Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất aryl chitooligosaccharide và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh cây trồng trong điều kiện in vitro

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU TÊN TÀI: NGHIÊN CỨU T NG H P D N UẤT AR -CHITOO IGOSACCHARIDE VÀ ÁNH GIÁ HO T T NH HÁNG VI SINH V T GÂ BỆNH CÂ TR NG TRONG I U IỆN IN VITRO CHỦ NHIỆM Ê S NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2015 i TÀI TĨM TẮT Chitooligosacchride (COS) dẫn xuất chất có khả kháng vi sinh vật, kháng nấm bệnh, kháng viêm, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, ức chế enzyme chống oxi hóa Mỗi loại dẫn xuất COS có khả kháng vi sinh vật khác Trong nghiên cứu tiến hành tổng hợp 02 loại dẫn xuất COS đánh giá khả kháng chủng vi khuẩn (Ralstonia sp., Erwinia carotovora) chủng nấm (Fusarium oxysporum, Sclerotium sp.) Các thí nghiệm tiến hành Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Kết tổng hợp 02 loại dẫn xuất gồm: dẫn xuất N-Vanilyl-COS (VCOS) điều kiện thích hợp pH 5,5 nhiệt độ 30oC nồng độ Vanilyl 2% tổng hợp gi dẫn xuất N-Ben zyl COS (BCOS) điều kiện pH 5,5 nhiệt độ 30oC nồng độ Benzyl 2% tổng hợp gi Đã xác định cấu trúc đặc trưng dẫn xuất thông qua phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR) Hai dẫn xuất VCOS BCOS có khả kháng vi sinh vật gây bệnh tốt COS Nồng độ ức chế tối thiểu VCOS BCOS vi khuẩn Erwinia carotovora 20 ppm, vi khuẩn Ralstonia sp 30 ppm ii ABSTRACT Chitooligosaccharide (COS) and its derivatives are substances that are resistant to microbial, anti-fungal, anti-inflammatory, anti-cancer, immune stimulation, enzyme inhibition and antioxidant Each of COS’s derivative resistant various microorganisms In this study, we prepared 02 categories of derivatives COS and evaluated resistance in bacteria (Ralstonia sp., Erwinia carotovora) and fungi strains (Fusarium oxysporum, Sclerotium sp.) The experiments were performed at Research and Development Center for High-Tech Agriculture Results were synthesized 02 kinds of derivatives include: derivatives N-Vanilyl-COS (VCOs) in appropriate conditions are pH 5,5, 30°C and 2% Vanilyl concentration that was synthesized in 12 hours and N-benzyl COS (bcos) derivative at pH 5,5, 30°C and the concentration of Benzyl was 2% that was synthesized in 12 hours The structure of derivatives was identified through infrared spectroscopy (IR), proton magnetic resonance spectrum (1H-NMR) VCOS and BCOS derivatives are resistant pathogenic microorganisms better COS The minimum inhibitory concentration of VCOS and BCOS against Erwinia carotovora is 20 ppm, Ralstonia sp is 30 ppm iii MỤC ỤC Trang TÓM TẮT ii ABSTRACT iii MỤC LỤC iv DANH S CH C C CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH x THÔNG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Chương : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chitosan, chitooligosaccharide 1.1.1 Chitosan 1.1.1.1 Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan 1.1.1.2 Cấu tạo chitosan 1.1.1.3 Độ deacetyl hóa chitosan 1.1.2 Chitooligosaccharide 1.1.2.1 Giới thiệu chitooligosaccharide 