Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ và cơ chế liên quan đến tác dụng chống oxy hoá của cao chiết lá chè đắng (ilex kudingcha c j tseng)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÝ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ VÀ CƠ CHẾ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG (ILEX KUDINGCHA C.J.TSENG) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÝ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ VÀ CƠ CHẾ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG (ILEX KUDINGCHA C.J.TSENG) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.Phạm Thị Nguyệt Hằng PGS.TS Nguyễn Thị Lập HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS Nguyễn Thị Lập, người thầy, người ln nhiệt tình giúp đỡ, hết lịng bảo trực tiếp hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị nghiên cứu viên Khoa Dược lý – Sinh hoá Viện Dược liệu, thầy giáo mơn Hóa sinh Dược – trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tồn thể thầy cô giáo cán trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học phòng ban khác trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt PGS.TS Nguyễn Thị Song Hà, ThS Chu Lê Mai tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo thạc sỹ thời hạn Cuối cùng, xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên tôi, ủng hộ chỗ dựa tinh thần tơi gặp khó khăn học tập sống Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2021 Học viên cao học Nguyễn Thị Lý MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 TỔNG QUAN .3 1.1 Hội chứng tự kỷ 1.1.1 Khái niệm hội chứng tự kỷ 1.1.2 Triệu chứng dấu hiệu chẩn đoán 1.1.3 Dịch tễ học 1.1.4 Các yếu tố nguy sinh lý bệnh 1.1.5 Tác động stress oxy hoá đến ASD 1.1.6 Điều trị 12 1.1.7 Các mơ hình thực nghiệm nghiên cứu đánh giá hội chứng tự kỷ 15 1.2 Cây chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 18 1.2.1 Tên gọi vị trí phân loại 18 1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 18 1.2.3 Thành phần hoá học 19 1.2.4 Một số nghiên cứu thực chè đắng 20 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nguyên vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Động vật thí nghiệm 24 2.1.3 Hoá chất trang thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Gây mơ hình chuột tự kỷ muối natri valproat (VPA) 27 2.3.2 Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) 29 2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá cao chiết chè đắng 32 2.3.4 Xử lý số liệu 37 KẾT QUẢ 39 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng 39 3.1.1 Đánh giá tác dụng tăng tương tác cộng đồng 39 3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện lo âu 45 3.1.3 Đánh giá tác dụng cải thiện nhận thức 46 3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hố cao chiết chè đắng 47 3.2.1 Hoạt tính dọn gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine) 47 3.2.2 Hoạt tính dọn gốc tự superoxide 48 3.2.3 Hoạt tính ức chế giảm glutathion não chuột 48 BÀN LUẬN .50 4.1 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ mơ hình động vật thực nghiệm 50 4.1.1 Về mơ hình gây bệnh tự kỷ cho chuột 50 4.1.2 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng 52 4.2 Về chế chống oxy hoá cao chiết chè đắng 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt ASD DPPH DTNB Tên tiếng anh Tên đầy đủ Autism spectrum disorder Chứng rối loạn phổ tự kỷ 1,1-Diphenyl – 2- 1,1-Diphenyl – 2- picrylhydrazyl picrylhydrazyl 5,5’-dithiobis acid – 5,5’-dithiobis acid – nitrobenzoic nitrobenzoic EPM elevated plus maze Mê lộ chữ thập GPx Glutathione peroxidase Glutathion peroxidase GR Glutathione reductase Glutathion reductase GSH LD 50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% 10 MDA malonyldialdehyde malonyl dialdehyd 11 NST 12 NTB Nitroblue tetrazolium 13 ROS Reactive oxygen species 14 ORT Object Recognition Test 15 USV Ultrasonic vocalizations Sóng siêu âm 16 SEM Standard error of the Sai số chuẩn giá trị mean trung bình 17 SOD Superoxide dismutase Superoxid dismutase γ-glutamyl-cysteinylglysine Glutathion Nhiễm sắc thể Nitroblue tetrazolium Các gốc phản ứng oxy hoá Thử nghiệm nhận biết đồ vật Valproat (bao gồm acid 18 VPA Valproate valproic, natri valproat, dinatri valproat) i DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Hoá chất sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 2.2: Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.3: Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm thử nghiệm dọn gốc DPPH cao chiết chè đắng 33 Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm thử nghiệm dọn gốc Superoxide cao chiết chè đắng 35 Bảng 2.6: Thành phần đĩa ELISA làm phản ứng định lượng glutathion não chuột 37 Bảng 3.1: Tỷ lệ chuột phát âm theo nhóm, ngày 39 Bảng 3.2: Kết nồng độ glutathion não chuột 49 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các phản ứng khử độc loại ROS enzym xúc tác phản ứng giải độc gồm Fenton (phản ứng Fenton), GPx (glutathion peroxidase), GR (glutathion reductase), MIT (ty thể) SOD (superoxide dismutase) [13] 10 Hình 1.2 Hình ảnh chè đắng búp chè đắng khô 19 Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu 27 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế thực nghiệm 28 Hình 2.3: Mơ hình thí nghiệm ba buồng chuột nhắt trắng 30 Hình 2.4: Mơ hình thí nghiệm mê lộ chữ thập chuột nhắt trắng 31 Hình 2.5Sơ đồ phản ứng gốc DPPH với gốc khác (•R= •H, gốc alkyl) 32 Hình 2.6: Sơ đồ tính khử NBT phản ứng với gốc anion superoxide tạo phản ứng PMS-NADH 34 Hình 3.1: Thời lượng gọi lô chuột theo ngày 40 Hình 3.2: Tần số gọi lơ theo ngày 41 Hình 3.3: Entropy gọi lô theo ngày 42 Hình 3.4: Năng lượng gọi lô theo ngày 43 Hình 3.5: Kết đánh giá khả tương tác cộng đồng cao chiết chè đắng thử nghiệm ba buồng 44 Hình 3.6: Tác dụng thử nghiệm mê lộ chữ thập 45 Hình 3.7: Kết đánh giá khả nhận thức thử nghiệm nhận diện đồ vật chuyển vị trí 46 Hình 3.8: Hoạt tính dọn gốc DPPH cao chiết chè đắng 47 Hình 3.9: Hoạt tính dọn gốc Superoxide mẫu cao chiết chè đắng 48 iii ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng tự kỷ (Autism spectrum disorder – ASD) bệnh lý thần kinh phức tạp với rối loạn hành vi thường xuất năm đầu đời đặc trưng suy giảm khả hoà nhập xã hội, suy giảm khả giao tiếp, kết hợp với hành vi rập khuôn, lặp lại Các triệu chứng không suy giảm theo thời gian, ảnh hưởng đến tương lai trẻ theo nhiều hướng Một số người sống độc lập khó khăn giao tiếp, học tập số khác bị khuyết tật nặng cần hỗ trợ chăm sóc suốt đời Thuốc điều trị dứt điểm hội chứng tự kỷ chưa có liệu pháp điều trị thường dựa phương pháp giáo dục tâm lý Các thuốc hoá dược giúp giảm triệu chứng liên quan đến tự kỷ hăng, lầm lì, tập trung có hại với hệ thần kinh Do đó, nhiều nhóm nghiên cứu ngồi nước tập trung sàng lọc dược liệu có khả cải thiện nhận thức để điều trị hội chứng tự kỷ Qua tham khảo tài liệu, chè đắng với tên khoa học Ilex kudingcha C.J.Tseng (IK), họ Aquifoliaceae có tiềm điều trị tự kỷ Dược liệu phân bố tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam Cao Bằng, Lào Cai, Bắc Cạn, Hồ Bình Trong y học cổ truyền Việt Nam, chè đắng sử dụng để thải độc tố kháng khuẩn, giảm khát ho, mắt ngứa, mắt đỏ, đặc biệt để cải thiện trí nhớ Triterpenoid, acid phenolic, flavonoid tinh dầu thành phần chè đắng, thành phần có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hồ chuyển hố lipid, chống oxy hoá, hạ đường huyết chống khối u Một số nghiên cứu giới chứng minh chè đắng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương thần kinh thiếu máu não cục tạm thời [24] Đồng thời, kết bước đầu đánh giá mơ hình ruồi giấm tự kỷ - nghiên cứu hợp tác Khoa Dược lý – Sinh hố Viện Dược liệu với Viện cơng nghệ Kyoto cho thấy saponin chè đắng có tác dụng cải thiện triệu chứng tự kỷ thể thông qua hành vi cải thiện rối loạn giấc ngủ ngày đêm, cải thiện khả học tập ghi nhớ mùi Do đó, thực đề tài “Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ chế liên quan đến tác dụng chống oxy hoá cao chiết chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng)” với hai mục tiêu: - Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) mơ hình chuột nhắt trắng - Đánh giá khả chống oxy hoá cao chiết chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) TỔNG QUAN 1.1 Hội chứng tự kỷ 1.1.1 Khái niệm hội chứng tự kỷ Hội chứng tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder ASD) số rối loạn phát triển thần kinh đặc trưng thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng, giao