Bước đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ nấm linh chi ( ganodesma lucidum karst )đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người

Tr-ờng Đại học Vinh Khoa sinh học === === Lê Đình Việt B-ớc đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cña cao chiÕt tõ nÊm Linh chi (Ganodesma lucidum Karst.) ®èi víi mét sè vi khn g©y bƯnh ë ng-êi Khãa luËn tèt nghiÖp Vinh - 2008 - - Mục lục Đặt vấn đề Ch-ơng Tổng quan tài liệu 1.1 Khái quát bệnh nhiễm khuẩn th-ờng gặp ng-êi 1.1.1 Thùc tr¹ng vỊ bƯnh nhiÔm khuÈn ë ng-êi 1.1.2 Hiện t-ợng kháng kháng sinh số vi khn g©y bƯnh 1.2 Mét sè vi khuẩn gây bệnh th-ờng gặp ng-ời 10 1.2.1 Tụ cầu vàng (Staphilococcus aureus) 10 1.2.2 Klebsiella terrigena 11 1.2.3 PhÕ cÇu khuÈn (Streptococcus pneumoniae) 11 1.2.4 Trùc khuÈn Gram ©m (Escherichia coli) 12 1.2.5 Trùc khuÈn mñ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 12 1.3 ChÊt kh¸ng khuÈn thùc vËt 13 1.3.1 L-ợc sử nghiên cứu øng dơng c¸c chÊt kh¸ng khn thùc vËt 13 1.3.2 -u điểm bật kháng khuẩn thực vật 14 1.3.3 Các nhóm hợp chÊt kh¸ng khuÈn thùc vËt 15 1.4 NÊm Linh chi 18 1.4.1 Đặc ®iĨm sinh häc cđa nÊm Linh chi 18 1.4.2 Khả ứng dụng nấm Linh chi y häc 21 Ch-ơng Ph-ơng pháp nghiên cứu 23 2.1 Đối t-ợng nghiên cøu 23 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Ph-ơng pháp phân lập định loại 23 2.3.2 Ph-ơng pháp bảo quản giống vi khuẩn 23 2.3.3 Ph-ơng pháp chiết lo¹i cao tõ nÊm Linh chi 25 2.3.4 Ph-ơng pháp chiết xuất xác định sè ho¹t chÊt nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum) 26 2.3.5 Kü thuật thử hoạt tính kháng khuẩn 26 2.3.6 Ph-ơng pháp thu thập xư lý sè liƯu 30 Ch-ơng Kết nghiên cứu thảo luận 31 3.1 HiÖu suÊt chiÕt nÊm Linh chi 31 3.2 Kết phân tích thành phần hoá học nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 31 3.3 Kết nghiên cứu tính kháng khuẩn cao chiết nấm Linh chi đến chủng vi khuẩn nghiªn cøu 33 3.3.1 Cao chiết với dung môi n-ớc (cao chiết n-íc) 33 3.3.2 Cao chiÕt víi dung môi cồn etyli 75% (cao chiết cồn) 34 3.3.3 Cao chiết với dung môi metanol (cao chiÕt metanol) 35 3.3.4 Cao chiÕt với dung môi cloroform (CHCl3) (cao chiết cloroform) 37 3.4 Một số đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 38 3.4.1 ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 38 3.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao qua độ pha loÃng tối thiểu g©y øc chÕ 41 3.4.3 So sánh hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết tỉ lệ (3:1) 42 Kết luận đề nghị 45 Tµi liƯu tham kh¶o 47 PhÇn Phơ lơc 49 Đặt vấn đề Việt Nam chịu ảnh h-ởng sâu sắc khí hậu nhiệt đới, gió mùa, độ ẩm cao 80% Đây điều kiện thuận lợi cho loại vi khuẩn gây bệnh phát triển Mặt khác, việc sử dụng thuốc kháng sinh tuỳ tiện nhận thức ch-a đầy đủ ng-ời dân cách sử dụng thuốc nh- hiĨu biÕt vỊ bƯnh nhiƠm khn ®· dÉn ®Õn mét thực tế thuốc kháng sinh tổng hợp bị giảm hiệu lực dần tác dụng chủng vi khuẩn gây bệnh Trên giới, có xu h-ớng nghiên cứu, sử dụng hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật, có tính kháng khuẩn mạnh đặc biệt có độ an toàn cao (độ độc hay tác dụng phụ) sử dụng để thay cho loại kháng sinh thông dụng bị đề kháng N-ớc ta l¹i cã mét hƯ thùc vËt hÕt søc phong phó chủng loại thành phần loài Trong thực vật đ-ợc sử dụng làm thuốc chiếm tỉ lệ không nhỏ Đặc biệt nhiều có tác dụng diệt khuẩn mạnh điều trị đ-ợc bệnh vi khuẩn gây hiệu Nấm Linh Chi đỏ (Ganoderma lucidum) vị thuốc