1.1.2.2 Các phương pháp thu nhận chitooligosaccharide từ chitosan 1.1.3 Một số dẫn xuất chitosan chitooligosaccharide 1.1.3.1 Dẫn xuất N-alkyl chitosan 1.1.3.2 Dẫn xuất mang điện tích dương cao 10 1.1.3.3 Dẫn xuất acyl chitosan 11 1.1.3.4 Dẫn xuất chitosan-sulfate 14 iv 1.1.3.5 Dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide 15 Chương 2: N I DUNG NGHI N CỨU 27 2.1 Th i gian địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2.2 Hóa chất thí nghiệm 27 2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu điều kiện tổng hợp dẫn xuất aryl- COS 28 2.3 Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng pH lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS28 2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên tổng hợp dẫn xuất arylCOS 29 2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất phản ứng lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS 29 2.3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng th i gian phản ứng lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS 30 2.3.2 Nội dung 2: Xác định đặc trưng cấu trúc sản phẩm tổng hợp 31 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát khả kháng vi sinh vật COS dẫn xuất aryl- COS 32 2.3.3.1 Thí nghiệm : Đánh giá khả kháng khuẩn COS aryl-COS Tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 32 2.3.3.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng COS aryl-COS lên phát triển sợi nấm 32 v 2.3.3.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng COS aryl-COS lên phát triển sinh khối nấm canh trư ng 33 2.4 Phương pháp nghiên cứu 34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 vi DANH SÁCH CÁC CH VI T TẮT cs COS FTIR HTCC pI DD EDC NHS MIC GPC IR H-NMR VCOS BCOS H VI T TẮT THU T NG Cộng Chitooligosacchride Fourrier Transformation InfraRed N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride điểm đẳng điện Deacetylation 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide N-hydroxysuccinimide nồng độ ức chế tối thiểu Gel permeation chromatography phổ hồng ngoại phổ cộng hưởng từ proton N-Vanilyl-COS Benzyl chitooligosaccharide proton vii DANH SÁCH BẢNG S 1.1 2.1 2.2 2.3 2.4 T ả s u Hiệu kiểm soát bệnh trồng oligochitosan (khảo sát Trung Quốc) (Ying cs, 2010) Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH lên tổng hợp dẫn xuất arylCOS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất phản ứng lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng th i gian phản ứng lên tổng hợp dẫn xuất aryl-COS Trang 25 26 27 28 3.1 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS tổng hợp pH khác 32 3.2 Độ thay dẫn xuất VCOS tổng hợp pH khác 33 3.3 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS tổng hợp nhiệt độ khác 34 3.4 Độ thay dẫn xuất VCOS tổng hợp nhiệt độ khác 34 3.5 3.6 3.7 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS tổng hợp tỉ lệ COS:aldehyde khác Độ thay dẫn xuất VCOS tổng hợp tỉ lệ COS:aldehyde khác Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS tổng hợp th i gian khác 35 35 36 3.8 Độ thay dẫn xuất VCOS tổng hợp th i gian khác 36 3.9 