp phân tích thành phần hố học tinh dầu 21 2.2 Phƣơng pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất 22 2.2.1 Phƣơng pháp thu hồi dung môi 25 2.2.2 Tách chất từ cao thu đƣợc 25 2.2.3 Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 26 2.3 Phƣơng pháp xử lí số liệu 27 2.4 Hóa chất thiết bị 28 2.4.1 Hoá chất 28 2.4.2 Thiết bị 28 2.5 Nghiên cứu hợp chất từ phần mặt đất lốt (Piper sarmentosum Roxb.) 28 2.5.1 Phân lập hợp chất 28 2.5.2 Các kiện vật lý chất tách đƣợc 30 2.6 Thử hoạt tính kháng khuẩn chất tách đƣợc 31 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết nghiên cứu tinh dầu 34 3.1.1 Định lƣợng tinh dầu 34 3.1.2 Phân tích thành phần hố học tinh dầu lốt 34 Phần mặt đất lốt đƣợc thu hái Thọ Xuân Thanh Hóa vào tháng năm 2019 Hàm lƣợng tinh dầu đạt 0,038% so với trọng lƣợng tƣơi, tinh dầu có màu trắng, nhẹ nƣớc 34 3.2 Kết phân lập hợp chất từ lốt 36 3.2.1 Cấu trúc hợp chất HV1 37 3.2.2 Cấu trúc hợp chất HV2 50 3.2.3 Hợp chất HV3 54 3.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn chất tách đƣợc 62 3.3.1 Phƣơng pháp phân tích 62 3.3.2 Kết 63 iv KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu từ phần mặt đất Lá lốt Thọ Xuân Thanh Hóa 35 B¶ng 3.2: Sè liƯu phỉ 13C-NMR cđa hỵp chÊt HV1 40 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR hợp chất HV2 51 Bảng 3.4 Số liệu phổ 13C- NMR hợp chất HV3 54 vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Piper sarmentosum Roxb 18 Hình 1.2 Piper sarmentosum Roxb 18 Sơ đồ 2.1: Chiết phân đoạn lốt 29 Sơ đồ 2.2: Tách hợp chất từ cao etylaxetat lốt 30 H×nh 3.1: Phỉ UVcđa hỵp chÊt HV1 37 Hình 3.2: Phổ khối l-ợng phun mï electron (ESI-MS) positive 38 H×nh 3.3: Phỉ 1H-NMR cđa hỵp chÊt HV1 38 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR hợp chÊt HV1 (phæ gi·n) 39 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR hợp chất HV1 (phổ giÃn) 39 H×nh 3.6: Phỉ 13C-NMR cđa hỵp chÊt HV1 41 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR hợp chất HV1 (phổ gi·n) 41 H×nh 3.8: Phỉ 13C-NMR cđa hỵp chÊt HV1 (phỉ gi·n) 42 Hình 3.9 : Phổ DEPT hợp chÊt HV1 42 Hình 3.10: Phổ DEPT hợp chất HV1 (phổ gi·n) 43 H×nh 3.11: Phỉ HMBC cđa hỵp chÊt HV1 44 Hình 3.12: Phổ HMBC hợp chÊt HV1 (phỉ gi·n) 45 H×nh 3.13: Phỉ HMBC cđa hỵp chÊt HV1 (phỉ gi·n) 46 H×nh 3.14 : Phỉ HMBC cđa hỵp chÊt HV1 (phỉ gi·n) 47 Hình 3.15: Phổ HMBC hợp chất HV1 (phổ gi·n) 48 H×nh 3.16 : Phỉ HSQC cđa hỵp chÊt HV1 49 Hình 3.17: Phổ khối lƣợng va chạm (EI-MS) hợp chất HV2 52 Hình 3.18: Phổ 1H-NMR hợp chất HV2 52 Hình 3.19: Phổ 13C-NMR hợp chất HV2 53 Hình 3.20: Phổ DEPT hợp chất HV2 (phổ giãn) 53 Hình 3.21 Phổ MS hợp chất HV3 55 Hình 3.22 Phổ 1H-NMR hợp chất 56 Hình 3.23 Phổ 1H-NMR hợp chất LT3 (phổ giãn) 56 Hình 3.24 Phổ 1H-NMR hợp chất HV3 (phổ giãn) 57 vii Hình 3.25 Phổ 1H-NMR hợp chất HV3(phổ giãn) 57 Hình 3.26 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 58 Hình 3.27 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 58 Hình 3.28 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 59 Hình 3.29 Phổ DEPT hợp chất HV3 59 Hình 3.30 Phổ HMBC hợp chất HV3 60 Hình 3.31 Phổ HSQC hợp chất HV3 61 Hình 3.32 Phổ COSY hợp chất HV3 62 viii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nƣớc ta có diện tích khoảng 330.000 km2, nằm trung tâm Đông Nam châu Á trải dài 15 vĩ độ (1650 km), có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình hàng năm cao (trên 22oC), lƣợng mƣa hàng năm lớn (trung bình 1200 - 2800 mm), độ ẩm tƣơng đối cao (trên 80%) Tác dụng chữa bệnh cỏ hợp chất tự nhiên có chứa chúng định Nói đến nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú đất nƣớc ta nói đến khả sinh tổng hợp, chuyển hố tích luỹ hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nguồn gen thực vật Trong hệ thực vật Việt Nam, nhóm có tinh dầu phong phú đa dạng Đến thống kê đƣợc khoảng 657 loài thuộc 357 chi 114 họ (chiếm khoảng 6,3% tổng số loài; 15,8% tổng số chi 37,8% số họ) Họ Hồ tiêu (Piperaceae) có chi, 50 lồi (chi Lepianthes – Lân hoa có 01 lồi: Lepianthes umbellatum; chi Peperomia – Càng cua có 06 lồi; chi Piper – Hồ tiêu có 42 lồi; chi Zippelia có 01 lồi) Tập trung chủ yếu vùng nhiệt đới, đặc biệt vùng Đông Nam Á nhiệt đới châu Mỹ Xu hƣớng nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu khơng sinh học mà cịn hợp chất hóa học có họ để ứng dụng y dƣợc học Kinh nghiệm dân gian cho thấy có nhiều lồi họ Hồ tiêu (Piperaceae) đƣợc đồng bào dân tộc sử dụng phận khác để làm thuốc, làm rau ăn, Do vậy, nghiên cứu họ Hồ tiêu (Piperaceae) để có sở khoa học nhằm khai thác sử dụng bền vững nguồn tài nguyên thực vật mối quan tâm lớn nhân loại Trong số nhóm tài ngun thực vật nhóm chứa tinh dầu chiếm vị trí quan trọng Đây nguồn nguyên liệu thiết yếu cho nhiều ngành công nghiệp nhƣ mỹ phẩm, thực phẩm dƣợc phẩm Hiện nay, hầu hết lồi họ Hồ tiêu (Piperaceae) có khả sinh tổng hợp tích luỹ hợp chất tự nhiên, đặc biệt tinh dầu Cây lốt (Piper sarmentosum Roxb.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) gọi tất bát Green clothing (Piper lolot C.DC.), Thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae) Ở Việt Nam, lốt mọc tự nhiên khắp nơi, từ vùng đồng đến trung du, đặc biệt tỉnh vùng núi thấp Lá lốt gia vị thuốc, dùng để chữa đau xƣơng, thấp khớp, tê thấp, đổ mồ hôi tay chân Nhằm nghiên cứu thêm lốt để khai thác hết tiềm loài này, tơi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dịch chiết từ lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa” Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu luận văn lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa, có triển vọng cung cấp chất có hoạt tính sinh học phong phú hấp dẫn Nhiệm vụ nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu luận văn bao gồm: - Chƣng cất lôi nƣớc chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp hợp chất từ phần mặt đất lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xn, tỉnh Thanh Hóa - Xác định thành phần hố học tinh dầu từ lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa - Phân lập xác định cấu trúc số hợp chất từ lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xn, tỉnh Thanh Hóa - Thử hoạt tính sinh học số chất phân lập đƣợc lốt (Piper sarmentosum Roxb.) vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa Từ liệu phổ phân tích HV3 so sánh với tài liệu [39] chất HV3 2-apigenin 7-O-β-neohesperidosit Hợp chất đƣợc phân lập từ (Lupinus luteus) [37] 3' 2' 6'' HO 5'' O '' OH 3'' O '' OH OH 4''' 2'' 5''' 1' O OH 5' 6' 10 OH O O 1''' 6''' 3''' 4' 2''' OH OH Cấu trúc 2-Apigenin 7-O-β-neohesperidosit Hình 3.21 Phổ MS hợp chất HV3 55 Hình 3.22 Phổ 1H-NMR hợp chất HV3 Hình 3.23 Phổ 1H-NMR hợp chất LT3 (phổ giãn) 56 Hình 3.24 Phổ 1H-NMR hợp chất HV3 (phổ giãn) Hình 3.25 Phổ 1H-NMR hợp chất HV3 (phổ giãn) 57 Hình 3.26 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 Hình 3.27 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 58 Hình 3.28 Phổ 13C-NMR hợp chất HV3 Hình 3.29 Phổ DEPT hợp chất HV3 59 Hình 3.30 Phổ HMBC hợp chất HV3 60 Hình 3.31 Phổ HSQC hợp chất HV3 61 Hình 3.32 Phổ COSY hợp chất HV3 3.