nh- Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) thuộc họ nấm gỗ (Ganodermatace) Còn có tên gọi khác nh- Linh chi thảo, Nấm Tr-ờng Thọ, Nấm Lim, Thuốc thần tiênNấm Linh chi đà đ-ợc biết đến sử dụng từ lâu nhiều n-ớc giới, đặc biệt Châu Tại Việt Nam, thành phần loài nấm Linh chi đa dạng Tuy nhiên có nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum đà đ-ợc nhân dân trồng rộng rÃi sử dơng phỉ biÕn NÊm Linh chi ®á Ganoderma lucidum đà đ-ợc thầy thuốc đông y cổ nh- y học đại công nhận chứng minh nhiều công dụng khả chữa bệnh quí báu nh-, chống dị ứng, kháng viêm, chống ung bứu, làm giảm huyêt áp, trợ tim, làm giảm cholesterol, làm dẻo thành động mạch Tuy tác dụng nấm Linh chi nhiều điều ch-a đ-ợc khám phá, cần đ-ợc tiếp tục nghiên cứu làm rõ Xuất phát từ thực tế trên, với tình hình nhiễm khuẩn Việt Nam, đặc biệt tình hình kháng loại thuốc kháng sinh tổng hợp vi khuẩn lan rộng, thực đề tài: "B-ớc đầu nghiên cứu hoạt tính kháng khuÈn cña cao chiÕt tõ nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) số vi khuẩn gây bệnh ng-ời" Mục tiêu đề tài là: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết (cao chiết n-íc, cao chiÕt cån etylic75%, cao chiÕt metanol vµ cao chiÕt cloroform) tõ nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum) ®èi víi chủng vi khuẩn gây bệnh viêm nhiễm điển hình kháng thuốc phổ biến Tụ cầu vµng (Staphylococus aureus), Trùc khn mđ xanh (Pseudomonas aeruginosa), PhÕ cầu khuẩn (Streptococus pneumoniae), Trực khuẩn đ-ờng ruột (Escherichia coli) Klebsiella terrigena Nhiệm vụ đề tài là: - Tiến hành chiết cao nấm Linh chi dung môi n-ớc, cồn etylic75%, metanol cloroform, xác định hiệu suất chiết loại cao - Phân tích định tính số hợp chất có hoạt tính sinh häc nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum) - TiÕn hµnh kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết tỉ lệ pha loÃng khác chủng vi khuẩn gây bệnh - Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn hiệu sử dụng loại cao chiết từ nấm Linh chi Ch-ơng Tổng quan tài liệu 1.1 Khái quát bệnh nhiễm khuẩn th-ờng gặp ng-ời 1.1.1 Thực trạng bệnh nhiễm khuẩn ng-ời ã Khái niệm: Bệnh nhiễm khuẩn bệnh truyền nhiễm vi khuẩn gây BƯnh nhiƠm khn ë ng-êi, th-êng c¸c chđng vi khuẩn gây bệnh tồn phổ biến môi tr-ờng sống gây Bao gồm vi khuẩn hội vi khuẩn gây bệnh Khi có điều kiện thuân lợi gây nên bệnh viêm nhiễm nguy hiểm Ngoài chúng có khả đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh nay, nguyên nhân gây khó khăn lớn cho việc chữa trị bệnh viêm nhiễm vấn đề đ-ợc quan tâm hàng đầu y tế giới ã Trên giới Các bệnh nhiễm khuẩn nh-: Nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn gây viêm mủ.đang đ-ợc nhiều quốc gia quan tâm Kết ®iỊu tra cđa tỉ chøc y tÕ thÕ giíi (WHO) 32 n-ớc cho thấy: Tại n-ớc phát triển bình quân năm có khoảng 60/100.000 tr-ờng hợp chết nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính Các n-ớc phát triển tỉ lệ tử vong cao, có khoảng 140 đến 170/100.000 ng-ời chết nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính Cũng theo WHO, có 40 bệnh lây nhiễm xuất Trong năm gần giơi đà bùng phát 1100 ổ dịch, bao gồm dịch lẫn dịch bệnh quen thuộc bùng phát trở lại với tính nguy hiểm ngày cao [9] ã Việt Nam: Theo kết điều tra gần [2, 23, 29], bệnh viêm mủ, viêm tiết niệu, viêm đ-ờng ruột cấp tính, viêm màng nÃođang phổ biến nguy hiểm Căn nguyên gây bệnh chủ yếu chủng vi khuẩn nh-: Tụ cầu