tiếp ngôn ngữ phi ngôn ngữ năm đầu đời trẻ [29] Trẻ mắc ASD thường né tránh nhìn trực tiếp, gặp vấn đề khả kiểm soát cảm xúc nhận thức thái độ người khác, thực số hành vi giới hạn thiếu tập trung ASD kéo dài suốt đời trẻ sau Các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bé trai mắc hội chứng tự kỷ cao bé gái từ 2-3 lần Chính chẩn đốn hội chứng tự kỷ thiên bé trai cho bé gái [10] 1.1.2 Triệu chứng dấu hiệu chẩn đốn ASD ảnh hưởng tới phát triển sớm não tái tổ chức thần kinh Tuy nhiên, khơng có dấu ấn sinh học đáng tin cậy, chẩn đoán phải thực sở hành vi Cẩm nang thống kê chẩn đoán rối loạn tâm thần Hiệp hội Tâm thần Hoa kỳ (DSM-5), xuất năm 2013, nhằm mục đích giúp chẩn đoán ASD cách đơn giản Trẻ mắc hội chứng thường biển thiếu hụt bất thường yếu tố chẩn đoán cốt lõi tương tác xã hội, khả giao tiếp hành vi có tính rập khn, lặp lại Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đốn bao gồm việc xuất dấu hiệu giảm giao tiếp xã hội hai dấu hiệu việc lặp lại hành vi rập khn, máy móc Dấu hiệu giảm tương tác xã hội khả giao tiếp bao gồm suy giảm rõ rệt hành vi phi ngôn ngữ ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ thể Trẻ không hứng thú với việc giao tiếp hoạt động xã hội Trẻ tự kỷ có thiếu hụt khả BÀN LUẬN 4.1 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ mơ hình động vật thực nghiệm 4.1.1 Về mơ hình gây bệnh tự kỷ cho chuột Nghiên cứu ASD chuột có hai loại mơ hình mơ hình di truyền mơ hình khơng di truyền Các mơ hình di truyền ASD gây chuột tạo cách nhắm đến gen tương đồng chuột với gen liên quan đến ASD người FMR1, NBEA, UBE3A… Bên cạnh đó, mơ hình tự kỷ không di truyền chuột nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu Các loài động vật gặm nhấm tiếp xúc với VPA có hành vi giống người bị tự kỷ Các nghiên cứu mơ hình cho động vật mang thai tiếp xúc với VPA mơ hình có giá trị nghiên cứu mạnh đặc trưng cho bệnh tự kỷ mặt cấu tạo giá trị Mơ hình mang tính đại diện tốt cho động vật mang thai tiếp xúc với chất độc khác chuyển gen mang đột biến tự kỷ Mơ hình VPA cung cấp cơng cụ có giá trị để điều tra sinh học thần kinh chứng tự kỷ sàng lọc phương pháp trị liệu Từ ưu điểm mơ hình gây bệnh tự kỷ VPA, chúng tơi lựa chọn mơ hình gây bệnh nghiên cứu Dựa kết sàng lọc ban đầu tác dụng cao chiết chè đắng mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang ASD Khoa Dược lý-Sinh hố, Viện Dược liệu, chúng tơi lựa chọn hai mức liều điều trị 270 mg/kg 540 mg/kg thể trọng Trên giới chưa có thuốc điều trị ASD mà có số loại thuốc hỗ trợ điều trị làm giảm số triệu chứng, nghiên cứu không sử dụng thuốc chứng dương Valproat sử dụng rộng rãi loại thuốc chống động kinh ổn định tâm lý Cơ chế bệnh sinh ASD người động vật gặm nhấm tiếp xúc với valproat thời kỳ mang thai chưa rõ ràng Hai nghiên cứu 50 độc lập tăng acetyl hố histon H3 H4 não phơi thai chuột chuột mẹ tiếp xúc với VPA có liên quan đến suy giảm hành vi giống người tự kỷ VPA tác động đến q trình sửa chữa tế bào thần kinh cách ức chế GSK3β, thúc đẩy tín hiệu Wnt (Hall cộng sự.2002) Con đường tín hiệu Wnt điều chỉnh biệt hố tiền nhân trung gian vỏ não tế bào thần kinh Sự kích hoạt bất thường đường Wnt gây tử cung tiếp xúc với VPA phá vỡ cửa sổ không gian – thời gian phát triển não bào thai VPA ảnh hưởng đến biệt hoá tăng sinh tế bào tiền thần kinh thông qua đường β-catenin-Ras ERK-p21 (Jung cộng sự, 2008) Cụ thể, VPA thúc đẩy hoạt hoá β-catenin cách ức chế GSK3β β-catenin hoạt hoá điều chỉnh Ras làm tăng nồng độ ERK phosphoryl hố, kích thích biệt hố tế bào tiền thần kinh Cuối cùng, việc tiếp xúc với VPA dẫn đến tăng nồng độ GABA (ức chế enzym phân huỷ hoạt hố enzym tổng hợp GABA) GABA đóng vai trò quan trọng phát triển mạng lưới thần kinh não Do đó, việc tiếp xúc với VPA giai đoạn bào thai phá vỡ mạch tế bào thần kinh phát triển dẫn đến hội chứng tự kỷ Trong nghiên cứu này, số quan sát gồm thử nghiệm sóng siêu âm (vào ngày 3, 5, ngày tuổi), thử nghiệm ba buồng (30 ngày tuổi), mê lộ chữ thập (40 ngày tuổi), thử nghiệm nhận diện đồ vật (50 ngày tuổi) Kết cho thấy: VPA làm thay đổi số theo hướng làm giảm số sóng siêu âm, giảm thời gian tiếp xúc với chuột đồng giới (trong thử nghiệm ba buồng), giảm thời gian cánh tay mở (trong thử nghiệm mê lộ chữ thập), không khác biệt thời gian khám phá đồ vật với đồ vật cũ (trong thử nghiệm nhận diện đồ vật) Bên cạnh đó, quan sát chuột sơ sinh ngày bắt đầu mở mắt muộn so với chuột thuộc nhóm chuẩn sinh lý (chuột mở mắt vào ngày thứ 13 sau sinh nhóm bệnh lý ngày thứ 11 sau sinh nhóm sinh lý), chuột tự kỷ bị gập, cân nặng tăng chậm so với nhóm sinh lý bước đầu phản ánh thành công 51 mô hình Các dấu hiệu nghiên cứu hội chứng tự kỷ giới “Nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi số dấu ấn sinh học chống oxy hố rau đắng biển mơ hình chuột nhắt tự kỷ gây VPA” tác giả Sanhya cộng [43] 4.1.2 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu hội chứng tự kỷ tác dụng cải thiện triệu chứng ASD số dược liệu thuốc hố dược Tuy nhiên chưa có công bố tác dụng chè đắng việc cải thiện hội chứng tự kỷ Vì vậy, phần bàn luận chưa thể đưa so sánh kết nghiên cứu đề tài với nghiên cứu khác 4.1.2.1 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện tương tác cộng đồng Tính cộng đồng yếu tố thiết yếu động vật có tập tính sống bầy đàn, đa phần động vật có vú, bao gồm người Những thiếu hụt tương tác cộng đồng ghi nhớ đặc điểm đặc trưng để nhận biết bệnh lý thần kinh Trí nhớ làm việc cộng đồng q trình thiết yếu khơng tiên lượng trước hình thành cách bền vững nhằm thích ứng với thay đổi, q trình liên quan tới khả mã hoá, lưu giữ hồi tưởng lại thông tin đáng ý từ cộng đồng Những nghiên cứu trước tập trung sử dụng độc tính gây tổn thương diện rộng tới vùng não kiểm soát tế bào đích biểu mơ cấu thành Nhưng nghiên cứu tập trung tới sử dụng yếu tố phát quang nhạy liên quan tới vùng não hệ tuần hoàn, gồm hạch nhân [15], đồi hải mã [19] vùng dây thần kinh VT (ventral tegmental area) [34] đóng vai trị quan trọng hình thành hành vi cộng đồng gồm tương tác, tiếp cận ghi nhớ phân biệt [18] Suy giảm khả hoạt động cộng đồng yếu tố đặc trưng để nhận biết bệnh lý tự kỷ Chuột nhắt thí nghiệm lồi gặm nhấm sống cộng đồng, mà mức độ tương tác cộng đồng khả 52 khám phá loài mức cao [22], thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng lồi tiêu chí quan trọng để đánh giá mô tự kỷ chuột nhắt nghiên cứu Các triệu chứng ASD thường xuất giai đoạn trẻ lên hai Vì giai đoạn quan trọng chẩn đoán đưa biện pháp can thiệp từ đầu để đạt hiệu điều trị tốt Thử nghiệm sóng siêu âm tiến hành chuột sinh giúp đánh giá bệnh lý sớm tiên lượng tác dụng cao chiết chè đắng Chuột bắt đầu phát âm sau sinh giảm dần trưởng thành Sóng siêu âm thông số quan trọng đặc trưng cho giao tiếp xã hội chuột Trong mơ hình chuột bị rối loạn phổ tự kỷ, tỷ lệ chuột phát âm, số gọi, thời lượng gọi chuột giảm dấu hiệu suy giảm khả giao tiếp chuột bị cách ly với mẹ chúng [40] Thử nghiệm sóng siêu âm thử nghiệm Việt Nam giới áp dụng để đánh giá khả tương tác cộng đồng chuột sinh Vì vậy, kết thử nghiệm sóng siêu âm đề tài kết bước đầu cần thêm nhiều thời gian để tiếp tục nghiên cứu đánh giá Tiến hành thử nghiệm sóng siêu âm chuột sinh, thu kết bước đầu tỷ lệ chuột phát âm lô sinh lý tăng dần qua ngày cao so với lô bệnh lý Một số đặc điểm phát âm thời lượng goi, entropy lơ sinh lý cao lơ bệnh lý Điều chứng tỏ VPA gây dị tật bẩm sinh chuột mơ hình gây hội chứng tự kỷ tiến hành thành công Điều trị cao chiết chè đắng hai mức liều 270 mg/kg 540 mg/kg làm tăng tương tác cộng đồng chuột thông qua tỷ lệ chuột phát âm, thời lượng phát âm so với lô bệnh lý Trong thử nghiệm ba buồng, thông số thời gian tương tác với hộp lưới đối tượng lạ ghi lại đánh giá [14] Kết nghiên cứu cho thấy chuột bị ảnh hưởng VPA làm giảm thời gian tương tác với chuột lạ chứa hộp lưới, kết 53 hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước Từ kết trên, nhận thấy cao chiết chè đắng với mức liều 270 mg/kg 540 mg/kg có tác dụng tăng tương tác cộng đồng chuột nhắt tự kỷ Trong nghiên cứu trước suy giảm hệ cholinergic gây vấn đề nhận thức vấn đề tương tác cộng đồng donepezil giúp cải thiện vấn đề tương tác cộng đồng Gây mơ hình tự kỷ VPA điều trị kéo dài donepezil giúp cải thiện mơ hình tương tác cộng đồng ghi nhớ cộng đồng, giúp làm giảm lượng AchE tăng cao mức [25] điều gợi ý tương tác chưa biết việc gây mơ hình valproat với hệ cholinergic (sự bất thường nồng độ ChAT, AChE), hay vai trò