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS tổng hợp pH khác 38 viii 3.10 Độ thay dẫn xuất BCOS tổng hợp pH khác 38 3.11 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS tổng hợp nhiệt độ khác 39 3.12 Độ thay dẫn xuất BCOS tổng hợp nhiệt độ khác 39 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS tổng hợp tỉ lệ COS:aldehyde khác Độ thay dẫn xuất BCOS tổng hợp tỉ lệ COS:aldehyde khác Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS tổng hợp với th i gian khác Độ thay dẫn xuất BCOS tổng hợp với th i gian khác Nồng độ ức chế tối thiểu COS aryl-COS lên chủng vi khuẩn Erwinia carotovora, Ralstonia sp 40 40 41 41 48 3.18 Hiệu suất kháng nấm COS nồng độ khác 49 3.19 Hiệu suất kháng nấm N-Benzyl COS nồng độ khác 50 3.20 Hiệu suất kháng nấm N-Vanilyl-COS nồng độ khác 50 3.21 Ảnh hưởng COS aryl-COS lên phát triển sinh khối nấm 51 ix DANH SÁCH HÌNH S 1.1 T Cơng thức cấu tạo Chitin chitosan ả 1.2 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan (Mrunal R Thatte, 2004) 10 1.3 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất amino-chitosan (V.K Mourya cs, 2008) 11 Trang Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-acyl chitosan O-acyl chitosan (V.K 1.4 12 Mourya, 2008) 1.5 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất O-acyl chitosan (Marguerite Rinaudo, 2006) 13 1.6 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất chitosan-sulfate (Inmaculada Aranaz, 2010) 15 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide (Niranjan 1.7 15 Rajapakse, 2006) 2.1 Nguyên liệu COS 24 3.1 Dẫn xuất VCOS 37 3.2 Dẫn xuất BCOS 42 3.3 Phổ hồng ngoại (IR) COS (a), N-vanillyl-COS(b) 43 Phổ cộng hưởng từ proton ( H-NMR) COS (a), vanillin (b) N3.4 3.5 3.6 45 vanillyl-COS (c) Phổ IR BCOS 46 Phổ H-NMR BCOS CD3COOD x 47 Hình 3.3 Phổ IR BCOS t p ổ 1H-NMR 3.2.2.2 Phổ 1H-NMR (hình 3.4) BCOS cho thấy bên cạnh tín hiệu cộng hưởng proton đặc trưng cho COS xuất tín hiệu cộng hưởng nằm khoảng từ 7,41 – 7,91 ppm Hình 3.4 Phổ 1H-NMR BCOS CD3COOD 3.3 Nộ du 3: ảo sát k ả ă k v s vật COS d xuất ary - COS 3.3.1 ức c Bả t ák ả ă k k uẩ COS ary -COS Tính độ t ểu (MIC) 3.17 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) COS aryl-COS lên chủng vi khuẩn Erwinia carotovora, Ralstonia sp Nồ Nồ độ độ ức c t t ểu (MIC) Erwinia carotovora (ppm) Ralstonia sp COS VCOS BCOS 10 0,747±0,049 0,533±0,022 0,482±0,114 0,924±0,0203 0,379±0,0505 0,511±0,044 20 0,719±0,007 0,128±0,042 0,128±0,003 0,943±0,0258 0,383±0,0144 0,475±0,012 48 COS VCOS BCOS 30 0,143±0,011 0,103±0,005 0,131±0,004 0,777±0,0777 50 0,136±0,002 0,102±0,002 0,124±0,008 0,755±0,0232 0,135±0,0546 0,163±0,024 70 0,128±0,011 0,104±0,002 0,123±0,009 0,296±0,0560 0,159±0,0512 0,143±0,020 150 0,131±0,013 0,109±0,003 0,125±0,007 0,297±0,0575 200 0,137±0,009 0,112±0,004 0,128±0,008 0,252±0,0226 0,145±0,0329 0,137±0,003 250 0,126±0,030 0,117±0,001 0,131±0,001 0,243±0,0165 0,160±0,039 0,149±0,026 400 0,142±0,002 0,117±0,003 0,130±0,007 0,232±0,0091 0,118±0,027 0,165±0,027 500 0,143±0,004 0,115±0,0006 0,136±0,006 0,222±0,0215 0,137±0,0507 0,112±0,007 0,189±0,009 0,106±0,005 0,156±0,059 0,134±0,008 Qua