1.1 Đặt vấn đề Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác. Vì vậy, cây hoa huệ đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và đƣợc xem là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh nhƣ Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh đƣợc canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng suất đáng kể. Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết. Mặt khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một số hạn chế do tính bất tƣơng hợp cao vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc và hạt không tạo đƣợc trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011). Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo đƣợc hạt nhƣng hạt khó nẩy mầm. Có lẽ tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới. Trong các tác nhân đột biến vật lý, tia gamma đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara et al., 2010). Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa nhƣ sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trƣởng… của hoa (Xu et al., 2012). Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần đƣợc áp dụng để tăng số mẫu đƣợc chiếu xạ. Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã đƣợc nghiên cứu (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004). Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chiếu xạ là phƣơng pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh và có đƣợc biến dị. Sự kết hợp này đƣợc áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ. Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và giao phấn… Đối với cây hoa kiểng, số lƣợng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu hình hoa. Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia gamma đã làm thay đổi số lƣợng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lƣợng cánh hoa cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al., 2012; Nagatomi, 2001). Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng số lƣợng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma. Cho đến nay, ở Việt Nam, chƣa có giống hoa huệ mới với nhiều cánh hoa đƣợc tạo ra theo phƣơng pháp truyền thống cũng nhƣ các phƣơng pháp chọn giống bằng kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại khác. Nhƣ vậy, cần thiết phải thực hiện nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma ( 60 Co) trong điều kiện in vitro”. 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chính Chọn đƣợc giống hoa huệ có số lƣợng cánh hoa nhiều hơn giống làm vật liệu nghiên cứu, có kích thƣớc hoa to hơn và có hƣơng thơm. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể (1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để tạo nguồn vật liệu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma ( 60 Co). (2) Xác định liều gây chết 50% (LD 50 ) của tia gamma ( 60 Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy. (3) Xác định các dạng bất thƣờng về kiểu hình của cây giai đoạn thuần dƣỡng. (4) Chọn đƣợc một đến hai dòng hoa huệ tăng về số lƣợng cánh hoa (nhiều hơn 12 cánh), kích thƣớc hoa to hơn và có mùi thơm theo phƣơng pháp nhân giống truyền thống.
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo- ĐÀO THỊ TUYẾT THANH TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60CO) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62 42 02 01 Cần Thơ - 2018 Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv CAM KẾT KẾT QUẢ v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG xii DANH SÁCH HÌNH xiv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT xvi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.5 Điểm luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu hoa huệ 2.1.1 Nguồn gốc phân