vàng (Staphilococcus aureus); Phế cÇu khn (Streptococcus pneumoniae); Trùc khn mđ xanh (Pseudomonas aeruginosa); Trực khuẩn Gram âm (Escherichia coli) vi khuẩn Klebsiella terrigena [2] Trong tổng số 31 bênh nhân điều trị khoa chấn th-ơng, Viện mắt TW từ tháng 1/2000 đến tháng 12/2000 với tình trạng: vết th-ơng nhÃn cầu hở, có rách giác mạc rách giác - củng mạc, nghi ngờ có viêm mủ nội nhÃn chẩn đoán có viêm mủ nội nhÃn sau chấn th-ơng nhÃn cầu hở, kết soi t-ơi soi t-ơi trực tiếp nh- sau: 31 bệnh nhân đ-ợc làm xét nghiệm bệnh mắt có vi khuẩn, vi khuẩn Gram (+) 19 bệnh nhân (61,3%); vi khuẩn Gram (-) bệnh nhân (29%); nhiều loại vi khuẩn: bệnh nhân (9,4%) Kết nuôi cấy: Trực khuẩn mủ xanh bệnh nhân, Trực khuẩn Gram (-) bệnh nhân, Staphylococcus aureus bệnh nhân [29] Theo thống kê bệnh viện Nhi Trung -ơng 16 năm cho thấy: số bệnh nhân nhập viện tỉ lệ nhiễm khuẩn hô hấp cấp tÝnh cã tíi 35-50% [23] KÕt qu¶ theo dâi xÐt nghiệm Bệnh viên Trung -ơng K71 Thanh Hoá vi khuẩn bệnh phẩm: đờm nhày mủ, dich hầu họng, đờm bọt, dịch tỵ hầu, 201 bệnh nhân vào tháng tháng năm 2008 nhsau: Các loại bệnh phẩm Dịch hầu Đờm bọt họng Tên chủng vi khuẩn Sta aureus Dịch tỵ hầu P aeruginosa - - E coli 3 10 Đờm nhày mủ K terrigena Str pneumoniae - - 15 10 Nh- qua bảng trên, thấy tất mẫu bệnh phẩm đ-ợc xét nghiệm, 75 bệnh phẩm cho kết d-ơng tính.Trong số tụ cầu vàng Sta aureus chiếm 16%; E coli 22,6%; K terrigena 16%; Str pneumoniae 37,3% vµ P aeruginosa 6,7% 1.1.2 Hiện t-ợng kháng kháng sinh số vi khn g©y bƯnh Theo Tiến sĩ J Ewards, Chủ tịch Hiệp hội bệnh nhiễm khuẩn Hoa Kú, công nghiên cứu chống vi khuẩn đà xuống dốc nghiêm trọng Hiện trạng tiếng chng cảnh báo, người thua chiến chống vi khuẩn [28] • Thực trạng Theo tỉ chøc y tÕ thÕ giíi WHO, cïng víi Trung Qc, ViƯt Nam lµ n-íc cã tØ lƯ vi khn kh¸ng kh¸ng sinh cao Châu Trong biểu kháng kh¸ng sinh râ nhÊt ë c¸c chđng vi khuẩn như: Tụ cầu vàng (Staphilococcus aureus); Phế cầu khun (Streptococcus pneumoniae); Trùc khn Gram ©m (Escherichia coli); Trùc khn mđ xanh (Pseudomonas aeruginosa) v (Klebsiella terrigena) Đó vi khuẩn gây bệnh viêm nhiễm nh-: viêm tiết niệu, viêm họng, viêm màng nÃo mũ, viêm hoá mủ, nhiễm trùng máu cấp tính[2] Theo báo cáo Vụ Điều Trị (Bộ Y Tế) hầu hết thuốc kháng sinh đà bị kháng từ thấp đến cao (30 - 80%) ®ã + Sự kháng kháng sinh phế cầu khuÈn Streptococcus pneumoniae ngày tăng, mức đề kháng với Erythromycin Trimoxazol 70% năm 2004, với Chloramphenicol tỷ lệ đề kháng tăng 9,4% (năm 2002) lên tới 35,6% (năm 2004) +Đối với vi khuẩn Escherichia coli (thường gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết), tỷ lệ kháng thuốc Ampicillin 88%, Amoxycillin 38,9%, Chloramphenicol, Trimoxazol 50%; Gentamycin, Ciprofloxacin 40%; Cefotaxim 20% + Đối với vi khuẩn Klebsiella terrigena Ampicillin khơng cịn tác dụng, tỷ lệ kháng thuốc lên tới 97% với Amoxycillin 42% Theo nghiªn cøu cđa Ngun Träng ChÝnh [11], tình hình kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn gây viêm đ-ờng tiết niệu nh- sau: + Đối với chủng vi khuẩn Staphilococcus aureus có sức đề kháng cao với Ampicillin 88,2%, Cephalixin, Gentamicin Ciprofloxacin 40%, Cefotaxim 20% + Đối với chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có tỉ lệ kháng với số loại kháng sinh nh- sau: Ampicillin 95,42%, Cefotaxim 49,62%, Ceftriazon 40,45%, Gentamicin 42,30%, Cprofloxacin 40,42% + Ngoài hai chủng thể đa kháng với nhiều loại kháng