bảng cho thấy nồng độ COS, V COS BCOS tăng khả ức chế phát triển vi khuẩn Erwinia carotovora, Ralstonia sp cao Đối với vi khuẩn Erwinia carotovora ta thấy COS ức chế vi khuẩn nồng độ 30 ppm, VCOS BCOS 20 ppm so sánh dẫn xuất với COS nồng độ 20 ppm ta nhận thấy khả ức chế phát triển vi khuẩn dẫn xuất tốt C n vi khuẩn Ralstonia sp nồng độ ức chế tối thiểu dẫn xuất 30 ppm nồng độ ức chế tối thiểu COS 70 ppm chứng tỏ khả ức chế vi khuẩn dẫn xuất tạo thành tốt so với COS Do chúng tơi ch n nồng đ ức chế tối thiểu VCOS BCOS vi khuẩn Erwinia carotovora 20 ppm, vi khuẩn Ralstonia sp 30 ppm 3.3.2 áả Bả C ủ Nồ ưở COS ary -COS p át tr ể sợ 3.18 Hiệu suất kháng nấm COS nồng độ khác ấm H u suất k ấm (%) độ (ppm) Fusarium oxysporum Sclerotium sp 0 25 9,32 15,16 50 24,58 31,05 75 32,63 38,63 100 41,10 50,54 49 ấm 125 67,37 84,84 150 100 100 Bả 3.19 Hiệu suất kháng nấm BCOS nồng độ khác C ủ Nồ ấm ấm (%) độ (ppm) Fusarium oxysporum Sclerotium sp 0 25 26,70 26,71 50 44,07 52,71 75 54,66 74,01 100 77,97 82,31 125 97,88 100 150 100 100 Bả 3.20 Hiệu suất kháng nấm VCOS nồng độ khác C ủ Nồ H u suất k ấm H u suất k ấm (%) độ (ppm) Fusarium oxysporum Sclerotium sp 0 25 25,42 29,96 50 58,05 47,65 75 83,05 64,26 100 91,95 86,64 125 99,57 99,28 150 100 100 Qua kết bảng 8, 3.20 cho thấy COS, VCOS BCOS có khả kháng nấm Fusarium oxysporum Sclerotium sp Nồng độ COS, VCOS 50 BCOS cao khả kháng nấm cao Ở nồng độ 50 ppm hiệu suất kháng đạt 00 (nấm không m c đ a thạch), nghiệm thức đối chứng hiệu suất đạt Ở nồng độ hai loại dẫn xuất VCOS BCOS có khả kháng nấm Fusarium oxysporum Sclerotium sp tốt COS Trong loại dẫn xuất dẫn xuất VCOS có khả kháng nấm tốt dẫn xuất BCOS nồng độ 3.3.3 Ả ưở COS ary -COS p át tr ể s k ấm tro canh trườ Bả C ủ 3.21 Ảnh hưởng COS aryl-COS lên phát triển sinh khối nấm ấm Fusarium oxysporum ượ C 2,38±0,033 s k ấm ( ) COS VCOS BCOS 1,14±0,049 0,36±0,022 0,08±0,114 Sclerotium sp 3,63±0,028 0,97±0,007 0,13±0,042 0,50±0,003 Qua bảng 3.2 cho thấy loại COS, VCOS BCOS có ức chế phát triển nấm Fusarium oxysporum Sclerotium sp canh trư ng Đối với chủng nấm Fusarium oxysporum dẫn xuất BCOS có khả ức chế tốt (khối lượng sinh khối nấm thu 0,08g), tiếp dẫn xuất VCOS (khối lượng sinh khối nấm thu 0,36g), thấp COS (khối lượng sinh khối nấm thu , 4g) Đối với chủng nấm Sclerotium sp dẫn xuất VCOS có khả ức chế tốt dẫn xuất BCOS COS Như COS, VCOS BCOS có khả ức chế phát triển nấm canh trư ng 51 C ươ T U N VÀ 4.1 NGHỊ K t luận Đã tổng hợp dẫn xuất VCOS Điều kiện thích hợp để tổng hợp dẫn xuất VCOS pH 5,5 nhiệt độ 30oC nồng độ Vanilyl 2% tổng hợp gi Dẫn xuất VCOS có khả ức chế phát triển vi khuẩn nấm tốt so với COS Đã tổng hợp dẫn xuất BCOS Điều kiện thích hợp để tổng hợp dẫn xuất BCOS pH 5,5 nhiệt độ 30oC nồng độ Benzyl 2% tổng hợp gi Dẫn xuất BCOS có khả ức chế phát triển vi khuẩn nấm tốt so với COS 52 Quy trình sản xuất dẫn xuất VCOS Vanilyl 2% COS 1% Tạo thành hỗn hợp dung dịch Dung dịch VCOS pH 5,5 Nhiệt độ ph ng Th i gian: gi Khuấy NaBH4 Ly tâm, rửa tủa, sấy khơ Sản phẩm VCOS dạng rắn Hình 4.1 Quy trình sản xuất VCOS 53 Hình 4.2 Dẫn xuất VCOS Phương pháp bước thực