loại thực vật hoa huệ 2.1.2 Đặc điểm thực vật hoa huệ 2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ giới Việt Nam Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.3.1 Trên giới 2.1.3.2 Ở Việt Nam 2.1.4 Tầm quan trọng mục đích sử dụng hoa huệ 2.1.5 Đặc điểm sinh trƣởng phát triển 2.1.6 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển 2.1.6.1 Nhiệt độ 2.1.6.2 Độ sâu trồng 10 2.1.6.3 Các chất dinh dƣỡng 10 2.2 Kỹ thuật trồng chăm sóc hoa huệ 11 2.2.1 Chuẩn bị giống 11 2.2.2 Chuẩn bị đất 12 2.2.3 Chăm sóc 12 2.2.4 Sâu bệnh hoa huệ 12 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro chọn tạo giống trồng đột biến 13 2.3.1 Các giai đoạn nuôi cấy thực vật in vitro 13 2.3.2 Các loại mẫu cấy nuôi cấy in vitro hoa huệ 13 2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristem culture) 14 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy thực vật in vitro 15 2.3.4.1 Dinh dƣỡng khống vitamin ni cấy thực vật in vitro 15 2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật nuôi cấy thực vật in vitro 16 2.3.4.3 Các chất bổ sung khác nuôi cấy thực vật in vitro 17 2.3.5 Sự hình thành mơ sẹo chồi (cụm chồi) nuôi cấy thực vật in vitro 17 2.3.5.1 Sự hình thành mơ sẹo nuôi cấy in vitro 17 2.3.5.2 Sự hình thành chồi ni cấy in vitro 18 2.4 Phƣơng pháp xử lý đột biến kỹ thuật chiếu xạ chọn tạo giống trồng 19 2.4.1 Sơ lƣợc đột biến kỹ thuật chiếu xạ 19 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.2 Đặc điểm tia phóng xạ gamma 19 2.4.2.1 Cơ chế tạo đột biến tia gamma (60Co) 19 2.4.2.2 Hiệu tia gamma chọn giống trồng 20 2.4.2.3 Liều chiếu xạ 20 2.4.2.4 Liều gây chết LD50 21 2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro 21 2.4.3 Ý nghĩa phƣơng pháp chọn giống đột biến 22 2.4.4 Tình hình tạo giống hoa huệ giới Việt Nam 22 2.4.4.1 Trên giới 22 2.4.4.2 Ở Việt Nam 23 2.5 Sự kết hợp chọn giống đột biến nuôi cấy thực vật in vitro chiếu xạ tia gamma 23 2.5.1 Nguồn vật liệu để tạo đột biến in vitro 23 2.5.2 Ƣu điểm khuyết điểm phƣơng pháp chọn giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro xử lý đột biến tia gamma 23 2.5.3 Một số kết nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy thực vật in vitro xử lý đột biến tia gamma loại trồng 24 2.5.4 Một số nghiên cứu xử lý đột biến nuôi cấy thực vật in vitro chiếu xạ tia gamma hoa huệ giới Việt Nam 25 2.6 Ứng dụng thị di truyền để chọn lọc dòng đột biến chọn giống trồng hoa huệ xử lý tác nhân vật lý 25 2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp 26 2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence RepeatISSR) 26 2.6.3 Một số nghiên cứu sử dụng PCR-ISSR chọn giống trồng xử lý đột biến 27 2.6.4 Một số nghiên cứu hoa huệ sử dụng phƣơng pháp PCR-ISSR 27 2.6.5 Phân tích đa hình trình tự ADN gen ITS (Internal Transcribed Spacer) 28 2.7 Địa lý điều kiện tự nhiên số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long 29 2.7.1 Tiền Giang 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.7.2 Cần Thơ 30 2.7.3 An Giang 30 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 31 3.1.1 Thời gian địa điểm 31 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 31 3.1.3 Trang thiết bị hóa chất 32 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 33 3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 34 3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoa huệ 34 3.2.1.2 Tạo mô sẹo cụm chồi hoa huệ cho xử lý chiếu xạ 35 3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) hai giống/dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD50) in vitro 36 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia (60Co) gamma đến sinh trƣởng phát triển cụm mơ sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 37 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 38 3.2.