yếu tố trung gian dẫn truyền hệ cholinergic với hành vi bệnh lý tự kỷ 4.1.2.2 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện lo âu Lo rối loạn tâm thần kèm phổ biến người mắc ASD gây suy giảm chức năng, tác động tiêu cực đến hoạt động hàng ngày khả nằng đưa định giảm tương tác xã hội Các nghiên cứu ASD cho thấy rối loạn chức mạch amygdala-OFC chế trung gian liên kết lo âu với triệu chứng tự kỷ hành động theo khuôn mẫu, hành vi lặp lặp lại Với mục đích mơ hình hố lo âu bệnh lý người lồi gặm nhấm, loạt mơ hình thử nghiệm hành vi phát triển Các thử nghiệm tạo lo âu, sợ hãi cách cho động vật vào không gian mở, ánh sáng mạnh độ cao Thử nghiệm dựa xu hướng tự nhiên chuột khám phá môi trường lạ Chuột lựa chọn thời gian cánh tay mê cung mở không bảo vệ cánh tay kín bao bọc, thiết bị nâng cao cách sàn nhà m Chuột có xu hướng tránh khu vực mở, thích khơng gian tối kín Việc chuột tránh vào cánh tay mở có tương quan số căng thẳng thần kinh 54 Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước chứng minh động vật tiếp xúc với VPA làm tăng lo lắng mơi trường mở đặc biệt mơ hình mê lộ chữ thập [37], [38] Thời gian khám phá cánh mở lô sinh lý cao gấp 5,2 lần so với lơ bệnh lý Điều giải thích VPA gây dị tật não thông qua việc tăng dẫn truyền hệ glutaminergic dẫn đến kích thích thần kinh mức Hai lô chuột tự kỷ điều trị cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg thể trọng làm tăng thời gian khám phá cánh mở Tác dụng chống lo âu cao chiết chè đắng khả làm giảm lượng glutamat tích luỹ não chuột 4.1.2.3 Về kết đánh giá tác dụng cải thiện nhận thức cao chiết chè đắng Một nghiên cứu lâm sàng trí nhớ thực nhóm gồm 38 trẻ em mắc ASD nhóm 38 trẻ em khoẻ mạnh bình thường Kết cho thấy khả ghi nhớ trẻ em tự kỷ tương đối đặc biệt trí nhớ với thơng tin hình ảnh, lời nói phức tạp trí nhớ làm việc lời nói, khả nhận dạng Từ góc độ lâm sàng, hồ sơ liệu trí nhớ cho thấy trẻ em mắc hội chứng tự kỷ thu nhận thơng tin từ kích thích phức tạp bao gồm cảnh vật, câu từ câu chuyện phức tạp Sự khác biệt nhớ trẻ tự kỷ làm suy giảm khả thích ứng hoạt động giao tiếp xã hội giải vấn đề Các mơ hình nghiên cứu động vật cơng cụ có ích để nghiên cứu sâu suy giảm trí nhớ người có chung chế nhớ não Ennaceur Delacour (1988) người nghiên cứu mơ hình thử nghiệm nhận dạng đồ vật Thử nghiệm kiểm tra hành vi đơn giản trí nhớ dựa vào khả khám phá bẩm sinh loài gặm nhấm Thử nghiệm nhận diện đồ vật trở thành mơ hình rộng rãi để kiểm tra thay đổi nhớ Chúng áp dụng thử nghiệm để đánh giá khả nhận thức chuột lơ Kết cho thấy có khác 55 biệt có ý nghĩa thống kê thời gian khám phá vật vật cũ lơ sinh lý nhiên lơ bệnh lý khơng có khác biệt hai thơng số Từ đó, chúng tơi kết luận VPA làm suy giảm trí nhớ chuột Hai lơ dùng cao chiết chè đắng liều 540 mg/kg 270 mg/kg thể trọng, thời gian chuột khám phá vật tăng đạt ý nghĩa thống kê với thời gian chuột khám phá vật cũ Vì vậy, cao chiết chè đắng hai mức liều có tác dụng cải thiện nhận thức chuột tự kỷ 4.2 Về chế chống oxy hoá cao chiết chè đắng Như trình bày stress oxy hố sản sinh gốc tự ROS, NOS, gốc tích tụ vượt q khả trung hồ tế bào gây rối loạn chức ty thể, đột biến gen Việc sản xuất ROS đặc điểm rối loạn thần kinh Các gốc oxy hố chứng minh đóng vai trị quan trọng sinh lý bệnh, tiến triển mức độ nghiêm trọng bệnh Alzheimer, Parkinson Huntington, ASD chứng xơ cứng teo Ngoài ra, bệnh nhân ASD dễ bị stress oxy hoá dễ bị tổn thương qua trung gian ROS nhiễm độc tế bào thần kinh Tự kỷ kết tương tác yếu tố di truyền, môi trường miễn dịch với stress oxy hoá Các phương pháp đánh giá khả dọn gốc tự in vitro bước để nghiên cứu chế phân tử Trong đó, DPPH phương pháp cổ điển thường quy để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất có tiềm Kết thu hình 3.8 cho thấy giá trị IC50 mẫu cao chiết cao chiết chè đắng 295,4 µg/ml (245,6 – 362,4 µg/ml) Hoạt tính dọn gốc tự DPPH mẫu cao chiết chè đắng đạt cao 500 µg/ml, đạt 72,2% Hoạt tính dọn gốc DPPH chè đắng chứng minh nghiên cứu giới Trong nghiên cứu khả chống oxy hoá chè đắng Liu cộng sự, giá trị IC50 mẫu cao chiết chè đắng phân đoạn chiết với ethyl acetat, butanol, nước 265 µg/ml; 315 µg/ml; 892 µg/ml [28] So sánh với giá trị IC50 này, giá trị 56 IC50 nghiên cứu cao