Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ một số nấm dược liệu quý đề tài nghiên cứu khoa học khoa học

đã được Trần Quốc Tuấn và cs 2014 [4] khảo sát và chỉnh sửa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thu nhận cao chiết từ sinh khối của 5 nấm dược liệu gồm linh chi,

Mẫu IUH1521

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ một

số nấm dược liệu quý

Mã số đề tài: 171.4231

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lâm Khắc Kỷ

Cố vấn đề tài: TS Đinh Minh Hiệp

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm

TP.HỒ CHÍ MINH, 2018

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi chân thành gởi cám ơn đến BGH Trường ĐHCN TPHCM cùng toàn

thể các phòng ban chức năng đã hỗ trợ mọi điều kiện pháp lý, kinh phí cũng như trang

thiết bị phòng thí nghiệm để chúng tôi hoàn thành đề tài này

Chúng tôi cũng gởi lời cám ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Viện CNSH-TP, tập

thể thầy cô của Viện cũng như các em sinh viên CNSH K10 đã đồng hành cùng chúng

tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án

Chúng tôi cũng không quên gởi lời tri ân đến TS Đinh Minh Hiệp và bộ môn

Hóa sinh thuộc ĐH TN, ĐH Quốc Gia TPHCM đã cố vấn và hỗ trợ về chuyên môn

cho sự thành công của đề tài

Trân trọng

PHẦN 1 THÔNG TIN CHUNG

I Thông tin tổng quát

1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ một số nấm dƣợc liệu quý

1.2 Mã số: 171.4231

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Họ và tên

(học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 Th.S Lâm Khắc Kỷ Viện Công nghệ Sinh

1.5 Thời gian thực hiện:

 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 4 năm 2017 đến tháng 4 năm 2018

 1.5.2 Gia hạn (nếu có): từ tháng 4 năm 2018 đến tháng 7 năm 2018

 1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 4 năm 2017 đến tháng 7 năm 2018

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện;

Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt của đề tài: 40 triệu đồng

II Kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề:

Nấm dược liệu từ lâu đã được thu nhận và sử dụng trên thế giới làm nguồn dược liệu Ở Việt Nam, một số nấm dược liệu cũng đã được sử dụng từ lâu nhưng chủ yếu là theo kinh nghiệm y học dân tộc Gần đây, các nhà khoa học ở Việt Nam đã bắt đầu thu nhận, phân lập, nuôi trồng và tiến hành nghiên cứu các hợp chất sinh học có hoạt tính từ nấm dược liệu nhằm chủ động tạo ra nguồn nguyên vật liệu quý trong nước cũng như có những sản phẩm có giá trị phục vụ cho sức khỏe cộng đồng Các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng sinh, kháng phân bào đã được đề cập ở một số nghiên cứu, tuy nhiên hiện vẫn chưa có nghiên cứu công bố về khả năng kháng viêm Dựa trên mô hình in vitro Bovine serum albumin (BSA) là mô hình nghiên cứu khả năng bảo vệ sự biến tính protein - albumin bởi nhiệt theo Mizushima và Kobayashi (1968),

đã được Trần Quốc Tuấn và cs (2014) [4] khảo sát và chỉnh sửa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thu nhận cao chiết từ sinh khối của 5 nấm dược liệu gồm linh chi, vân chi, thượng hoàng, hầu thủ và trùng thảo [1][3] theo các dung môi có độ phân cực giảm dần để phân lập riêng các hợp chất có trong nấm theo từng nhóm dựa vào khả năng phân cực của chúng Sau đó, chúng tôi tiến hành sàng lọc tính kháng viêm in vitro theo phương pháp BSA để tìm ra phân đoạn cao có tính kháng viêm cao nhất Từ đó, theo phương pháp phân tích Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)[5] chúng tôi xác định các hợp chất đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện khả năng kháng viêm tiềm năng của mỗi loại nấm

