Nghiên cứu hoạt tính kháng Aeromonas Hydrophila của chủng Streptomyces nội sinh phân lập từ cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus).pdf

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TÁT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG NGUYEN TAT THANH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHANG AEROMONAS HYDROPHILA CỦA CHỦNG STREPTOMYCES NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HA CHÂU (Phyllanthus amarus) Sinh viên thực : Bùi Lê Phương Quân Chuyên ngành TP.HCM, tháng 08 năm 2018 : Công nghệ sinh học Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẮT THÀNH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG cstĩlBơ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG AEROMONAS HYDROPHILA CỦA CHỦNG STREPTOMYCES NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus) Sinh viên thực : Bùi Lê Phương Quân Mã số sinh viên :1411534153 Lóp : 14DSH02 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyền Hoàng Chương Tp HCM, tháng năm 2018 i LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy TS Nguyễn Hồng Chương, người dìu dắt, truyền đạt kiến thức, niềm dam mê nghiên cứu, giúp đỡ cho em trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành đà tận tình truyền giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức quí báu suốt thời gian theo học trường Cảm ơn bạn bè bạn, Anh/ Chị phịng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh học nhiệt tình giúp đờ, động viên tơi lúc khó khăn thời gian thực đề tài Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, người chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt cho thực ước mơ Tơi xin chân thành cảm ơn! Tác giả Bùi Lê Phương Quân Khoa Công nghệ Sinh học Môi trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT vi SUMMARY vii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC BẢNG X ĐẶT VÁN ĐỀ 1 Tính cấp thiết đề tài 1 Mục đích nghiên cứu CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Tông quan vê xạ khuân 1.1.1 Sơ lược vê xạ khuân 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.2.1 Khuẩn lạc 1.1.2.2 Khuẩn ty 1.1.2.3 Bào tử 1.1.3 Phân loài 1.1.4 Đặc điêm câu tạo cùa xạ khuân 1.2 Xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật dược liệu 1.2.1 Khái niệm xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.2 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội cộng sinh 1.2.3 Khả sinh chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn nội cộng sinh dược liệu 1.2.4 ứng dụng xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật 1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.4 Tống quan Aeromonas hydrophila 11 1.4.1 Sơ lược Aeromonas hydrophila 11 iii 1.4.2 Phân loại khoa học 12 1.4.3 Bệnh học 12 1.5 Giới thiệu Diệp Hạ Châu 14 1.5.1 Phân loại khoa học 14 1.5.2 Đặc điểm hình thái 14 1.5.3 Giá trị y học 15 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.3.2 Phần mềm trang web sử dụng 16 2.3.3 Dụng cụ thiết bị 16 2.3.4 Hóa chất 17 2.3.4.1 Kháng sinh 17 2.3.4.2 Hóa chất khử trùng bề mặt thực vật 17 2.3.4.3 Hóa chất cho phản ứng PCR 17 2.3.4.4 Hóa chất điện di 18 2.3.4.5 Hóa chất giải trình tự nucleotide 18 2.3.5 Môi trường 18 2.3.6 Vi sinh vật kiểm định 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 4.1 Tiến trình nghiên cứu 19 2.4.2 Khai thác dừ liệu 19 2.4.3 Phân lập xạ khuẩn sống nội cộng sinh 20 2.4.4 Bảo quản chủng xạ khuẩn 21 2.4.5 Sàng lọc xạ khuẩn sinh chất kháng khuẩn 21 2.4.6 Định danh chủng xạ khuẩn tiềm phương pháp sinh học phân tử 22 2.4.6.1 Tách chiết DNA .22 2.4.6.2 Thiết lập phản ứng PCR 16S rRNA 22 2.4.