Điều giải thích khác biệt dung mơi chiết xuất Superoxide (O2-) hình thành sản phẩm phụ q trình chuyển hố oxy bình thường Phân tử tương tự loại phân tử oxy khác, đóng vai trị quan trọng đường truyền tín hiệu tế bào cân nội mơ Tuy nhiên tích tụ superoxide gây hại cho cấu trúc tế bào, thúc đẩy q trình oxy hố Superoxide chuyển thành hydrogen peroxide (H2O2) enzym superoxide dismutases (SODs) Sự diện H2O2 gây độc cho tế bào qua màng tế bào làm hỏng DNA Superoxide trực tiếp tham gia peroxide hóa lipid [32] Kết từ hình 3.9 cho thấy hoạt tính dọn gốc superoxide cao chiết chè đắng tăng lên rõ rệt tăng nồng độ Giá trị IC50 tớnh c l 136,6 àg/ml (108,0 ữ 169,0 àg/ml) Cả hai phương pháp cho thấy cao chiết chè đắng chứa chất chống oxy hoá tiềm năng, có khả dọn gốc DPPH superoxide hiệu Não dễ bị tổn thương stress oxy hoá khả chống oxy hoá hạn chế, yêu cầu lượng, lượng lipid sắt não cao Não có khối lượng khoảng 2% thể tiêu thụ khoảng 20% lượng trao đổi chất Phần lớn lượng sử dụng cho tế bào thần kinh Do vậy, nồng độ glutathion giảm, khả giải độc gốc ROS giảm dẫn đến tế bào thần kinh nơi bị ảnh hưởng Các chất chống oxy hố vơ cần thiết cho tồn tế bào thần kinh giai đoạn phát triển ban đầu Trẻ em dễ bị stress oxy hố người lớn nồng độ glutathion có thể thấp Từ kết nghiên cứu, thấy nồng độ GSH não chuột lô sinh lý cao đạt ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh lý Điều cho thấy acid valproic làm suy giảm nồng độ GSH não chuột Kết tương đồng với kết nghiên cứu trước Gonzales-Fraguela đồng nghiệp chứng minh bệnh nhân tự 57 kỷ, nồng độ malonyldialdehyd (MDA), 8-hydroxy-2-deoxyguanosin (8OHdG), GSH giảm [16] Khi dùng cao chiết chè đắng cho thấy cải thiện nồng độ GSH não chuột chứng nồng độ GSH lô chuột tự kỷ điều trị cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg thể trọng cao có ý nghĩa thống kê so với lơ bệnh lý Từ kết này, nhận thấy cao chiết chè đắng có tác dụng việc ức chế q trình stress oxy hố thơng qua dọn dẹp gốc tự DPPH superoxide, ức chế giảm GSH, bảo vệ tế bào thần kinh qua cải thiện triệu chứng hội chứng tự kỷ 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ kết nghiên cứu đề tài, rút kết luận sau: - Cao chiết chè đắng có tác dụng cải thiện số hành vi cốt lõi hội chứng tự kỷ mơ hình chuột tự kỷ gây muối natri valproat tăng tương tác cộng đồng, giảm lo âu cải thiện nhận thức Tác dụng cải thiện lo âu: Cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg làm tăng thời gian khám phá cánh mở Tác dụng cải thiện tương tác cộng đồng: Cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg làm tăng tỷ lệ chuột phát âm, tăng thời gian phát âm thử nghiệm sóng siêu âm tăng thời gian khám phá hộp có chuột đồng giới thử nghiệm ba buồng Tác dụng cải thiện nhận thức: Cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg làm tăng thời gian khám phá đồ vật - Cơ chế tác dụng cao chiết chè đắng hội chứng tự kỷ phần liên quan đến khả chống oxy hố thơng qua ức chế hoạt tính dọn gốc DPPH, superoxide, ức chế giảm glutathion não chuột Giá trị IC50 tính cao chiết chè đắng hoạt tính dọn gốc DPPH 295,4 μg/ml (245,6 ÷ 362,4 μg/ml) Giá trị IC50 tính cao chiết chè đắng hoạt tính dọn gốc 295,4 μg/ml (245,6 ÷ 362,4 μg/ml) Cao chiết chè đắng liều 270 mg/kg 540 mg/kg có tác dụng ức chế giảm glutathion não chuột 59 Kiến nghị: Từ kết thu đưa số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu sâu chế phân tử tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ mơ hình động vật thực nghiệm: chế tác dụng liên quan đến hệ glutamat, adrenergic… - Đánh giá độc tính sinh sản cao chiết chè đắng 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bản (1999), "Tên khoa học chè đắng Việt Nam", Tạp chí Sinh học, số 21, tr.1-3 Nguyễn Thị Dung, Bùi Thị Bằng, Hoàng Thị Lệ, Nguyễn Thượng Dong, Nông Văn Hải, Nguyễn Minh Châu, Nguyễn Văn Tài (2001), "Nghiên cứu định tính, định lượng số nhóm chất chè đắng (Ilex kaushue S.Y Hu)", Tạp chí dược liệu, số 1, tr 2-6 Đặng Thị Mai Huy (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học chè đắng (Ilex kaushue S Y Hu), Đại học Dược Hà nội Nông Thị Nga (2003), Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp thay đổi hàm lượng cholesterol máu dịch chiết chè đắng Bệnh viện điều dưỡng phục hồi