quy trình hình 4.1 mơ tả chi tiết sau: Bước 1: 50 ml dung dịch COS h a tan vào 50 ml dung dịch vanilyl 2% dùng NaOH chỉnh pH 5,5 Bước 2: Dung dịch VCOS sau khuấy nhiệt độ ph ng gi Thêm 0,1 g NaBH4 vào dung dịch VCOS làm tác nhân khử, khuấy nhiệt độ ph ng gi Bước 3: Dung dịch VCOS thu nhận chuyển vào bình ly tâm 250 ml tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 v ng phút phút sau thu tủa, dùng 200 ml nước cất rửa tủa rửa tủa với 200 ml ether để loại bỏ aldehyde không phản ứng Tiến hành sấy khô 40oC thu nhận sản phẩm VCOS dạng rắn Tiến hành xác định độ thay phương pháp Ninhydrin, đặc trưng cấu trúc phổ IR NMR 54 Quy trình sản xuất dẫn xuất BCOS Benzyl 2% COS 1% Tạo thành hỗn hợp dung dịch Dung dịch BCOS pH 5,5 Nhiệt độ ph ng Th i gian: gi Khuấy NaBH4 Ly tâm, rửa tủa, sấy khô Sản phẩm BCOS dạng rắn Hình 4.3 Quy trình sản xuất BCOS 55 H 4.4 Dẫn xuất BCOS Phương pháp bước thực quy trình hình 4.3 mô tả chi tiết sau: Bước 1: 50 ml dung dịch COS h a tan vào 50 ml dung dịch benzyl 2% dùng NaOH chỉnh pH 5,5 Bước 2: Dung dịch BCOS sau khuấy nhiệt độ ph ng gi Thêm 0,1 g NaBH4 vào dung dịch BCOS làm tác nhân khử, khuấy nhiệt độ ph ng gi Bước 3: Dung dịch BCOS thu nhận chuyển vào bình ly tâm 250 ml tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 v ng phút phút sau thu tủa, dùng 200 ml nước cất rửa tủa rửa tủa với 200 ml ether để loại bỏ aldehyde không phản ứng Tiến hành sấy khô 40oC thu nhận sản phẩm BCOS dạng rắn Tiến hành xác định độ thay phương pháp Ninhydrin, đặc trưng cấu trúc phổ IR NMR 4.2 Ki n nghị Thử nghiệm khả kháng nấm, kháng khuẩn dẫn xuất đến chủng vi sinh vật gây bệnh khác điều kiện in vitro Thử nghiệm khả kháng nấm, kháng khuẩn dẫn xuất tổng hợp lên trồng 56 TÀI IỆU THAM  Tà ut HẢO V t Nguyễn Anh Dũng (2003) Ảnh hưởng oligoglucosamine dẫn suất Slicyden- oligoglucosamine đến sinh trưởng phát triển số loại rau Daklak Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Công nghệ tuổi trẻ trường Nơng lâm ngư tồn quốc lần thứ I, Hà Nội, tr 2-15 Nguyễn Anh Dũng, Nguyễn Tiến Thắng (2001) Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận oligoglucosamine từ chitosan ứng dụng chúng nơng nghiệp Tuyển tập cơng trình nghiên cứu Khoa học Công nghệ, tr 162-169 Nguyễn Quốc Hiến, Lê Quang Luân, Lê Hải (2000) Nghiên cứu chế tạo oligochitosan kỹ thuật xạ Tạp chí Hóa học, 38, tr 22-24 Phạm Thị nh Hồng, Nguyễn Anh Dũng, Ngô Đại Nghiệp, V ng Bính Long cộng (2008) Nghiên cứu thu nhận cải biến nhằm nâng cao hoạt tính oligosaccharide ứng dụng chăn ni tài trọng iểm H Phạm Thị Lệ Hà, Trần Thị Thuỷ, Nguyễn Quốc Hiến (2002) Khả diệt nấm phồng chè (Exobasidium vexans massee) chitosan chiếu xạ Tạp chí Sinh học, tr 47-50  Tà ut A Aider, M (2010) Chitosan application for active bio-base films production and potential in the food industry: Review Mohammed Aider Food Science and Technology, 43, 837-842 Je, J Y and Kim, S K (2006) Reactive oxygen species scavenging activity of aminoderivatized chitosan with different degree of deacetylation Bioorganic Medicinal Chemistry, 14, 5989-5994 Kim, K W and Thomas, R L (2007) Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weigh