2 Mục tiêu:

- Chiết 5 cao tổng và 20 cao phân đoạn từ 5 chủng nấm linh chi, vân chi, thượng hoàng, hầu thủ và đông trùng hạ thảo

- Khảo sát các mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro để chọn mô hình

ổn định và phù hợp với điều kiện tại chỗ

- Áp dụng mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro đối với 25 cao chiết

thu được

- Phân tích LC/MS để xác định các hợp chất có trong phân đoạn cao có tính kháng

viêm in vitro cao nhất

3 Phương pháp nghiên cứu

 Thu cao chiết tổng theo phương pháp chiết ngấm kiệt của Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007

 Thu cao chiết phân đoạn theo phương pháp chiết lỏng- lỏng của Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007

 Nghiên cứu tính kháng viêm in vitro theo phương pháp sự biến tính protein -

albumin theo Mizushima và Kobayashi (1968) có một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm theo công bố của Trần Quốc Tuấn và cs 2014

 Phân tính định tính các hợp chất có trong phân đoạn có tính kháng viêm cao nhất theo kỹ thuật sắc ký phối phổ LC/MS

4 Tổng kết về kết quả nghiên cứu

4.1 Thu cao tổng

Thu được 5 cao tổng của 5 nấm dược liệu gồm Linh chi, Vân chi, Thượng Hoàng, Hầu thủ và Trùng thảo với hiệu suất chiết cao tổng của Thượng Hoàng là cao nhất 18,08 ± 2,32

4.2 Thu cao phân đoạn

Sử dụng các dung môi từ không phân cực đến phân cực ethanol (EtOH), petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)) để thu 20 cao phân đoạn của 5 nấm và kết quả là cao PE của nấm Trùng thảo có hiệu suất cao nhất 59,39

± 5,74, kế đến là cao EtOAc của nấm Linh chi có hiệu suất là 37,00 ± 2,77

4.3 Kết quả IC 50 thể hiện khả năng bảo vệ biến tính Albumin bởi nhiệt

(Tính kháng viêm in vitro) của 5 cao tổng

Nấm Vân chi Thƣợng hoàng Hầu thủ Linh chi Cordycpes

Takaomontana

Giá trị

IC50 1167,48 911,79 7,07 1084,88 12,87 - 215.666

Theo kết quả thu được, cao tổng của trùng thảo có khả năng kháng viêm in vitro

cao nhất

4.4 Kết quả IC 50 thể hiện khả năng bảo vệ biến tính Albumin bởi nhiệt

(Tính kháng viêm in vitro) của 20 cao phân đoạn

4.5 Phân tích các hợp chất có trong cao tổng của trùng thảo (cao có khả

năng kháng viêm in vitro cao nhất)

Theo kết quả phân tích Sắc kí đồ MS – ESI của phỏng phân tích ĐH KH tự nhiên tìm thấy trong cao tổng của Trùng Thảo cho thấy tại thởi gian lưu phút 18.2 đến 19.1 thu được phân đoạn 2’Deoxyadenosin, thởi gian lưu phút 20.5 đến phút 21.4 thu được

phân đoạn Adenosin và tại thời gian lưu phút 21.9 đến phút 22.4 là Cordycepins là những hợp chất có tính kháng viêm theo công bố của Zhou X (2008)

5 Đánh giá các kết quả đã đạt đƣợc và kết luận

Chúng tôi đã tiến hành thu 5 cao tổng và 20 cao phân đoạn để khoanh vùng các hợp chất có tính phân cực tăng dần ở 5 loại nấm dược liệu được dùng phổ biến hiện nay Chúng tôi cũng đã nghiên cứu tính kháng viêm của 25 cao chiết từ 5 nấm dược liệu để xác định được phân đoạn cao chiết có tính khàng viêm cao nhất là cao tổng của

nấm trùng thảo Cordyceps takaomontana

Chúng tôi cũng tiến hành phân tích các hợp chất có trong phân đoạn cao trùng thảo có tính kháng viêm cao nhất dựa vào kỹ thuật LC/MS và đã giải thích được lý do tại sao phân đoạn đó có khả năng kháng viêm cao nhất vì chúng chứa các hợp chất đã được xác định là có tính kháng viêm bao gồm 2’Deoxyadenosin, Adenosin à Cordycepins