chức tỉnh Thái Nguyên, Trường Đại học Y dượcĐại học Thái Nguyên Nguyễn Thanh Sơn (2001), "Nghiên cứu tác dụng dịch chiết chè đắng nhiễm độc 2,4 D động vật thực nghiệm", Nội san Khoa học, tr Tiếng Anh 10 11 12 Akerboom Theodorus PM , Sies Helmut (1981), "[48] Assay of glutathione, glutathione disulfide, and glutathione mixed disulfides in biological samples", Methods in enzymology, Elsevier, pp 373-382 Antunes M , Biala G (2012), "The novel object recognition memory: neurobiology, test procedure, and its modifications", Cogn Process 13 (2), pp 93-110 Bahmani M., Sarrafchi A., Shirzad H , Rafieian-Kopaei M (2016), "Autism: Pathophysiology and Promising Herbal Remedies", Curr Pharm Des 22 (3), pp 277-285 Baillargeon Renée , Graber Marcia (1988), "Evidence of location memory in 8-month-old infants in a nonsearch AB task", Developmental Psychology 24 (4), pp 502 Baron-Cohen Simon, Lombardo Michael V., Auyeung Bonnie, Ashwin Emma, Chakrabarti Bhismadev , Knickmeyer Rebecca (2011), "Why Are Autism Spectrum Conditions More Prevalent in Males?", PLOS Biology (6), pp e1001081 Bondet V, Brand-Williams W , Berset CLWT (1997), "Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method", LWT-Food Science and Technology 30 (6), pp 609-615 Braidy Nady, Behzad Sahar, Habtemariam Solomon, Ahmed Touqeer, Daglia Maria, Nabavi Seyed Mohammad, Sobarzo-Sanchez Eduardo , 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Nabavi Seyed Fazel (2017), "Neuroprotective Effects of Citrus Fruit-Derived Flavonoids, Nobiletin and Tangeretin in Alzheimer's and Parkinson's Disease" Chauhan Abha , Chauhan Ved (2006), "Oxidative stress in autism", Pathophysiology 13 (3), pp 171-181 Crawley J N (2007), "Mouse behavioral assays relevant to the symptoms of autism", Brain Pathol 17 (4), pp 448-459 Felix-Ortiz A C , Tye K M (2014), "Amygdala inputs to the ventral hippocampus bidirectionally modulate social behavior", J Neurosci 34 (2), pp 586-595 Ghanizadeh A, Akhondzadeh S, Hormozi M, Makarem A, Abotorabi-Zarchi M , Firoozabadi A (2012), "Glutathione-related factors and oxidative stress in autism, a review", Current medicinal chemistry 19 (23), pp 4000-4005 Gould Todd D, Dao David T , Kovacsics Colleen E (2009), "The open field test", Mood and anxiety related phenotypes in mice, pp 1-20 Gunaydin L A., Grosenick L., Finkelstein J C., Kauvar I V., Fenno L E., Adhikari A., Lammel S., Mirzabekov J J., Airan R D., Zalocusky K A., Tye K M., Anikeeva P., Malenka R C , Deisseroth K (2014), "Natural neural projection dynamics underlying social behavior", Cell 157 (7), pp 1535-1551 Hitti F L , Siegelbaum S A (2014), "The hippocampal CA2 region is essential for social memory", Nature 508 (7494), pp 88-92 Ivanov Hristo Y, Stoyanova Vili K, Popov Nikolay T , Vachev Tihomir I (2015), "Autism spectrum disorder-a complex genetic disorder", Folia medica 57 (1), pp 19-28 Kalueff A V., Stewart A M., Song C., Berridge K C., Graybiel A M , Fentress J C (2016), "Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience", Nat Rev Neurosci 17 (1), pp 45-59 Kas M J., Glennon J C., Buitelaar J., Ey E., Biemans B., Crawley J., Ring R H., Lajonchere C., Esclassan F., Talpos J., Noldus L P., Burbach J P , Steckler T (2014), "Assessing behavioural and cognitive domains of autism spectrum disorders in rodents: current status and future perspectives", Psychopharmacology (Berl) 231 (6), pp 1125-1146 Kataoka S., Takuma K., Hara Y., Maeda Y., Ago Y , Matsuda T (2013), "Autism-like behaviours with transient histone hyperacetylation in mice treated prenatally with valproic acid", Int J Neuropsychopharmacol 16 (1), pp 91-103 Kim J Y., Jeong H Y., Lee H K., Yoo J K., Bae K , Seong Y H (2011), "Protective effect of Ilex latifolia, a major component of "kudingcha", against transient focal ischemia-induced neuronal damage in rats", J Ethnopharmacol 133 (2), pp 558-564 Kim Ji-Woon, Seung Hana, Kwon Kyung Ja, Ko Mee Jung, Lee Eun Joo, Oh Hyun Ah, Choi Chang Soon, Kim Ki Chan, Gonzales Edson Luck, You Jueng Soo, Choi Dong-Hee, Lee Jongmin, Han Seol-Heui, Yang Sung Min, 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Cheong Jae Hoon, Shin Chan Young , Bahn Geon Ho (2014), "Subchronic Treatment