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoa huệ hoàn chỉnh 39 3.2.3 Nội dung 3: Xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng nhà lƣới 39 3.2.4 Nội dung 4: Chọn dòng hoa huệ tăng số cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 40 3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sinh trƣởng phát triển giống/dòng hoa huệ đơn sau xử lý tia gamma (60Co) ngồi đồng 40 3.2.4.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát sinh trƣởng phát triển giống/dòng hoa huệ kép sau xử lý tia gamma (60Co) đồng 42 3.2.4.3 Đánh giá đa dạng ADN giống/dòng hoa huệ đột biến 43 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 45 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 47 4.1.1 Tỷ lệ sống nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (ĐST) hai giống hoa huệ 47 4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) cụm chồi 47 4.2 Xác định hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) hai giống/dòng hoa huệ liều gây chết 50% (LD50) in vitro 48 4.2.1 Hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển mơ sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 48 4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 48 4.2.1.2 Tỷ lệ chết cụm mơ sẹo/chồi giống/dòng hoa huệ đơn 49 4.2.1.3 Liều gây chết LD50 cụm mơ sẹo/chồi giống/dòng hoa huệ đơn 50 4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ đơn 52 4.2.1.5 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ đơn 53 4.2.2 Hiệu liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sinh trƣởng phát triển cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 54 4.2.2.1 Tỷ lệ chết cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 54 4.2.2.2 Liều gây chết LD50 cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 55 4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ kép 57 4.2.2.4 Tác động liều chiếu xạ tia gamma (60Co) cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ kép 59 4.2.3 Nhân chồi tạo rễ thành hoa huệ hoàn chỉnh 61 4.3 Xác định đa dạng mặt hình thái giai đoạn dƣỡng nhà lƣới 62 4.3.1 Tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ đơn giai đoạn dƣỡng 62 4.3.2 Tỷ lệ chết giống/dòng huệ kép giai đoạn dƣỡng 63 4.3.3 Các dạng bất thƣờng kiểu hình giống/dòng hoa huệ đơn kép giai đoạn dƣỡng 64 4.4 Chọn dòng hoa huệ tăng số cánh hoa, kích thƣớc hoa hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 64 4.4.1 Trồng lần (M1) 64 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.4.1.1 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ đơn 64 4.4.1.2 Các đặc điểm sinh trƣởng hoa giống/dòng hoa huệ kép 75 4.4.2 Trồng lần (M2) 90 4.4.3 Đánh giá đa dạng di truyền giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn đƣợc 92 4.4.3.1 Đánh giá đa dạng di truyền phƣơng pháp đánh dấu phân tử ISSR-PCR 92 4.4.3.2 Giải trình tự vùng ITS giống/dòng hoa huệ 96 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101 5.1 Kết luận 101 5.2 Đề nghị 103 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 104 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 PHỤ LỤC BẢNG 131 PHỤ LỤC HÌNH 140 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Một số nghiên cứu liều gây chết LD50 xử lý chiếu xạ loại trồng 21 Bảng 3.1: Bố trí liều chiếu xạ nghiệm thức giống hoa huệ đơn 37 Bảng 3.2: Bố trí liều chiếu xạ nghiệm thức giống hoa huệ kép 39 Bảng 3.3: Danh sách mồi ISSR sử dụng đánh giá đa dạng ADN giống/dòng huệ 44 Bảng 4.1: Tỷ lệ sống đỉnh sinh trƣởng hai giống hoa huệ đơn hoa huệ kép 30 ngày sau cấy 47 Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 49 Bảng 4.3: Tỷ lệ chết cụm mơ sẹo/chồi giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy 50 Bảng 4.4: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ đơn liều chiếu xạ 51 Bảng 4.5: Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ đơn xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy 52 Bảng 4.6: Phần trăm xuất cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ đơn xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy 53 Bảng 4.7: Tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy 55 Bảng 4.8: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ kép liều chiếu xạ 56 Bảng 4.9: Số chồi, chiều cao chồi số giống/dòng hoa huệ kép xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy 59 Bảng 4.10: Phần trăm xuất cấu trúc bất thƣờng giống/dòng hoa huệ kép xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy 60 Bảng 4.11: Tỷ lệ chết sau 30 ngày dƣỡng giống/dòng huệ đơn 63 Bảng 4.12: Tỷ lệ chết sau 30 ngày dƣỡng giống/dòng huệ kép 63 Bảng 4.13: Tỷ lệ chết giống/dòng huệ đơn sau 60 ngày trồng 64 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 4.14: Các tiêu sinh trƣởng giống/dòng hoa huệ đơn sau 180 ngày trồng 66 Bảng 4.15: Đặc điểm hoa giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần 68 Bảng 4.16: Tần số dạng bất thƣờng dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng 70 Bảng 4.17: Tần số dạng bất thƣờng thân củ dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng 72 Bảng 4.18: Tần số dạng hoa bất thƣờng phát hoa dòng hoa huệ đơn hoa lần 73 Bảng 4.19: Đánh giá mức độ mùi thơm giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần 75 Bảng 4.20: Tỷ lệ chết giống/dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng 76 Bảng 4.21: Các tiêu sinh trƣởng giống/dòng hoa huệ kép sau 180 ngày 77 Bảng 4.22: Đặc điểm hoa giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần 79 Bảng 4.23: Tần số dạng bất thƣờng dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng 81 Bảng 4.24: Tần số dạng bất thƣờng thân củ dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng 83 Bảng 4.25: Tần số dạng bất thƣờng hoa dòng hoa huệ kép hoa lần 86 Bảng 4.26: Tần số dạng hoa bất thƣờng phát hoa dòng hoa huệ kép hoa lần 89 Bảng 4.27: Đánh giá mức độ mùi thơm giống/dòng hoa huệ kép hoa lần 90 Bảng 4.28: Đặc điểm nơng học giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc sau trồng lần 91 Bảng 4.29: Sự đa hình thị ISSR giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc 93 Bảng 4.30: Hệ số tƣơng đồng di truyền giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc với cặp mồi ISSR 95 Bảng 4.31: Kết BLAST đoạn gene ITS mẫu hoa huệ sở liệu ngân hàng gene NCBI6 99 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xiii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) kép (phải) Hình 2.3: Đỉnh sinh trƣởng thực vật1 14 Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn kép canh tác tỉnh An Giang 32 Hình 3.2: Quy trình thực tạo dòng hoa huệ đột biến phƣơng pháp nuôi cấy in vitro xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) 34 Hình 3.3: Đỉnh sinh trƣởng hoa huệ 35 Hình 3.4: Mơi trƣờng túi nylon đƣợc chuẩn bị trƣớc cấy mẫu 36 Hình 3.5: Đĩa petri đƣợc cấy mẫu trƣớc xử lý tia gamma (60Co) 37 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngồi đồng giống/dòng hoa huệ đơn kép hệ M1 Cần thơ Tiền Giang 43 Hình 4.1: Đỉnh sinh trƣởng phát triển sau 30 ngày ni cấy 47 Hình 4.2: Sự hình thành mơ sẹo (a) cụm chồi (b) giống hoa huệ đơn 48 Hình 4.3: Đồ thị tƣơng quan hồi quy để xác định LD50 liều chiếu xạ khác giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy 51 Hình 4.4: Các dạng cấu trúc bất thƣờng cụm chồi giống/dòng hoa huệ đơn liều chiếu xạ khác sau 150 ngày nuôi cấy 54 Hình 4.5: Đồ thị tƣơng quan hồi quy để xác