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn chất tách đƣợc 3.3.1 Phương pháp phân tích Hoạt tính kháng Vi sinh vật kiểm định đƣợc tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu chiết đƣợc thực phiến vi lƣợng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phƣơng pháp đại Vander Bergher vàVlietlinck (1991) McKane, L & Kandel (1996) theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standard Institute; CLSI, 2010 62 Các chủng vi sinh vật kiểm định: -Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922 ) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923 ) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212 ) Staphylococcus aureus (ATCC12222) - Nấm sợi: Aspergillus niger (439) Fusarium oxysporum (M42) - Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754) Saccharomyces cerevisiae (SH 20) 3.3.2 Kết Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn với chủng vi sinh vật kiểm định 03 chất tách đƣợc HV1, HV2 HV3, cho kết nhƣ sau: có 02 chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng vi khuẩn : Mẫu HV1 (Taraxerol ) biểu hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus nấm mốc F oxysporum với giá trị MIC tƣơng ứng 50 g/ml Mẫu HV3 vi sinh vật kiểm định biểu hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus nấm mốc F oxysporum với giá trị MIC tƣơng ứng 25 50 g/ml - Mẫu cịn lại khơng biểu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 63 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hóa học lốt Thọ Xn, Thanh hóa chúng tơi thu đƣợc số kết sau : + Đã tổng quan đầy đủ, có hệ thống tài liệu liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu Loài hồ tiêu lốt, phƣơng pháp nghiên cứu tinh dầu, phân lập, xác định cấu trúc thử vi sinh vật kiểm định + Bằng phƣơng pháp cất nƣớc phƣơng pháp GC-MS xác định đƣợc : Hàm lƣợng tinh dầu đạt 0,038% so với trọng lƣợng tƣơi, tinh dầu có màu trắng, nhẹ nƣớc với thành phần hóa học hợp chất thơm : benzyl benzoat (41,1%), benzyl alcohol (12,9%), 2-hydroxy-benzoic acid phenylmethyl ester (10,15 %) 2-butenyl-benzen (7,9%) thành phần + Bằng phƣơng pháp ngâm chiết với dung mơi thích hợp chọn lọc thu đƣợc cao tƣơng ứng n-hexan , etylaxetat cao butanol dịch nƣớc lập từ 436 gam cao etylaxetat phƣơng pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel, dung môi giải hấp kết tinh phân đoạn thu đƣợc 03 chất HV1, HV2 HV3, với khối lƣợng tƣơng ứng là: Chất HV1 104mg chiếm 0,012% so với trọng lƣợng tƣơi , chất HV2 123 mg chiếm 0,015 % so với trọng lƣợng tƣơi hợp chất HV3 118mg chiếm 0,014 % so với trọng lƣợng tƣơi + Đã tiến hành đo phổ phối hợp phổ đại : EI-MS, UV, IR, 1HNMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC DEPT xác định đƣợc tên cấu trúc hợp chất tách đƣợc lần lƣợt :HV1 Taraxerol; HV2 sitosterol HV3 2- apigenin 7-O-β-neohesperidosit Cấu trúc tƣơng ứng chúng là: 64 3' HO 5'' 29 28 21 18 13 HO Taraxerol OH 4''' 14 10 25 26 16 3'' 3''' 7 '' 5''' 1' O 4' OH 5' 6' 10 OH O O 1''' 6''' 15 O 2'' OH 24 17 19 O OH 27 23 12 11 '' 22 