of Donepezil Rescues Impaired Social, Hyperactive, and Stereotypic Behavior in Valproic Acid-Induced Animal Model of Autism", PLOS ONE (8), pp e104927 Komada Munekazu, Takao Keizo , Miyakawa Tsuyoshi (2008), "Elevated plus maze for mice", JoVE (Journal of Visualized Experiments)(22), pp e1088 Le Thi Vui, Chu Thi Thuy Quynh, Le Bich Ngoc, Duong Minh Duc, Thanh Ngoc Minh, Pham Van Tac, Minas Harry , Bui Thi Thu Ha (2019), "Prevalence of autism spectrum disorders and their relation to selected sociodemographic factors among children aged 18–30 months in northern Vietnam, 2017", International journal of mental health systems 13 (1), pp 1-9 Liu Lixiang, Sun Yi, Laura Tanguy, Liang Xingfei, Ye Hong , Zeng Xiaoxiong (2009), "Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of kudingcha made from Ilex kudingcha CJ Tseng", Food chemistry 112 (1), pp 35-41 Lord Catherine, Elsabbagh Mayada, Baird Gillian , Veenstra-Vanderweele Jeremy (2018), "Autism spectrum disorder", The Lancet 392 (10146), pp 508-520 Mirza Roohi , Sharma Bhupesh (2019), "Benefits of Fenofibrate in prenatal valproic acid-induced autism spectrum disorder related phenotype in rats", Brain research bulletin 147, pp 36-46 Nicolini C , Fahnestock M (2018), "The valproic acid-induced rodent model of autism", Exp Neurol 299 (Pt A), pp 217-227 Nimse Satish Balasaheb , Pal Dilipkumar (2015), "Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms", RSC Advances (35), pp 27986-28006 Nishimura K, T.Miyase (1999), "Triterpenoid Saponins from Ilex kudincha", Journal of Natural Products 62 (8), pp 1128-1133 Okuyama Teruhiro, Kitamura Takashi, Roy Dheeraj S., Itohara Shigeyoshi , Tonegawa Susumu (2016), "Ventral CA1 neurons store social memory", Science 353 (6307), pp 1536 Robak J , Gryglewski R J (1988), "Flavonoids are scavengers of superoxide anions", Biochem Pharmacol 37 (5), pp 837-841 Rodgers RJ , Dalvi Allan (1997), "Anxiety, defence and the elevated plusmaze", Neuroscience & Biobehavioral Reviews 21 (6), pp 801-810 Sandhya T., Sowjanya J , Veeresh B (2012), "Bacopa monniera (L.) Wettst ameliorates behavioral alterations and oxidative markers in sodium valproate induced autism in rats", Neurochem Res 37 (5), pp 1121-1131 Schneider Tomasz , Przewłocki Ryszard (2005), "Behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: animal model of autism", Neuropsychopharmacology 30 (1), pp 80-89 39 40 41 42 43 44 Silverman J L., Tolu S S., Barkan C L , Crawley J N (2010), "Repetitive self-grooming behavior in the BTBR mouse model of autism is blocked by the mGluR5 antagonist MPEP", Neuropsychopharmacology 35 (4), pp 976989 Wohr M (2014), "Ultrasonic vocalizations in Shank mouse models for autism spectrum disorders: detailed spectrographic analyses and developmental profiles", Neurosci Biobehav Rev 43, pp 199-212 Yang Mu, Silverman Jill L , Crawley Jacqueline N (2011), "Automated three‐chambered social approach task for mice", Current protocols in neuroscience 56 (1), pp 8.26 21-28.26 16 Pangrazzi Luca, Balasco Luigi , Bozzi Yuri (2020), "Oxidative stress and immune system dysfunction in autism spectrum disorders", International journal of molecular sciences 21 (9), pp 3293 Wagner George C, Reuhl Kenneth R, Cheh Michelle, McRae Paulette , Halladay Alycia K (2006), "A new neurobehavioral model of autism in mice: pre-and postnatal exposure to sodium valproate", Journal of autism and developmental disorders 36 (6), pp 779-793 Zhu L., et (1994), "The cardiovascular pharmacological research on Kudingcha", J Chin Med Master 17, pp 558-564 ... cứu Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ chế liên quan đến tác dụng chống oxy hoá cao chiết chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) Đánh giá tác dụng cải thiện Đánh giá khả chống oxy hội chứng. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÝ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN HỘI CHỨNG TỰ KỶ VÀ CƠ CHẾ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ ĐẮNG (ILEX. .. Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ cao chiết chè đắng 39 3.1.1 Đánh giá tác dụng tăng tương tác cộng đồng 39 3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện lo âu 45 3.1.3 Đánh giá tác