định LD50 liều chiếu xạ khác giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy 57 Hình 4.6: Các dạng cấu trúc bất thƣờng cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép liều chiếu xạ khác sau 150 ngày nuôi cấy 61 Hình 4.7: Giai đoạn rễ giống hoa huệ đơn 62 Hình 4.8: Đƣờng kính củ giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần 67 Hình 4.9: Chiều cao phát hoa giống/dòng hoa huệ đơn hoa lần 69 Hình 4.10: Các dạng bất thƣờng dòng hoa huệ đơn xử lý chiếu xạ sau 60 ngày trồng 71 Hình 4.11: Các dạng thân củ bất thƣờng giống/dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng 72 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xiv Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Watako, A O and K Ngamau, 2013 Effect of subsequent storage of tuberose (Polianthes tuberosa L.) bulbs after low temperature pretreatment improves growth, percent sprouting and cut flower quality Journal of Agriculture, Science and Technology 15 (1) Weimin, W., Z Mizhen Z., W Zhuangei, Q Yaming and Y Ji, 2009 The Study of the Irradiation Effect on Runner Plant of Strawberry with 60Co gamma ray In: VI International Strawberry Symposium Acta Horticulturae 842: 597-600 White, P R., 1963 The Cultivation of Animal and Plant Cells In: Ronald Press New York (2 nd Eds ) 239 p White, T J., T Bruns, S Lee, and J W Taylor, 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Eds Innis, M A., D H Gelfand, J J Sninsky, and T J White Academic Press, Inc., New York 315-322 Wi, S G., B Y Chung, J Kim, J Kim, M Baek, J Lee and Y.S Kim, 2007 Effects of gamma irradiation on morphological changes and biological responses in plants Micron 38: 553-564 Wilfert, G J., 1980 Gladiolus In “Introduction to floriculture” (Larson R A Ed.) Academic Press, Inc New York pp 165-181 Xi, M., L Sun, S Qui J Liu, J Xu and J Shi, 2012 In vitro mutagenesis and identification of mutans via ISSR in lily (Lilium longiflorum) Plant Cell Reports 31: 1043-1051 Xu, L., U Najeeb, M S Naeem, G L Wan, Z L Jin, F Khan and W J Zhou, 2012 In: In vitro mutagenesis and genetic improvement S.K Gupta (Ed.): Technological innovations in major world oil crops (2): 151-173 Yamaguchi, H., S Nagatomi, T Morishita, K Degi, A Tanaka, N Shikazono and Y Hase, 2003 Mutation induced with ion beam irradiation in rose Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 206: 561- 564 Yang, H and H Schmidt, 1994 Selection of mutants from adventitious shoots formed in X-ray treated cherry leaves and differentiation of standard and mutant with RAPDs Euphytica 77: 89-92 Yanofsky, M F., H Ma, J L Bowman, G N Drews, K.A Feldmann and E.M Meyerowitz, 1990 The protein encoded by the Arabidopsis Chuyên ngành Công nghệ sinh học 128 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ homeotic gene agamous resembles transcription factors Nature 346: 3540 Yanshan, S., L Jianxia, Z.Guofang, Q Guiping and L Xueen, 2003 Search for proper dose of 60Coγ ray in tuberose (Polianthes tuberosa L.) radiation breeding Acta Horticulturae Sinica Younis, S E and J H Borham, 1975 The effects of gamma radiation on Polianthes tuberosa Egyptian Journal of Botany 18: 205-217 Yuri, T., Y Oshima, T Yamamura, M Sugiyama, N Mitsuda, N Ohtsubo, M Ohme-Takagi and T Terakawa, 2013 Multi-petal cyclamen flowers produced by AGAMOUS chimeric repressor expression Scientific reports 3: 1-6 Zagaja, S W., A Przyfyla and B Machnik, 1982 Development of compact mutants in apple and sour cherry IAEA 37-47 Zhang J., C Li, C Wu, L Xiong, G Chen, Q Zhang and S Wang, 2006 RMD: a rice mutant database for functional analysis of the rice genome Nucleic Acids Research 34: 745-748 Zheng, H and H R Zheng, 2001 Induction of mutant plant in