Kết luận có tính khoa học, tính ứng dụng cao và tính mới của chúng tôi là để nghiên cứu tạo ra sản phẩm chức năng có khả năng kháng viêm cao từ nấm dược liệu đang dùng đại trà trên thị trường, chúng ta nên sử dụng nguyên liệu là nấm Trùng thảo đang được nuôi trồng tại Việt Nam Kết quả này là động lực cho các nhà sản xuất trong nước chủ động nguồn khai thác nguyên liệu cũng như chế biến trong nước và hạn chế sự khai thác bừa bãi, phá hoại nguồn gen quí hiếm của nấm đông trùng hạ thảo tại Việt Nam

6 Tóm tắc kết quả

ABTRACT

Medical mushroom, Trametes versicolor; Hericium erinaceus; Phellinus linteus;

Ganoderma lucidum and Cordyceps takaomontana, are well known as herbal medicines in

Vietnam due to their anti-inflammatory activity However, the scientific publications examining the functional compounds extracted from these medical mushrooms remain limited In this study, we used non-polar and polar solvent such as ethanol (EtOH), petroleum ether (PE) , ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH) to obtain different substances from each medical mushroom We first identify the extraction efficiency from each mushroom by

comparing the ultimate product yielded from each mushroom Next, we investigated the in

vitro anti-inflammatory activity of these substances by denaturizing albumin protein Our

results showed that Trametes versicolor yielded the highest extraction efficiency with 64.17%

following by Phellinus linteus The anti-inflammatory property of Cordyceps Takaomontana

was highest with inhibitory capacity of 96.17% at concentration of 500 μg / ml and IC50

value of 197,17 μg / ml Altogether, our study provided a step further to the understanding of

anti-inflammatory activity effect of these medical mushrooms in human

Từ khóa: Functional compounds extracted, Cordyceps takaomontana, BSA (Bovine serum

albumin)

TÓM TẮT

Hiện nay, nấm dược liệu đang được khai thác và sử dụng rất nhiều trong nước cũng như trên

thế giới, tuy nhiên vẫn còn chưa có nhiều công bố khoa học xác định đúng giá trị ảnh hưởng

của từng loại nấm đối với sức khỏe con người, trong đó có tác dụng kháng viêm vốn dĩ rất cần

thiết cho một nước có tình trạng viêm nhiễm cao so với thế giới như Việt Nam [2] Trong nội

dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành chiết các cao phân đoạn từ những mẫu nấm dược

liệu được nuôi trồng tại Việt Nam: Vân chi (Trametes versicolor); Hầu thủ (Hericium

erinaceus); Thượng hoàng (Phellinus linteus); Linh Chi đỏ (Ganoderma lucidum) và Đông

trùng hạ thảo (Cordyceps takaomontana) với phương pháp chiết ngấm kiệt và phương pháp

chiết lỏng – lỏng với các dung môi từ không phân cực đến phân cực ethanol (EtOH),

petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)) và so sánh hiệu suất chiết

cao phân đoạn giữa các nấm Sau đó, tiến hành khảo sát khả năng kháng viêm in vitro của các

cao chiết này theo phương pháp gây biến tính protein- albumin Kết quả thu được như sau: 1)

Hiệu suất chiết cao phân đoạn của nấm Vân Chi là cao nhất đạt 64,17% 2) Nấm có hoạt tính

kháng viêm là nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps Takaomontana) ở cao tổng có khả năng ức

chế 96,168% ở nồng độ 500 µg/ml đạt giá trị IC50= 197,17 µg/ml

Từ khóa: Cao chiết, Cordyceps takaomontana, BSA (Bovine serum albumin)

III BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIỆN CỨU KHOA HỌC

3.1 Kết quả nghiên cứu ( sản phẩm dạng 1,2,3)

TT Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu

kinh tế - kỹ thuật Đăng ký Đạt đƣợc

1 Cao chiết từ các loại nấm

dược liệu được xác định

khả năng kháng viêm

15-25 cao tổng và cao phân đoạn của các nấm (Linh chi, Vân chi, Thượng hoàng,

Hầu thủ, trùng thảo)

Thu được 25 cao và xác định khả năng kháng

viêm in vitro của từng

loại cao chiết

2 Qui trình chiết cao áp

dụng vào chương trình

giảng dạy đại học

Qui trình chiết cao có thuyết minh

Qui trình chiết cao có thuyết minh và áp dụng trong đồ án tốt nghiệp đại học tại trường

3 Bài báo khoa học đăng

trên tạp chí trường

Bài báo khoa học đăng trên tạp chí trường

Đã gởi bài báo khoa học

có tên:” Insight into inflammatory in vitro

anti-activity of functional compounds extracted

- Các ấn phẩm(bản photo)đính kèm trongphần phụ lục minh chứng ở cuối báo cáo (đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang cuối kèm thông tin quyết định và số hiệu xuất bản)

3.2.Kết quả đào tạo

Sinh viên Đại học

Luận văn tốt nghiệp

Đại học (4 Sinh viên)

10/2017 – 4/2018 Khảo sát khả năng kháng viêm

in vitro của cao tổng và cao phân đoạn nấm Cordyceps takaomontana

Đã bảo

vệ đạt loại Giỏi

Luận văn tốt nghiệp

Đại học (4 sinh viên)

10/2017 – 4/2018 Khảo sát tính kháng viêm in

vitro cao tổng và cao phân

đoạn các nấm dược liệu(vân chi, thượng hoàng, hầu thủ)

Đã bảo

vệ đạt loại Giỏi

Ghi chú:

- Kèm bản photo trang bìa chuyên đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận và

bằng/giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đã bảo vệ thành công

luận án/ luận văn;( thể hiện tạiphần cuối trong báo cáo khoa học)

IV TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ

T

Kinh phí đƣợc duyệt

(triệu đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu

đồng)

Ghi chú

Dựa theo kết quả đã đạt được ở đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu hoạt tính kháng

viêm của cao chiết từ một số nấm dược liệu quý”, chúng ta có thể tiếp tục nuôi cấy

trùng thảo cordyceps takamotana và tiến hành nghiên cứu sâu hơn về khả năng

kháng viêm của chúng trên mô hình in vivo cũng như thử nghiệm lâm sàng, tiến tới

thu sản xuất các dạng thực phẩm chức năng phục vụ cộng đồng

VI PHỤ LỤC (liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

1 Bài báo “Insight into anti-inflammatory in vitro activity of functional compounds extracted from Trametes versicolor; Hericium erinaceus; Phellinus linteus; Ganoderma lucidum and Cordyceps takaomontana

cultivated in Vietnam

2 Khóa luận sinh viên tốt nghiệp:

Đồ án 1:”Khảo sát khả năng kháng viêm in vitro của cao tổng và cao phân đoạn nấm Cordyceps takaomontana

Đồ án 2: Khảo sát tính kháng viêm in vitro cao tổng và cao phân đoạn các nấm dược liệu(vân

chi, thượng hoàng, hầu thủ)

3 Qui trình chiết cao ứng dụng trong giảng dạy môn thực tập chuyên đề Hóa sinh – sinh học phân tử các lớp DHSH10 DHSH11

4 25 mẫu cao chiết của các nấm vân chi, linh chi, hầu thủ, thượng hoàng và đông trùng

hạ thảo

Tp HCM, ngày tháng năm

Chủ nhiệm đề tài Phòng QLKH&HTQT Trưởng (đơn vị)