20 2' 6'' 2''' OH OH -sitosterol - Apigenin 7-O-β-neohesperidosit + Đã thử hoạt tính kháng khuẩn với chủng vi sinh vật kiểm định 03 chất tách đƣợc HV1, HV2 HV3, cho kết nhƣ sau: có 02 chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với chủng vi khuẩn : Mẫu HV1 (Taraxerol ) biểu hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus nấm mốc F oxysporum với giá trị MIC tƣơng ứng 50 g/ml Mẫu HV3với vi sinh vật kiểm định biểu hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus nấm mốc F oxysporum với giá trị MIC tƣơng ứng 25 50 g/ml - Mẫu cịn lại khơng biểu hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất bn Nụng nghip, H Ni [2] Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y häc, Hµ Néi (1999) [3] Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987), Địa lý họ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [5] Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội [6] Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng hoá học, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội [7] Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng hoá học, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội [8] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Hùng Việt (1985), Các phương pháp sắc ký, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [9] Đỗ Đình Rãng, Nguyễn Thúy Hằng (2015), Nghiên cứu thành phần hóa học Tất bạt (Piper longum Linn), Hội nghị khoa học Hóa hữu lần thứ 3, tr 413-416 [10] Lƣu Đàm Ngọc Anh, Bùi Văn Hƣớng, Trần Thị Phƣơng Anh (2016), Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu lồi Tiêu thƣợng mộc (Piper arboricola C DC.), Báo cáo Khoa học, Hội nghị Toàn quốc lần thứ 2, Hệ thống Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, 3/2016, tr 318-321 [11] Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, (2000), Tên rừng Việt Nam Nxb Nông nghiệp, Hà Nội [12] Lê Trần Chấn, Trần Tý, Nguyễn Hữu Tứ, Huỳnh Nhung, Đào Thị Phƣợng, Trần Thúy Vân (1999), Một số đặc điểm hệ thực vật Việt Nam, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 66 [13] Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Tập 1-2, Nxb Y học, Hà Nội [14] Đỗ Ngọc Đài, Lê Thị Hƣơng (2010), Đa dạng thực vật bậc cao có mạch khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Thanh Hóa, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3A): tr 929-935 [15] Nguyễn Kim Đào (2003), Họ Piperaceae Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập 2, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 115-122 [16] Phạm Hoàng Hộ (1972), Cây cỏ Miền Nam Việt Nam, Nxb Sài Gịn [17] Đậu Bá Thìn, Đỗ Ngọc Đài, Phạm Hồng Ban (2016), Đa dạng hệ thực vật bậc khu Bảo tồn Thiên nhiên Pù Lng, Thanh Hóa, Nxb Nơng Nghiệp, Hà Nội [18] Lã Đình Mỡi, Lƣu Đàm Cƣ, Trần Minh Hợi, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, Trần Huy Thái Ninh Khắc Bản (2001), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam, Tập 1, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Tiếng Anh [19] Dyer L.A., J Richards & C.D Dodson (2004), Isolation, synthesis, and evolutionary ecology of Piper amides pp 117-139 in Piper: A model genus for studies of evolution, chemical ecology, and trophic interactions Edited by L.A Dyer & A.N Palmer Kluwer Academic Publishers, Boston [20] Maia J.G.S., Silva M.L., Luz A.I.R., Zoghbi M.G.B and Ramos L.S (1987), Espécies