Food Chemistry, 101, 308-313 57 Kim, S K., Rajapaks, N (2005) Enzymatic production and biological activities of chitosannoligosaccharudes (COS): A review CarbohydraTe Polymers, 62, 357-368 10 Lin, S B., Lin, Y C and Chen, H H (2008) Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase, lysozyme and chitinase, Food Chemistry, 1, 47-53 11 Liu , X., Xia, W., Jiang, Q., Xu , Y., and Yu, P (2014) Synthesis, Characterization, and Antimicrobial Activity of Kojic Acid Grafted Chitosan Oligosaccharide Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62 (1), 297–303 12 Matsugor, S., Mizuie, M., Matsugo, M., Kitano, H and Konishi, T (1998) Synthesis and antioxidant activity of water-solute chitosan derivative International Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 44, 938-948 13 Muzzarelli, R.A.A (1997) The determination of tiny quantities of chitin in tissues In R.A.A Muzzarelli and M.G Peter, eds., CHITIN HANDBOOK, p 15-25 Atec, Grottammare ISBN 88-86889-01-1 14 Nguyen Anh Dung and Nguyen Tien Thang (2004) Effects of oligoglucosamine on the frowth and development of Peanut (Arachis hypogea) Proceedings of th AsiaPacific chitin and chitosan Symposium, Singapore 15 Pyo Jam Park, Sushruta Koppula and Se Kwon Kim (2011) Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and their derivative, 241-250 16 Qin, C., Du, Y., Xiao, L., Li, Z., and Gao, X (2002) Enzymic preparation of water-soluble chitosan and their antitumor activity International Journal of Biological Macromolecules, 31, 111-117 17 Qin, C., Zhou, B., Zeng, L., Zhang, Z., Liu, Y., Du, Y.; and Xiao, L (2004) The physicochemical properties and antitumor activity of cellulase- treated chitosan Food Chemistry, 84, 107-115 18 Sajomsang, W., Tantayanon, S., Tangpasuthadol, V., Daly, W H (2009) Quaternization of N-aryl chitosan derivatives: synthesis, charaterization and antibacterial activity Carbohydrate polymesr, 18, 2502-2511 58 19 Shigemasa, Y., Saito, K., Sashiwa, H., and Saimoto, H (1994) Enzymatic degradation of chitins and partially deacetylated chitins International Journal of Biological Macromolecules, 16, 43-49 20 Siripatrawan, U and Harte B R (2010) Physical properties and antioxidant activity of anactive film from chitosan Incorporated with green tea extract, Food Hydrocolloids, 24, 770-775 21 Thatte, M R (2004) Synthesis and antibacterial assessment of water – soluble hydrophobic chitosan derivatives bearing quaternary ammonium functionality, Louisiana State University and Agritucural & Mechanical College 22 Tsai, G J., Su, W H., Chen, H C., and Pan, C L (2002) Antimicrobial activity of shrimp chitin and chitosan from different treaments and applications of fish preservation Fisheries Science, 68, 170-177 23 Vo Thi Phuong Khanh and Nguyen Anh Dzung (2004) Effects of chitosan oligoglucosamine and modified oligoglucosamine the growth inhibition of Fusarium sp Fungi Proceeding of 6th Asia- Pacific chitosan and chitosan Symposium, Singapore 24 Xia, W., Liu, P and Liu, J (2008) Advance in chitosan hydrolysis by nonspecific cellulases, Bioresource