sinh khác với tỉ lệ cao,khi kết hợp chúng điều trị ã Nguyên nhân: Có nhiều nguyên nhân gây tình trạng kháng thuốc Trong việc sử tuỳ tiện, bừa bÃi, không kháng sinh nguyên nh©n lín nhÊt Cách sử dụng khơng phù hợp (dùng không liều lượng không khoảng cách lần phù hợp Những yếu tố trực tiếp ảnh hưởng đến vòng xoắn kháng kháng sinh Nhiễm khuẩn => Điều trị khơng thích hợp => Khơng tiệt trừ vi khuẩn => Chọn lọc vi khuẩn đề kháng => Nhiễm khuẩn lan tràn => Tăng kháng thuốc => Nhim khun ã Cơ chế + Vi khun cú thể kháng kháng sinh cách thay đổi mục tiêu (nơi kháng sinh gắn vào thể tác dụng) + Làm giảm tiếp xúc kháng sinh với mô mục tiêu (thay đổi xâm nhập hay đẩy kháng sinh khỏi tế bào nhiễm vi khuẩn) + Làm giảm lượng kháng sinh tiếp xúc với mô mục tiêu hay bất hoạt kháng sinh enzym vi khuẩn tiết + Đề kháng kháng sinh đề kháng giả (chỉ có biểu đề kháng môi trường định) đề kháng thật (vi khuẩn không chịu tác dụng kháng sinh) + Đề kháng kháng sinh đề kháng tự nhiên đề kháng thu đột biến di truyền: truyền dọc qua sinh sản (ông, cha, con, cháu, ); truyền ngang (từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác); lây nhiễm (người sang người, động vật sang người, mơi trường ) Q trình chọn lọc cá thể đề kháng, phát triển thành dòng (quần thể) đề kháng 1.2 Mét sè vi khn g©y bƯnh th-êng gặp ng-ời 1.2.1 Tụ cầu vàng (Staphilococcus aureus) ã Đặc điểm: S aureus cầu khuẩn Gram d-ơng, xếp hình chùm nho kích th-ớc 0,8 -1 m Có khả làm đông huyết t-ơng Nhiệt độ phát triển thích hợp 37 C, pH thích hợp 7,2- 7,4 Trên thạch th-ờng mọc sau 24 giờ, với khuẩn lạc có đ-ờng kính từ 2-3mm, dạng S (tròn, lồi, bóng, ®ơc, bê râ rƯt.) Sau 2436 giê xt hiƯn s¾c tố màu vàng Trên thạch máu khuẩn lạc tròn, -ớt, bóng, có vòng tan huyết hoàn toàn tạo thành vòng xung quanh khuẩn lạc (tan máu ) [2, 26] ã Khả gây bệnh : Staphilococcus aureus gây bệnh ng-ời chủ yếu bƯnh cÊp tÝnh [4] - BƯnh ngoµi da: Mơn nhät ,đôi gây ác tính biến chứng gây viêm nghẽn tĩnh mạch xoang hang (bệnh đinh râu.) - Nhiễm khuẩn huyết: Xẩy thể suy yếu, gây cấp tính mÃn tính bệnh viêm x-ơng, viêm phổi, viêm - Nhiễm độc thức ăn: Do ăn phải thức ăn bị nhiễm tụ cầu vàng Độc tố tụ cầu vàng gây nôn mửa ỉa chảy dội, hạ nhiệt choáng ã Tính chất sinh hoá: 10 sau 48 kích th-ớc vòng vô khuẩn không thay đổi, nh-ng sau 72 kích th-ớc vòng vô khuẩn bắt đầu giảm xuống Bảng 3.6: Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cloroform chủng vi khuẩn sau 24 giờ, 48 72 Tên chủng vi khuÈn Staphilococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Klebsiella terrigena Streptococcus pneumoniae Tû lƯ pha lo·ng dÞch cao chiÕt 1:1 1,5 : 2:1 3:1 1:1 1,5 : 2:1 3:1 1:1 1,5 : 2:1 3:1 1:1 1,5 : 2:1 3:1 1:1 1,5 : 2:1 3:1 §-êng kính vòng vô khuẩn (mm) 18 - 24 Sau 48 giê Sau 72 giê 30,5 mm 31,7 mm 33,5 mm 39,5 mm 16,7 mm 17,5 mm 18,7 mm 21,7 mm 17,5 mm 18,7 mm 19,0 mm 20,7 mm 22,5 mm 24,7 mm 26,5 mm 26,7 mm 30,5 mm 31,7 mm 33,5 mm 39,5 mm 16,7 mm 17,5 mm 18,7 mm 21,7 mm 17,5 mm 18,7 mm 19,0 mm 20,7 mm 22,5 mm 24,7 mm 26,5 mm 26,7 mm 30,5 mm 31,7 mm 33,5 mm 39,5 mm 15,5 mm 16,7 mm 17,7 mm 21,7 mm 16,5 mm 17,5 mm 18,7 mm 20,7 mm 20,5 mm 22,7 mm 25,5 mm 26,7 mm 3.4 Một số đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 3.4.1 ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 38 Đối với cao chiết n-ớc: 30 Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 28 25 23 20 20 19.5 21 19 17.5 16 15 10 Sta aureus P aeruginosa