(Họ tên, chữ ký)

PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

2.1 Đặt vấn đề:

Nấm dược liệu từ lâu đã được thu nhận và sử dụng trên thế giới làm nguồn dược liệu Ở Việt Nam, một số nấm dược liệu cũng đã được sử dụng từ lâu nhưng chủ yếu là theo kinh nghiệm y học dân tộc Gần đây, các nhà khoa học ở Việt Nam đã bắt đầu thu nhận, phân lập, nuôi trồng và tiến hành nghiên cứu các hợp chất sinh học có hoạt tính từ nấm dược liệu nhằm chủ động tạo ra nguồn nguyên vật liệu quý trong nước cũng như có những sản phẩm có giá trị phục vụ cho sức khỏe cộng đồng Các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng sinh, kháng phân bào đã được đề cập ở một số nghiên cứu, tuy nhiên hiện vẫn chưa có nghiên cứu công bố về khả năng kháng viêm Dựa trên mô hình in vitro Bovine serum albumin (BSA) là mô hình nghiên cứu khả năng bảo vệ sự biến tính protein - albumin bởi nhiệt theo Mizushima và Kobayashi (1968),

đã được Trần Quốc Tuấn và cs (2014) [4] khảo sát và chỉnh sửa phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành thu nhận cao chiết từ sinh khối của 5 nấm dược liệu gồm linh chi, vân chi, thượng hoàng, hầu thủ và trùng thảo [1][3] theo các dung môi có độ phân cực giảm dần để phân lập riêng các hợp chất có trong nấm theo từng nhóm dựa vào khả năng phân cực của chúng Sau đó, chúng tôi tiến hành sàng lọc tính kháng viêm in vitro theo phương pháp BSA để tìm ra phân đoạn cao có tính kháng viêm cao nhất Từ đó, theo phương pháp phân tích Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)[5] chúng tôi xác định các hợp chất đóng vai trò quan trọng trong việc biểu hiện khả năng kháng viêm tiềm năng của mỗi loại nấm

2.2 Mục tiêu:

- Chiết 5 cao tổng và 20 cao phân đoạn từ 5 chủng nấm linh chi, vân chi, thượng hoàng, hầu thủ và đông trùng hạ thảo

- Khảo sát các mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro để chọn mô hình

ổn định và phù hợp với điều kiện tại chỗ

- Áp dụng mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro đối với 25 cao chiết

thu được

- Phân tích LC/MS để xác định các hợp chất có trong phân đoạn cao có tính kháng

viêm in vitro cao nhất

2.3 Các phương pháp sử dụng

2.3.1 Phương pháp chiết ngấm kiệt

Quy trình chiết cao dựa trên phương pháp chiết ngấm kiệt của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) [2] Bột dược liệu được ngâm trong dung môi cồn 960 để ly trích các hợp chất ra khỏi dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt Cồn có khả năng hòa tan các chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng hòa tan các chất phân cực bằng cách tạo nối hydro

Ngấm kiệt là phương pháp chiết xuất bằng cách cho dung môi chảy chậm qua khối dược liệu chứa trong bình ngấm kiệt Quá trình chiết xuất không có khuấy trộn

Nguyên tắc: Khi cho cồn vào bột dược liệu dưới tác dụng của trọng lực, dung môi sẽ chảy xuống các khe hở Trong thời gian cồn được giữ lại và tiếp xúc với dược liệu, các hoạt chất sẽ được kéo lên Sau đó thêm cồn mới lên mặt khối dược liệu, lớp dung môi này ngấm vào trong dược liệu và đẩy dịch chiết (lớp dung môi cũ đã hòa tan dược chất) ra ngoài Lớp cồn mới tiếp tục hòa tan hoạt chất còn lại trong tế bào dược liệu Quá trình tiếp diễn cho đến khi các hợp chất được rút ra hoàn toàn