Ó.3 Điện di 23 2.4.6.4 Quy trình giải trình tự nucleotide 24 IV 2.4.6.4.1 Tinh sản phẩm PCR 24 2.4.6.4.2 Đo OD 24 2.4.6.5 Hiệu chỉnh sau giải trình tự 26 2.4.6.6 Xây dựng phát sinh chủng loại 26 2.4.7 Phuong pháp khảo sát phổ kháng khuấn 26 2.4.8 Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy 27 2.4.8.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường lên khả sinh chất kháng khuẩn 27 2.4.8.2 Khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn 27 2.4.9 Khảo sát tính bền chất chuyển hóa thứ cấp xạ khuẩn 27 2.4.9.1 Phương pháp khảo sát tính bền nhiệt 27 2.4.9.2 Phương pháp khảo sát tính bền ánh sáng, tia uv 27 2.4.9.3 Phương pháp khảo sát tính bền pH 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết 29 3.1.1 Ket phân lập xạ khuẩn nội sinh từ Diệp Hạ Châu 29 3.1.2 Ket khảo sát hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila cùa chủng xạ khuẩn 29 3.1.3 Ket định danh xạ khuấn 30 3.1.3.1 Kết nhân đoạn 16S rRNA 30 3.1.3.2 Kết hiệu chỉnh trình tự 31 3.1.3.3 Ket xây dựng phát sinh chủng loại 32 3.1.4 Kết khảo sát phổ kháng khuẩn 32 3.1.5 Ket ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh chất kháng khuân.35 3.1.6 Ket khảo sát thời gian sinh chất kháng khuấn 37 3.1.7 Kết khảo sát tính bền 38 3.1.7.1 Khảo sát tính bền với nhiệtđộ 38 3.1.7.2 Khảo sát tính bền với pH 39 3.1.7.3 Khảo sát tính bền với ánh sáng - ƯV 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 50 V TÓM TẢT Aeromonas hydrophiỉa tác nhân gây bệnh hội người gây nhiễm trùng đường ruột ruột, tác nhân gây bệnh động vật dần đến nhiễm trùng cá, động vật lưỡng cư Có nhiều giải pháp, kháng sinh vần nhân tố chủ yếu đế kiếm soát dịch bệnh từ Aeromonas hydrophila Streptomyces nhóm vi khuấn có lợi Hơn 2/3 kháng sinh sử dụng có nguồn gốc từ xạ khuẩn - đặc biệt loài thuộc chi Streptomyces Mặc khác, Diệp Hạ Châu có chứa hoạt chất kháng khuẩn kháng oxy hóa tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Theo nghiên cứu trước đây, hoạt tính sinh học Diệp Hạ Châu vi sinh vật nội sinh tạo ra, đặc biệt nhóm xạ khuẩn, sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học Đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila chung Streptomyces nội sinh phân lập từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus)” thực Trung Tâm Nghiên Cứu ứng Dụng Sinh Học từ 1/2018 đến 7/2018 với mục tiêu tìm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Đe tài gồm nội dung chính: phân lập xạ khuẩn sống nội sinh Diệp Hạ Châu; khảo sát hoạt tính kháng Aeromonas hydrophỉla chủng xạ khuấn; định danh chủng xạ khuấn tiềm phương pháp sinh học phân tử; khảo sát phố kháng khuẩn; khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên xạ khuẩn; khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn; khảo sát tính bền chất chuyển hóa thứ cấp từ xạ khuẩn Những kết đạt sau tháng nghiên cứu: Phân lập chủng xạ khuẩn SS52 kháng Aeromonas hydrophila SS52 có phổ kháng khuấn rộng Định danh phân tử chủng xạ khuẩn SS52 gần với chủng xạ khuẩn Streptomyces rocheỉ Phát thành phần mơi trường khác làm kích hoạt gen sinh loại kháng khuẩn khác xạ khuẩn Xác định xạ khuẩn bắt đầu sinh kháng khuẩn sau 18 nuôi cấy Chất chuyển hóa thứ cấp bền xừ lí yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học VI SUMMARY Aeromonas hydrophila is an opportunistic pathogen in humans that causes intestinal and intestinal infections and is an infectious agent in animals leading to infections in fish and amphibians There are many solutions, but using antibiotics is still a major factor in controlling the disease caused by Aeromonas hydrophila Streptomyces is a group of beneficial bacteria More than two thirds of the antibiotics