E coli K terigena Str pneumoniae 0 1:01 1.5 : 2:01 3:01 Tû lƯ pha lo·ng (cao : n-íc) BiĨu ®å 3.1 ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết n-ớc Đối với cao chiết cồn: 25 Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 22.5 20 15.5 17.7 16.5 15.75 18.5 Sta aureus 15 P aeruginosa E coli 10 K terigena Str pneumoniae 00 1:01 00 1,5 : 2:01 3:01 Tû lƯ pha lo·ng (cao : cån) BiĨu ®å 3.2 ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khn cđa cao chiÕt cån 39  §èi víi cao chiết metanol: Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 30 25 24.5 20 16.5 16 15 18 17.5 20.5 20 19.5 15 Sta aureus P aeruginosa E coli K terigena 10 Str pneumoniae 0 1:01 1,5 : 0 2:01 3:01 Tû lÖ pha lo·ng (cao : n-ớc) Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn (mm) Biểu đồ 3.3 ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khn cđa cao chiÕt metanol  §èi víi cao chiÕt cloroform: 45 40 39.5 35 30 30.5 25 20 22.5 17.5 15 16.7 31.7 24.7 18.7 17.5 33.5 26.5 26.7 19 18.7 21.7 20.7 Sta aureus P aeruginosa E coli K terigena Str pneumoniae 10 0 1:01 1,5 : 2:01 3:01 Tû lÖ pha loÃng (cao :cloroform) Biểu đồ ảnh h-ởng độ pha loÃng đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết cloroform 40 Qua Biểu đồ 3.1; 3.2; 3.3 3.4, cho thấy: - Kích th-ớc vòng vô khuẩn thêi gian tån t¹i cđa nã tØ lƯ thn víi độ đậm đặc loại cao chiết Đối với loại cao chiết, tỉ lệ (3:1) cho vòng vô khuẩn đạt kích th-ớc lớn kích th-ớc không thay đổi sau 72 theo dõi - Tỉ lệ pha loÃng cao chiết tăng lên khả ức chế vi khuẩn bị giảm xuống (chỉ tác động lên số chủng định, tuỳ thuộc vào loại cao), kích th-ớc vòng vô khuẩn giảm xuống; sau 48 72 kích th-ớc vòng vô khuẩn (0) 3.4.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn loại cao qua độ pha loÃng tối thiểu gây ức chế Bảng 3.7 Độ pha loÃng tối thiểu loại cao gây ức chế chủng vi khuẩn Tên chủng vi khuÈn Staphilococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Klebsiella terrigena Streptococcus pneumoniae Tû lƯ pha lo·ng tèi thiĨu cã thĨ gây ức chế vi khuẩn (Đ-ờng kính vòng kháng khuẩn) Cao chiÕt Cao Cao Cao n-íc cån metanol cloroform 1:1 1:1 1:1 1:1 (17,5 mm) (15,5 mm) 2:1 - (16,0 mm) 3:1 - (19,0 mm) (16,0 mm) 2:1 (15,0 mm) (30,5 mm) - 3:1 1:1 (20,0 mm) (16,7 mm) 2:1 2:1 2:1 1:1 (20,0 mm) (17,7 mm) (18,0 mm) (17,5 mm) - - - Qua B¶ng 3.7, chóng ta nhËn thÊy r»ng: 41 1:1 (22,5 mm) - Víi vi khuÈn Staphilococcus aureus tỉ lệ cao chiết (1:1) loại cao đà có khả ức chế, làm xuất vòng vô khuẩn, kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn cao chiết n-ớc (17,5mm) vµ cao chiÕt cloroform (30,5mm) - Víi vi khn Pseudomonas aeruginosa tỉ lệ tối thiểu để xuất vòng vô khuẩn tỉ lệ (2:1) có cao chiÕt cån vµ metanol ë tØ lƯ nµy míi làm xuất vòng vô khuẩn, cao chiết n-ớc có kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn (16,0 mm) - Víi vi khn Escherichia coli th× tØ lƯ tối thiểu có khả ức chế, làm xuất vòng vô khuẩn tỉ lệ (1:1) với cao chiết cloroform, tØ lƯ (3:1) víi cao chiÕt n-íc vµ cao chiÕt cån 75% - Víi Klebsiella terrigena th× tØ lƯ tối thiểu có khả ức chế tỉ lệ (1:1) víi cao chiÕt cloroform vµ tØ lƯ (2:1) víi loại cao chiết lại, cao chiết n-ớc cho kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn (20,0 mm) -Víi Streptococcus pneumoniae chØ cã tØ lƯ (1:1) cđa cao chiết cloroform tỉ lệ tối thiểu có khả gây ức chế với kích th-ớc vòng vô khuẩn (22,5 mm) Nh- vËy, tØ lƯ tèi thiĨu cã kh¶ gây ức chế chủng vi khuẩn loại cao không giống 3.4.3 So sánh hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết tỉ lệ (3:1) Nh- đà trình bày, sè tØ lƯ pha lo·ng th× tØ lƯ (3:1) có nồng độ cao chiết đậm đặc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất, đặc biệt vòng kháng khuẩn ổn định, không bị thu hẹp sau 72 theo dõi Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn ®èi víi tõng lo¹i cao chiÕt ë tØ lƯ (3:1) có khác cho loại vi khuẩn Sự khác đ-ợc thể qua Bảng 3.8 Biểu đồ 3.5 42 Bảng 3.8 So sánh hoạt tính kháng khuẩn loại cao tỷ lệ (3 : 1) Tên chủng vi khuẩn Đ-ờng kính vòng kháng khuÈn (mm) Cao Cao Cao metanol cån cloroform Cao n-íc Staphilococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Klebsiella terrigena Streptococcus pneumoniae 28,0 mm 22,5 mm 24,5 mm 39,5 mm 21,0 mm - 20,5 mm - 19,0 mm - 20,0 mm 21,7 mm 21,0 mm 18,5 mm 19,5 mm 20,7 mm - - - 26,7 mm 45 39,5 Đ-ờng kính vòng vô khuÈn (mm) 40 35 28 30 26,7 24,5 25 22,5 21 20,5 21,7 20 19 20 21 Cao chiÕt n-íc 20,7 19,5 18,5 Cao chiÕt cån 15 Cao chiÕt metanol 10 Cao chiÕt cloroform 0 0 0 ae na St re pt o co cc us pn eu m on i ter rig e ac ol i Kl eb sie lla Es ch er ich i as a m on Ps eu St ap hi lo co cc us au er ug in o re us sa Biểu đồ 3.5 So sánh hoạt tính kháng khuẩn loại cao tỷ lệ (3:1) - Víi tØ lƯ cao chiÕt n-íc (3:1) th× Staphilococcus aureus cho kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn (28mm) sau đến Pseudomonas aeruginosa 43 Klebsiella terrigena, cuối Escherichia coli; Streptococcus pneumoniae cho kết ©m tÝnh - Víi cao chiÕt cån (3:1) chØ cã khả ức chế Staphilococcus aureus Klebsiella terrigena với kích th-ớc vòng vô khuẩn (22,5 mm) (18,5 mmm) Các chủng lại cho kết âm tính - Với cao chiết metanol (3:1) có khả ức chÕ chđng vi khn lµ: Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena Escherichia coli Trong đó, Staphilococcus aureus có kích th-ớc vòng vô khuẩn lớn (24,5mm); lµ Pseudomonas aeruginosa (20,5 mm); Escherichia Coli (20,0mm) vµ thÊp nhÊt lµ Klebsiella terrigena (19,5 mm) - Víi cao chiÕt cloroform (3:1), tác dụng ức chế Pseudomonas aeruginosa Có tác dụng ức chế chủng lại Staphilococcus aureus có kích thứơc vòng vô khuẩn lớn (39,5 mm), đến Streptococcus pneumoniae (26,7 mm), Escherichia coli (21,7 mm) vµ thÊp nhÊt Klebsiella terrigena (20,7mm) Nh- vậy, loại vi khuẩn tác động kháng khuẩn loại cao có khác nhau, đó: + Đối với Staphilococcus aureus, cao chiết cloroform cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh (39,5mm), sau đến cao chiết n-ớc (28,0mm) + Đối với Pseudomonas aeruginosa, cao chiết n-ớc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (21,0 mm), sau đến cao chiÕt metanol (20,5 mm) + §èi víi Escherichia coli, cao chiết cloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (21,7 mm), sau ®ã ®Õn cao chiÕt metanol (20,0 mm) + Đối với Klebsiella terrigena, cao chiết n-ớc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (21,0 mm), sau đến cao chiÕt (20,7 mm) + §èi víi Streptococcus pneumoniae, cao chiết cloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh (26,7 mm) 44 Kết luận đề nghị I Kết luận: Kết nghiên cứu loại cao chiết từ nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) víi chđng vi khuẩn gây bệnh nh- sau: Trong số loại dung môi dùng để chiết cao thì: N-ớc cloroform hai dung môi cho hiệu chiết cao nhất, với khối l-ợng hợp chất thu đ-ợc (30,0mg/1gDL), tiếp ®Õn lµ metanol (28,0mg/1gDL) vµ thÊp nhÊt lµ cån 75% (26,7mg/1gDL) Đà xác đ-ợc số hợp chất có hoạt tính sinh học có nấm Linh chi là: Saponin gồm hai loại Saponin Steroit Saponin Tritecpen; hỵp chÊt Glucozit tim; hỵp chÊt Ancaloit; hỵp chÊt Sesquitecpen lacton; Flavonoit gồm hai loại Isoflavanol Flavanon Cao chiÕt tõ nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst.) có khả ức chế chủng vi khuẩn Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terigena, Escherichia coli vµ Klebsiella terrigena đ-ợc phân lập từ mẫu bệnh phẩm mức độ khác tuỳ thuộc vào loại cao chiết tỉ lệ pha loÃng dùng để thử hoạt tính: - Cao chiết n-ớc có khả ức chế với chđng vi khn lµ: Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli Klebsiella terrigena nh-ng tác dụng ức chÕ ®èi víi chđng vi khn Streptococcus pneumoniae - Cao chiết cồn etylic75% có khả ức chế chđng vi khn lµ Staphilococcus aureus vµ Klebsiella terrigena; khả ức chế với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli vµ Streptococcus pneumoniae - Cao chiÕt metanol có khả ức chế chủng vi khuÈn lµ: Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella terrigena vµ Escherichia coli; khả ức chế Streptococcus pneumoniae 45 - Cao chiÕt clorform cã t¸c dơng øc chế chủng vi khuẩn là: Staphilococcus aureus, Klebsiella terrigena, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae; khả øc chÕ ®èi víi Pseudomonas aeruginosa TØ lƯ pha loÃng loại cao chiết ảnh h-ởng trực tiếp đến khả kháng khuẩn, thể qua kích th-ớc thời gian tồn vòng vô khuẩn Đối với loại cao chiết, tỉ lệ (3:1) cho vòng vô khuẩn đạt kích th-ớc lớn kích th-ớc không thay đổi sau 72 theo dõi Khi tỉ lệ pha loÃng tăng lên tuỳ thuộc vào loại cao chiết chủng vi khuẩn mà kích th-ớc vòng vô khuẩn giảm xuống (0) sau 48 – 72 giê theo dâi Dùa vào hoạt tính kháng khuẩn hiệu chiết xuất cao từ nấm Linh chi, đ-a loại cao sử dụng tốt (trong giới hạn nghiên cứu đề tài) cho chủng vi khuẩn nh- sau: ®èi víi Staphilococcus aureus lµ cao chiÕt cloroform vµ cao chiết n-ớc tỉ lệ (3:1); Pseudomonas aeruginosa cao chiÕt n-íc tØ lƯ (3:1); ®èi víi Escherichia coli cao chiết cloroform tỉ lệ (3:1); Klebsiella terrigena lµ cao chiÕt n-íc tØ lƯ (3:1) vµ Streptococcus pneumoniae cao chiết cloroform tỉ lệ (3:1) II Đề nghị: Do đề tài đ-ợc thực thời gian ngắn, nên nhiều mặt hạn chế, nhiều vấn đề để ngỏ, đề tài nên đ-ợc tiếp tục nghiên cứu theo h-ớng sau: - Mở rộng thử nghiệm vi khuẩn gây bệnh khác ng-ời - Phân tích đầy đủ thành phần hoá học nấm Linh chi , từ xác định đ-ợc hoạt chất nấm Linh chi có tác dụng ức chế vi khuẩn - Nghiên cứu, hoàn thiện quy trình tách chiết hợp chất từ nấm Linh chi nghiên cứu ph-ơng pháp sử dụng chúng cho việc điều trị loại bệnh 46 Tài liệu tham khảo [1] Bộ Y Tế (1994) D-ợc điển ViÖt Nam tËp & Nxb Y Häc [2] Bé Y TÕ (2000) Tµi liƯu tËp hn vi sinh lâm sàng [3] Bộ Y Tế (2006) Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng Nxb Y Học [4] Bộ Y tế (2007) Báo cáo Vụ điều trị - Bộ Y tế [5] Bộ môn D-ợc liệu, Tr-ờng ĐH D-ợc Hà Nội (2002) Bài giảng d-ợc liệu (Tập 1, 2) Nxb Y Học [6] Bộ môn D-ợc học cổ truyền, Tr-ờng ĐH D-ợc Hà Nội (2004) Kỹ tht chÕ biÕn vµ bµo chÕ thc cỉ trun Nxb Y Học [7] Đỗ Huy Bích cộng tác viên (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Nxb Y häc [23] NguyÔn Duy ChÝnh – 1998 Cây nấm Linh chi Bách Khoa Thuốc Việt Nam [8] Nguyễn Duy Chính (1998) Cây nấm Linh chi Bách Khoa Thuốc Việt Nam [9] Cơ quan ngôn luận Công an (2008) Vi khuẩn gây bệnh vùng lên @2007 Báo công an nhân dân điện tử CAND Online [10] Nguyễn Thị Chính (chủ biên), Tr-ơng Thị Hoà Vi sinh vËt y häc Nxb Y häc [11] NguyÔn Trọng Chính (2001) Nghiên cứu nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn tiết niệu tình hình kháng thuốc kháng sinh chúng(tại Bệnh viện TWQĐ 108: 2000 -2001) [12] Phạm Thị Trân Châu - Trần Thị (2003) Hoá sinh học Nxb GD [13] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình L-ơng, Đoàn Xuân M-ợu, Phạm Văn Ty (1978) Một số ph-ơng pháp nghiên cøu vi sinh vËt Nxb Khoa häc & Kü thuËt, Hà Nội [14] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000) Vi sinh vật học Nxb Giáo dục 47 [15] Nguyễn Văn Đàn Nguyễn Viết Tựu (1985) Ph-ơng pháp nghiên cứu hoá học thuốc Nxb Y Học [16] Nguyễn Thành Đạt (2001) Cơ sở sinh häc vi sinh vËt t©p & Nxb Giáo dục [17] Nguyễn Hữu Đống (2003) Nuôi trồng sử dụng nấm ăn, nấm d-ợc liệu, Nxb Nghệ An [18] GS, BS Trần Văn Kỳ (1999) Thuốc bổ đông y nghiên cứu ứng dụng lâm sàng Nxb Thanh Niên [19] Đỗ Tất Lợi (2005) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nxb Y Học [20] Nguyễn Đức Minh (1995) Thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn từ cỏ n-ớc Nxb Y Học [21] Nguyễn Văn Mùi (2001) Thực hành hoá sinh học Nxb ĐHQG Hà Nội [22] Nguyễn Hoài Nam (1986) Xác định hoạt l-c kh¸ng sinh b»ng vi sinh vËt Nxb Khoa Häc & Kỹ Thuật [23] Những vấn đề nghiên cứu khoa häc sù sèng (2005) B¸o c¸o khoa häc héi nghi toµn quèc 2005 Nxb Khoa häc Kü thuËt [24] BS Trần Thị Nga (2008) Phòng bệnh cấp tính trẻ em Viện nhi Trung uơng [25] Nguyễn Xuân Thành (Chủ biên) (2005) Vi sinh vật công nghiệp Nxb Giáo dục [26] Trần Linh Th-ớc (2006) Ph-ơng pháp phân tích vi sinh vật n-ớc, thực phẩm mü phÈm Nxb Gi¸o dơc [27] Ngun Vị Trung (2006) Sổ qui trình vi khuẩn Nxb Đại học Y Hà Nội [28] Trần Nh- Thắng (2008) Kháng sinh dần bất lực www.ykhoavn.com [29] Nguyễn Thị Thu Yên (2000) Viêm mủ nội nhÃn sau chấn th-ơng nhÃn cầu hở, vi sinh vật gây bệnh kết điều trị Viện mắt Trung -ơng [30] www NamLinhChi.com Nấm Linh Chi thần d-ợc trị bách bệnh 48 Phần Phụ lục ảnh 1: Vòng kháng khuẩn Klebsiela terigena với cao chiết n-ớc t lệ : ảnh 2: Vòng kháng khuẩn cđa vi khn Pseudomonas aeruginosa víi cao chiÕt n-íc tØ lệ : 49 ảnh 3: Vòng kháng khuẩn cđa vi khn Staphilococcus aureus víi cao chiÕt n-íc tØ lệ : ảnh 4: Vòng kháng khuẩn vi khuÈn Escherichia coli víi cao chiÕt n-íc : 50 ảnh 5: Vòng kháng khuẩn vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa víi cao chiÕt n-íc tØ lƯ : ảnh 6: Vòng kháng khuẩn vi khuẩn Klebsiela terigena víi cao chiÕt (cån, metanol vµ n-íc) tØ lƯ : 51 ảnh 7: Vòng kháng khuẩn vi khn Staphilococcus aureus víi cao chiÕt cån tØ lƯ : ảnh 8: Vòng kháng khuẩn vi khn Staphilococcus aureus víi cao chiÕt n-íc tØ lƯ : 52 ... hoạt tính kháng khuẩn cao chi? ?t tõ nÊm Linh chi (Ganoderma lucidum Karst. ) ®èi víi số vi khuẩn gây bệnh ng-ời" Mục tiêu đề tài là: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cđa lo¹i cao chi? ?t (cao chi? ?t... Flavonoit với hai loại Isoflavanol Flavanon 32 3.3 Kết nghiên cứu tính kháng khuẩn cao chi? ??t nấm Linh chi đến chủng vi khuẩn nghiên cứu 3.3.1 Cao chi? ??t với dung môi n-ớc (cao chi? ??t n-ớc) Bảng 3.3: Hoạt. .. kháng khuẩn cao chi? ??t nấm Linh chi đến chủng vi khuẩn nghiên cứu 33 3.3.1 Cao chi? ?t với dung môi n-ớc (cao chi? ??t n-ớc) 33 3.3.2 Cao chi? ??t với dung môi cån etyli 75% (cao chi? ?t cån)