Tiến hành: Xử lý mẫu: quả thể sau khi đem về, được sấy khô và xay thành mảnh có kích thước thô nhỏ hơn 5 mm

Chuẩn bị bình lóng có khóa điều chỉnh bên dưới đáy nhằm mục đích điều chỉnh vận tốc và tạo thành dòng liên tục trong suốt quá trình chiết Bình lóng trước khi sử dụng phải tráng lại với cồn để loại các tạp chất, sau đó cho một lớp bông không thấm xuống đáy bình rồi cắt và cho mẫu giấy lọc có hình dạng và kích thước phù hợp lên trên, tiếp đến cho cồn vào để ổn định hệ thống, cuối cùng kiểm tra hệ thống và van Cân quả thể nấm dược liệu và làm ẩm với cồn 960 trong 1 giờ để sinh khối khô hút dung môi để trương nở hoàn toàn trước khi được chuyển vào bình chiết Cho từ từ quả thể được làm ẩm vào bình (có lót bông ở đáy đã chuẩn bị như trên) từng lớp một, nén nhẹ nhàng và san bằng mặt trên khối dược liệu Đặt một tấm giấy lọc lên trên để dung môi phân bố đều và tránh xáo trộn dược liệu Sau đó, mở van dưới đáy bình, thêm dung môi đến khi không khí thoát ra hết và dịch chiết bắt đầu chảy ra Khóa van lại và thêm tiếp dung môi vói tỉ lệ 1:10, ngâm trong khoảng 48 giờ ở nhiệt độ phòng cho dung môi thấm vào tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên

Mở khóa cho dịch chiết chảy từng giọt vào bình hứng với tốc độ 1 ml/phút, thường xuyên thêm dung môi để ngập mặt dược liệu Lặp lại như vậy nhiều lần đến

khi trong dịch ngấm không còn chứa bất cứ chất nào, thu lấy toàn bộ dịch chiết trong cồn

Tiến hành cô quay áp suất thấp để đuổi cồn, đông khô thu lấy các hợp chất trong nguyên liệu đã hòa tan vào cồn, còn được gọi là cao cồn

…) và dung môi phân cực mạnh (cồn…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức –OH, –COOH…)

Cao cồn ban đầu chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực, sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao cồn ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Tiến hành: Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong đó cao cồn ban đầu được hòa tan vào trong pha nước và đem đánh tan bằng máy đánh siêu âm Sử dụng lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ete (PE), etyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có độ phân cực khác nhau [21] Với mỗi loại dung môi, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi; chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì chuyển sang chiết bằng dung môi có độ phân cực cao hơn Thu các phân đoạn, đem cô quay giảm áp để loại dung môi, tiếp đó đem đông khô Ta thu được 4 phân đoạn cao: cao petroleum ete, cao ethyl acetate, cao butanol và phần dịch lắng còn lại sau cùng là cao nước

Sau khi chiết cao, ta thu nhận được ở mỗi chủng nấm 5 cao chiết như sau: cao tổng (cao cồn), cao PE, cao EtOAc, cao BuOH, cao nước

Mcao: Khối lượng cao chiết (g)

Msk: Khối lượng sinh khối (g)

Mcao cồn: Khối lượng cao cồn sử dụng chiết lỏng lỏng (g)

2.3.3 Phương pháp cô quay

Phương pháp được thực hiện nhằm mục đích loại bỏ nước và các dung môi ra khỏi dịch chiết cao để giảm thể tích tiện cho quá trình bảo quản cũng tiết kiệm cồn 96

ít ảnh hưởng đến hoạt tính của cao chiết

Nguyên tắc: Dựa trên sự hóa hơi của nước trong các điều kiện khác nhau, làm giảm lượng nước trong dịch nuôi cấy nấm