currently used are derived from the actinomycetes - especially those of the genus Streptomyces Phyllanthus atnarus contains antimicrobial and antioxidant active ingredients that can kill pathogenic bacteria It is assumed that there are endogenous microorganisms in Phyllanthus amarus, especially the group of Streptomyces, which produce biologically active secondary metabolites The thesis entitles: " Researching on the activity of endogenous Streptomyces isolated from Phyllanthus antarus againsts Aerotnonas hydrophila" was conducted at biotechnology laboratory of Center for Researching and Applied Biology from 1/2018 to 7/2018 with the goal is to find the plant secondary compound that has optimal biological activity The thesis includes some main parts such as: Isolating Streptomyces from Phyllanthus amarus; examining whether Streptomyces insolated from Phyllanthus amarus resists with Aeromonas hydrophilcr, identifying potential Streptomyces by molecular biology method; examining of antibacterial spectrum; investigating the effect of culture medium on secondary metabolites; examining the time when secondary metabolites will be created; examining durability of the secondary metabolites from the Streptomyces I spent months doing this research and the results I got from it are: One Streptomyces from Phyllanthus atnarus was isolated by the name SS52 This Streptomyces resisted Aeromonas hydrophila and many bacteria SS52 had highest similarities with Streptomyces rochei On culture medium M3, SS52 created the largest antibacterial circle After 18 hours of culture, SS52 started to create secondary metabolites Secondary metabolites were stable when tested by factors that affect biological activity vii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BLAST The Basic Local Aligement and Search Tool (Cơng cụ tì kiếm giống cột cục bộ) DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ISP Chưong trình Streptomyces Quốc tế NCBI The National Center for Biotchnology Information (Trung tâm Thông tin Quốc gia công nghệ sinh học Mỳ) OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction rRNA 16S 16S ribosomal RNA Streptomyces Xạ khuẩn TAE Tris- Acetate- EDTA TE Tris- EDTA vsv Vi sinh vật viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình Aeromonas hydrophila Hình 1.2 Cây Diệp Hạ Châu Hình 2.1 Sơ đồ tiến trình nghiên cứu Hình 2.2 Chuơng trình phản ứng PCR Hình 3.1 Khuẩn lạc từ Diệp Hạ Châu Hình 3.2 Khảo sát hoạt tính kháng Aeromonas hydrophia Hình 3.3 Kết điện di SS52 Hình 3.4 Biếu đo huỳnh quang mẫu SS52 Hình 3.5 Cây phát sinh lồi Hình 3.6 Khảo sát phổ kháng khuẩn Hình 3.7 Khảo sát ảnh hưởng 10 loại mơi trường Hình 3.8 Biếu đồ ảnh hưởng thời gian sinh chất kháng khuấn Hình 3.9 Khảo sát thời gian sinh chất kháng khuẩn Hình 3.10 Khảo sát bền nhiệt độ Hình 3.11 Khảo sát tính ben pH Hình 3.12 Khảo sát tính bền ánh sáng - uv Hình 3.13 Khảo sát tính ben proteinase K IX ... tính sinh học Đề tài: ? ?Nghiên cứu hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila chung Streptomyces nội sinh phân lập từ Diệp Hạ Châu (Phyllanthus amarus)” thực Trung Tâm Nghiên Cứu ứng Dụng Sinh Học từ. .. NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG cstĩlBơ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG AEROMONAS HYDROPHILA CỦA CHỦNG STREPTOMYCES NỘI SINH PHÂN LẬP TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU (Phyllanthus amarus) Sinh. .. xạ khuấn nội sinh Diệp Hạ Châu - Xác định khả kháng Aeromonas hydrophila chủng Streptomyces nội sinh Diệp Hạ Châu - Nghiên cứu đặc tính sinh chất kháng Aeromonas hydrophila cùa chủng mục tiêu CHƯƠNG