sweet potato (Ipomoea batatas) by gamma ray irradiation on calli Acta Agriculturae Shanghai 17: 27-33 Zhou, L B., W J Li, S Ma, X C Dong, L X Yu, Q Li, G M Zhou and Q X Gao, 2006 Effects of ion beam irradiation on ddventitious shoot regeneration from in vitro leaf explants of Saintpaulia ionahta Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 244: 349-353 Zhou, L., Z Jinzhu, L Zhen and C Daidi, 2009 Genetic diversity of different roses revealed by ISSR Genomics and Applied Biology 28: 311- 315 Zykov, K I and Z K Klimenko, 1989 Prospects of shortening the time to breed new garden rose cultivars Botanicheskii Saad 108: 172-137 Tài liệu website : http://hocvalam.vn/vung/dong-bang-song-cuu-long Truy cập ngày 17/1/2018 :https://lima.osu.edu/assets/lima/uploads/Departments/Biology/unsorted/coleu s2.jpg Chuyên ngành Công nghệ sinh học 129 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ :http://www.tiengiang.gov.vn/vPortal/4/625/1259/31072/Tiem-nang-phattrien/V 7883 tri -273 -7883-a-ly 273-i 7873-u-ki 7879-n-t-7921 nhien hanh-chinh.aspx Truy cập ngày 17/1/2018 :http://www.canthotoday.com/new/news/Can-Tho-Thu-phu-mien-Tay/Vi-tridi-a-ly-10/ :http://timhieuvietnam.com/danh-lam-thang-canh/dieu-kien-tu-nhien-va-tainguyen-thien-nhien-tinh-giang.html Truy cập ngày 17/1/2018 : http://blast.ncbi.nlm.nih.gov Chuyên ngành Công nghệ sinh học 130 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần mơi trƣờng MS (Murashige and Skoog, 1962) Hóa chất Đa lƣợng MS (mg/l) NH4NO3 1.650 KNO3 1.900 CaCl2 2H2O 330 MgSO4 7H2O 370 KH2PO4 170 FeSO4 7H2O 27,8 Na2 EDTA 37,3 MnSO4 H2O 22,3 ZnSO4 7H2O 11,5 H3BO3 Vi lƣợng Vitamins 6,2 KI 0,83 Na2MoO4 2H2O 0,25 CuSO4 5H2O 0,025 CoCl2 6H2O 0,025 Myo-inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine CHCl 0,4 Glycine 0,2 Carbohydrate Sucrose Chuyên ngành Công nghệ sinh học 131 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2: Bảng biến đổi % chết sang giá trị xác suất (Finney, 1952) % 0 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72 40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 Bảng 3: Quy trình trồng hoa huệ giai đoạn ngồi đồng (Lê Lý Vũ Vi ctv., 2014) Giai đoạn Chuẩn bị đất Nội dung, cơng việc Lơ đất thí nghiệm có diện tích 500m2 đất vƣờn đƣợc sửa thành liếp đơn Liếp rộng 1,5m, cao 0,25m, đào rảnh rộng 0,5m, sâu 0,25m Bón lót (10 ngày trƣớc trồng) 10 kg phân DAP + 3m3 phân chuồng (phân bò hoai mục)/1.000 m2 Trồng lần (M1) Mỗi liếp trồng hàng, bụi hàng cách 25,0cm x 40,0cm (đối với giống huệ đơn) 25,0cm x 25,0cm (đối với giống huệ kép) Trồng củ sâu khoảng 2,0-3,0cm Tƣới ƣớt đẫm sau trồng Tƣới nƣớc Trong 30 ngày đầu, tƣới ngày lần vào sáng sớm chiều mát, sau tƣới ƣớt đẫm ngày lần vào buổi chiều Khi tƣới tránh làm dập huệ 30 ngày sau trồng Bón thúc lần 1: 30 kg phân DAP + 30 kg phân urea/1.000m2 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 132 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 60 ngày sau trồng Bón thúc lần 2:15 kg urea + phân KNO3/1.000 m2 Định kì hàng tháng Làm cỏ xới đất Bón sau làm cỏ xới đất hàng tháng Bón phân giai đoạn cho hoa Rãi mặt liếp: kg DAP + 3kg urê + kg NPK 20-20-15 (cho 1.000 m2) Kỹ thuật thu hoa Thu vào sáng sớm chiều mát Dùng dao bén cắt gần sát củ, để nƣớc không đọng cọng hoa nên dễ làm thối củ Lần trở dùng chân đạp giữ gốc huệ, tay nắm cọng dặt mạnh ngang mặt đất rời khớp Bón 15 kg phân DAP + 15 kg urê (cho 1.000 m2) Sau thu hoạch đợt Khi có 70% hoa, tiến hành dỡ cũ, phân loại củ theo kích cỡ, sữa đất để trồng có dạng bất thƣờng mong muốn lần (M2) (Quy trình canh tác đƣợc thực tƣơng tự nhƣ trồng lần 1) Phòng trừ sâu bệnh + Phòng trừ loại thuốc trị nhện đỏ, rệp sáp nhƣ: Pegasus, Ortus, Nissorun, Kelthan 