Technology, 90, 6751-6762 25 Xie, H (2011) Preparation of Low Molecular Weight Chitosan by Complex Enzymes Hydrolysis International Journal of Chemistry, 26 Xie, H (2011) Preparation of Low Molecular Weight Chitosan by Complex Enzymes Hydrolysis International Journal of Chemistry, (2) 27 Xie, Hu, J., Wei, Y and Hong, X (2009) Preparation of chitooligosaccharide by the enzymatic hydrolysis of chitosan, Polymer degradation and Stability, 90, 18951899 59 28 Xie, Y., Wei, Y and Hu, J (2010) Depolymerization of Chitosan with a Crude Cellulase Preparation from Aspergillus Niger Applied Biochemistry and Biotechnology, 160, 1074-1083 29 Ying, H., Zhao, X., Du, Y (2010) Oligochitosan: A plant diseases vaccine-A review Carbohydrate Polymers, 82 60 PHỤ ỤC Quy tr sả xuất COS ằ e zyme ce u ase quy m 50 m Chitosan Acid acetic 1% NaOH 1% Tạo hỗn hợp dung dịch Chitosan dạng dung dịch % (w/v), pH 5,5 Tốc độ khuấy: 60 v ng phút Nhiệt độ: 60oC Th i gian: gi Enzyme cellulase H2O Thủy phân dung dịch chitosan Bất hoạt enzyme Ly tâm thu nhận phần tan Chitooligosaccharide dạng dung dịch Tủa ethanol, ly tâm thu nhận tủa, sấy khô Sản phẩm chitooligosaccharide dạng rắn 61 Phương pháp bước thực quy trình mơ tả chi tiết sau: Bước 1: 250 g chitosan h a tan 20 l acid acetic pH dung dịch chitosan 5,5 NaOH dịch Thêm acid acetic Sau chỉnh khuấy để NaOH tan hết vào dung cho hỗn hợp dung dịch chitosan sau tích 25 l, pH=5,5 Bước 2: Khi dung dịch đồng ta cho 25 l dung dịch chitosan 25 l enzyme cellulase pha loãng (340ml enzyme + 24,66 l H 2O) vào bồn khuấy tích 80 l tiến hành thủy phân dung dịch gi khuấy cánh khuấy với tốc độ 60 v ng phút nhiệt độ 60oC Bước 3: Sau kết thúc phản ứng thủy phân dung dịch đun sôi phút để bất hoạt enzyme Dung dịch COS thu nhận chuyển vào bình ly tâm lít tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 v ng phút phút sau thu nhận phần tan COS dạng dung dịch Bước 4: Dung dịch COS thu nhận sau ly tâm bước chuyển vào cốc thủy tinh với tỷ lệ thể tích dung dịch COS thể tích cồn tinh khiết khuấy nhẹ th i gian phút để kết tủa COS dung dịch Chuyển hỗn hợp kết tủa vào bình ly tâm lít tiến hành ly tâm với tốc độ 8000 v ng phút phút sau loại bỏ phần dịch thu nhận phần không tan COS COS sau thu nhận tiến hành sấy khơ tủ sấy quạt gió nhiệt độ 45-50oC th i gian gi thu nhận sản phẩm COS dạng rắn Tiến hành xác định độ deacetyl hóa phương pháp Ninhydrin, khối lượng phân tử sắc ký gel (GPC) 62 ... BCOS CD3COOD x 47 THÔNG TIN TÀI Tên đề tài dự án: ? ?Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất aryl- chitooligosaccharide đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh trồng điều kiện in vitro? ?? Chủ nhiệm đề tài... (COS) dẫn xuất chất có khả kháng vi sinh vật, kháng nấm bệnh, kháng vi? ?m, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, ức chế enzyme chống oxi hóa Mỗi loại dẫn xuất COS có khả kháng vi sinh vật khác Trong. .. cách tạo dẫn xuất chúng để nâng cao hoạt tính sinh h c, đặc biệt hoạt tính kháng oxi hóa kháng vi? ?m c n hạn chế chưa cơng bố Cho đến Vi? ??t nam chưa có cơng bố hoạt tính kháng vi? ?m COS dẫn xuất chúng