Thực hành: Cô quay 200 ml dịch nuôi cấy nấm ở 50 bằng máy cô quay giảm

áp Buchi Đun cách thủy 200ml dịch nuôi cấy nấm ở 70 bằng bếp đun cách thủy Memmert để loại bỏ dung môi còn lại trong dịch sau cô quay

2.3.4 Khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao chiết nấm dược liệu

Phương pháp thực hiện được dựa trên sự biến tính protein – albumin theo Mizushima và Kobayashi (1968) có một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [4,8,9,19]

Ý nghĩa của phương pháp: Khi tế bào bị tổn thương, các chất trung gian hóa học của quá trình viêm được giải phóng, trong đó Interleukin-1 (IL-1) và Prostagladins (PGs) là hai trung gian hóa học chính gây sốt Nhiệt độ tăng sẽ làm ảnh hưởng đến các liên kết của protein dẫn đến giảm khả năng tương tác với nước Albumin – protein kém bền nhiệt, là một trong những protein đóng vai trò quan trọng trong cơ thể sinh vật và khả năng liên kết với thuốc kháng viêm không steroid (non-steroidal 13ong13inflammatory drug- NSAIDs) Do đó, phương pháp khảo sát khả năng ức chế biến tính albumin này được xem là phương pháp tiêu biểu, đơn giản và dễ thực hiện khi khảo sát khả năng kháng viêm của nguyên liệu dựa trên vai trò cũng như đặc tính của albumin [8],19]

Nguyên tắc: Albumin sau khi tương tác với mẫu sẽ được gây biến tính bởi nhiệt Thông qua khả năng biến tính của albumin, ta có thể kết luận được hoạt tính của cao chiết [10,17,18]

Mô tả thí nghiệm:

Đối tượng: Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin- BSA) pha trong đệm acetate 0,025 M, pH 5,5

Chuẩn bị mẫu: Cao hòa tan với dung dịch Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 5% pha trong đệm acetate 0,025 M, pH 5,5 với dãy nồng độ: 0; 125; 250; 500; 1000; 2000μg/ml

Mẫu chứng dương: 0;25 ;50;100;200;400;500μg/ml

Thí nghiệm được bố trí như trong bảng 2.1

Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm khảo sát tính kháng viêm trênn các mẫu cao chiết

Dung dịch khảo sát Mẫu

thử thật

Mẫu thử không

Chứng dương

Diclofenac với nồng độ tương ứng mẫu khảo sát (ml) 0 0 1 Mỗi mẫu thực hiện ít nhất 3 lần Sau đó ủ ở 37 trong 20 phút, tiếp tục ủ trong

67 trong 3 phút, sau đó làm lạnh dưới vòi nước Đo dung dịch ở bước 14ong 660

nm Ghi lại kết quả

Phần trăm ức chế sự biến tính protein:

% ức chế = [(OD không – OD mẫu ) / OD không ]* 100%

Trong đó:

OD không: giá trị OD của mẫu không

OD mẫu: giá trị OD của mẫu khảo sát và mẫu chứng dương

2.3.5 Phương pháp định tính hợp chất sinh học

Liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS) – Sắc ký lỏng khối phổ

Mass spetrometry là một phương pháp phân tích sử dụng mass spectrometor để xác định hợp chất chưa biết, xác định khối lượng phân tử của nguyên liệu đã biết, suy

ra cấu trúc phân tử, thành phần hoá học của nguyên liệu vô cơ và hữu cơ Mass spectrometor chuyển đổi các thành phần của một hỗn hợp thành ion, sau đó phân tích chúng dựa vào cơ sở m/z (khối lượng/điện tích) của chúng Dữ liệu được tự động ghi lại bởi hệ thống dữ liệu và được giải thích bằng máy tính hoặc thủ công.Tín hiệu chất

sẽ được phát hiện dựa trên sự trùng thời gian lưu Rt giữa hệ thống LC và hệ thống MS, theo đó peak của hợp chất được phát hiện dựa trên sự trùng khớp về thời gian lưu Rt

và số khối MS so với chất chuẩn [5]