20EC, Comite, Basudin 10H (liều lƣợng theo hƣớng dẫn bao bì) + Phòng trừ bệnh thối lá, thối củ loại thuốc sau đây: Anvil, Topsin, Ridomil, Rorval, Alliette… Thí nghiệm 1: Bảng 4: Số chồi giống/dòng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 579,517 64,391 Trong nhóm 301,580 300 1,005 881,09 309 Tổng F Sig 64,054 0,000 Bảng 5: Chiều cao chồi giống/dòng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1656,872 184,097 Trong nhóm 942,212 300 3,141 2599,084 309 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học 133 F Sig 58,616 0,000 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 6: Số giống/dòng HĐ 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 14088,300 1565,367 Trong nhóm 4979,894 300 16,6 19068,194 309 Tổng F Sig 94,301 0,000 Thí nghiệm 2: Bảng 7: Số chồi giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 14088,300 1565,367 Trong nhóm 4979,894 300 16,6 19068,194 309 Tổng F Sig 94,301 0,000 Bảng 8: Chiều cao chồi giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 0,011 0,001 Trong nhóm 3,719 305 0,012 Tổng 3,730 314 F Sig 0,101 1,000 Bảng 9: Số giống/dòng HK ngày Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1,145 0,127 Trong nhóm 80,043 305 0,262 Tổng 81,187 314 F Sig 0,485 0,885 Bảng 10: Số chồi giống/dòng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 530,299 58,922 Trong nhóm 121,276 300 0,404 Tổng 651,575 309 F Sig 145,755 0,000 Bảng 11: Chiều cao chồi giống/dòng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Giữa nhóm Chun ngành Cơng nghệ sinh học Độ tự 152,052 134 TB bình phƣơng 16,895 F Sig 107,335 0,000 Viện NC & PT Cơng nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trong nhóm Tổng Trường Đại học Cần Thơ 47,220 300 199,272 309 0,157 Bảng 12: Số giống/dòng HK 150 ngày ni cấy Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng Giữa nhóm 1,145 0,127 Trong nhóm 80,043 305 0,262 Tổng 81,187 314 F Sig 0,485 0,885 Bảng 13: Số chồi HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 75,892 10,842 15,768 0,000 Lặp lại 3,167 1,584 2,303 0,137 Sai số 9,626 14 0,688 Độ tự TB bình phƣơng Tổng 917,060 Bảng 14: Số HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng 15526,986 8,363 4,182 973,510 14 69,536 F Sig 2218,141 31,899 0,000 0,060 0,942 219111,610 Bảng 15: Số củ HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng 159,807 Lặp lại 1,908 0,954 Sai số 8,506 14 0,608 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học F 22,830 37,576 0,000 1,570 0,243 3047,880 135 Sig Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 16: Đƣờng kính củ HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 5,353 0,765 33,028 0,000 Lặp lại 0,016 0,008 Sai số 0,324 14 0,023 Tổng 0,342 0,716 285,860 Bảng 17: Thời gian hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng 3527,833 503,976 5,382 0,004 Lặp lại 173,083 86,542 0,924 0,420 Sai số 1310,917 14 93,637 Nghiệm thức Tổng F Sig 665692,000 Bảng 18: Chiều cao phát hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng Độ tự TB bình phƣơng F Sig 467,833 66,833 4,831 0,006 1,000 0,500 0,036 0,965 193,667 14 13,833 29644,000 Bảng 19: Số hoa/phát hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Lặp lại Sai số Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học Độ tự TB bình phƣơng F Sig 467,833 66,833 4,831 0,006 1,000 0,500 0,036 0,965 193,667 14 13,833 29644,000 136 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 20: Đƣờng kính hoa HĐ sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 6,680 0,954 22,360 0,000 Lặp lại 0,002 0,001 Sai số 0,598 14 0,043 Tổng 0,029 0,971 230,540 Bảng 21: Số chồi HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 24,736 3,534 10,703 0,000 Lặp lại 0,023 