de Piper da Amazơnia ricas em safrol, Qmica Nova, 10: 2000-2004 [21] Quijano M.A., R Posada-Callejas and D.R Miranda-Esquivel (2006), Areas of endemism and distribution patterns for neotropical Piper species (Piperaceae), Journal of Biogeography, 33, pp 1266-1278 [22] Burger, W.C (1977), The Piperales and the Monocots-alternate hypothesis for the origin of Monocotyledonous flowers, Botany Review, 43: 345 [23] De Candolle (1842-1873), Piperaceae In: Prodromus Systematics naturalis Regnivegetabilis by A de Candolle, Parisiis, 16: 235 67 [24] Lawrence G H.M (1967), Taxonomy of Vascularplants Oxford and IBH Publishing Co New Delhi pp 444-445 [25] Newman M., S Ketphanh, B Svengsuksa, P Thomas, K Sengdala, V Lamxay, K Armstrong (2007), Checklist of the vascular plants of Lao PDR, Royal Botanic Garden Edinburgh, Scotland, UK, pp 361-366 [26] Dung N X., T D Thang (2005), Terpenoids and Applications Hanoi National University Publisher, pp 475 [27] Adams R P (2001), Identification of essential oil components by Gas Chromatography/Quadrupole mass spectrometry, Allured Publishing Corp Carol Stream, IL [28] Miriam P., Alexandre F Costa, Humberto R Bizzo, Micheline CarvalhoSilva, Roberto F Vieira (2006), Essential oil of Piper xylosteoides (Kunth) Steud from Federal District, Brazil, Journal of Essential Oil Research, 18:pp 523-524 [29] Andrade E H A., E F Guimarães, M H L Silva, R A Pereira, C N Bastos, J G S Maia (2006), Essential oil composition of Piper cyrtopodon (Miq.) C DC., Journal of Essential oil Bearing Plants, 9(1): pp 53 - 59 [30] C Y Li , W J Tsai , A G Damu, E J Lee, T S Wu, N X Dung, T D Thang, L Thanh J Agric Food Chem 55 (23) pp 9436-9442 (2007) [31] Nascimento JC, David JM, Barbosa LC, de Paula VF, Demuner AJ, David JP, Conserva LM, Ferreira JC, Guimaraes EF (2013), Larvicidal activities and chemical composition of essential oils from Piper klotzschianum (Kunth) C DC (Piperaceae), Pest Manag Science, 69(11): pp 1267-1271 [32] Salleh W M., Ahmad F., Yen K H., Sirat H M (2012), Chemical compositions, antioxidant and antimicrobial activity of the essential oils of Piper officinarum (Piperaceae), Natural Product Communication, 7(12):pp 1659-1662 [33] Salleh W M., Ahmad F., Yen K H., Sirat H M (2011), Chemical compositions, antioxidant and antimicrobial activities of essential oils of 68 Pipercaninum Blume, Int J Mol Sci., 12(11):pp 7720-7731 [34] Varughese T., Unnikrishnan P.K., M Deepak, I Balachandran, A.B Rema Shree (2016), Chemical composition of the essential oils from stem, root, fruit and leaf of Piper longum Linn, Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 21: pp 52-58 [35] Sakurai N., Yaguchi Y., and Inoue T (1987), Triterpenoids from Myrica rubra, Phytochemistry, 26(1), pp 217-219 (HV1) [36] Matsunaga S., Tanaka R., and Akagi M (1988), Triterpenoids from Euphorbia maculate, Phytochemistry, 27(2) pp 535-537 (HV1) [37] Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC (2005), (HV1) [38] Kuo H Y., Yeh M H (1997), Chemical constituents of heartwood of Bauhinia purpurea, J Chin Chem Soc., 44, pp 379-383 (HV2) [39] Martins A.P., Salguerio L.R., Goncalves M.J., Vila R., Tomi F., (2000) Antimicrobial activity and chemiscal composition of the back oil of Croton stelluifea, an endeamic species from S tome & Principe Planta Med., 66(7), pp 647-650 (HV3) 69