0,011 Sai số 4,622 14 0,330 Tổng 0,034 0,966 674,913 Bảng 22: Số HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 1253,651 179,093 3,117 0,033 Lặp lại 180,635 90,317 1,572 0,242 Sai số 804,347 14 57,453 Tổng 23078,048 Bảng 23: Số củ HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến Tổng bình phƣơng động Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 150,392 21,485 27,991 0,000 Lặp lại 2,208 1,104 1,438 0,270 Sai số 10,746 14 0,768 Tổng 3133,720 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 137 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 24: Đƣờng kính củ HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến Tổng bình phƣơng động Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 0,640 0,035 1,310 0,315 Lặp lại 0,070 0,091 0,502 0,616 Sai số 0,977 14 0,070 Tổng 364,390 Bảng 25: Thời gian hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 2685,625 383,661 7,816 0,001 Lặp lại 232,750 57,500 2,371 0,130 Sai số 687,250 14 Tổng 49,089 686031,000 Bảng 26: Chiều cao phát hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng 4124,792 Lặp lại 74,813 37,406 Sai số 752,521 14 53,751 Tổng F Sig 589,256 10,963 0,000 0,696 0,515 208640,500 Bảng 27: Số hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Nghiệm thức Độ tự TB bình phƣơng F Sig 630,500 90,071 2,623 0,00 Lặp lại 72,583 36,292 1,057 0,374 Sai số 480,750 14 Tổng 34,339 51052,000 Bảng 28: Đƣờng kính hoa HK sau 180 ngày trồng Nguồn biến động Tổng bình phƣơng Độ tự TB bình phƣơng F Sig Nghiệm thức 7,028 1,004 27,961 0,000 Lặp lại 0,089 0,044 Sai số 0,503 14 0,036 Tổng Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1,239 0,320 495,872 138 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hệ số tƣơng đồng phần mềm NTSYSpc 2.1 " SIMQUAL: input=C:\Users\Nhat Lam\Desktop\UBC.NTS, coeff=SM " by Cols 4L C1 C2 C3 C4 1.0000000 0.6428571 1.0000000 0.7857143 0.5714286 1.0000000 0.4285714 0.3571429 0.5000000 1.0000000 Sơ đồ nhánh SAHN: NTSYSpc 2.10m, (C) 2000-2001, Applied Biostatistics Inc -Input parameters Read input from file: C:\Users\Nhat Lam\Desktop\ubc out.NTS Save result tree in output file: C:\Users\Nhat Lam\Desktop\ubc tree.NTS Clustering method: UPGMA In case of ties: WARN Comments: SIMQUAL: input=C:\Users\Nhat Lam\Desktop\UBC.NTS, coeff=SM by Cols Matrix type = 3, size = by 4, missing value code = "none" (similarity) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 139 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC HÌNH Hình 1: Các bƣớc dƣỡng giống/dòng hoa huệ đơn Đài hoa Cánh hoa Nhị hoa Lá nỗn Hình 2: Mơ hình ABC phát triển quan Arabidopsis (Nguồn: Chang et al., 2009) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 140 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hình 3: Lơ đất trồng giống/dòng hoa huệ đơn Hình 4: Giống/dòng hoa huệ kép trồng lần Hình 5: Thu hoạch chuẩn bị giống/dòng hoa huệ để trồng lần Chuyên ngành Công nghệ sinh học 141 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hình 6: Giống/dòng hoa huệ kép trồng lần Chuyên ngành Công nghệ sinh học 142 Viện NC & PT Công nghệ sinh học ... (LD50) tia gamma (60Co) mẫu mô sẹo giống hoa huệ đơn cụm chồi giống hoa huệ kép điều kiện in vitro - Ở hai giống /dòng hoa huệ, xác định dạng bất thƣờng hình thái chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; ... đƣợc dạng đột biến nhƣ thay thế, thêm một/một đoạn nucleotide - Luận án xây dựng đƣợc quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện... (Polianthes tuberosa L.) đột biến tia gamma (60Co) điều kiện in vitro 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu Chọn đƣợc giống hoa huệ có số lƣợng cánh hoa nhiều giống làm vật liệu nghiên cứu, có kích thƣớc hoa