Phân lập và định danh một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ trầm tích biển thu thập ở cô tô thanh lân

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thư viện ViệiBỄ>ĩiÀ]ipc Mờ Hà Nội PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUÂN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIÊM ĐỊNH TÙ TRẦM TÍCH BIÉN THU THẬP Ở CƠ TƠ - THANH LÂN Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Thị Hồng Minh Giáo viên hưóng dẫn : NCS Vũ Thị Quyên Sinh viên thực : Âu Hoài Thưong Lóp : 11-01 Hà Nội - 2015 LỜI CÁM ON Lời đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn tới toàn ban giám hiệu Viện Đại học Mờ Hà Nội, đặc biệt thay cô khoa Công Nghệ Sinh Học dạy dỗ cm suốt năm học trường, trang bị cho em tàng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời căm ơn chân thành sâu sắc đến TS Lê Thị Hồng Minh Phó Trường phịng Cơng nghệ sinh học - Viện Hố sinh biến - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam NCS Vũ Thị Quyên, người truyền cho em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, chi bào giúp đờ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cám ơn tới cô chú, anh chị, bạn Phịng Cơng nghệ sinh học - Viện Hoá sinh biến giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập „1 Thự:yiên Vigi^ai MoJIaNai , _ , , Cuôi cùng, em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu săc VI giúp đỡ, động viên em suốt thời gian học tập Sinh viên Âu Hoài Thương MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TÁT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG TÓM TẮT KÉT QUẢ NGHIÊN cửu PHẤNI: MỞ ĐÀU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài PHÀN II: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn (Actinomycetes) VỊ trí cùa xạ khuẩn vi sinh vật 2.1.1 2.1.2 Cấu tạo xạ khuấn 2.1.3 2.1.4 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Sự hình bàị tfir'a xV WlâỉP.âỊ b.Q.L\b kìJ.kl 'S.Q ‘ .7 2.2 Chất kháng sinh 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 2.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 2.2.4 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 10 2.2.5 Tình hình nghiên cứu nước 12 2.2.6 Xạ khuẩn biển hợp chất thứ cấp chúng 13 2.2.6.1 Streptomycetaceae 13 2.2.Ó.2 Micromonosporaceae 16 2.2.6.3 Các họ khác Actinobacteria 20 PHÀN III: VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cúu 21 3.1 Vật liệu hóa chất 21 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 21 3.1.2.1 Hóa chất 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.2.1 Thu thập mẫu trầm tích biền [35] 23 3.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuấn [2] [16] [31] 23 3.2.3 Phươngpháp thứ hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định |47J 23 3.2.4 Xác định khà sinh enzyme chùng nghiên cứu [15] 24 3.2.5 Phươngpháp xác định hình thái chụp SEM [48] 25 3.2.6: Phươngphân loại xạ khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 27 3.2.6.1 Phương pháp tách chiết AND tổng số từ xạ khuẩn biển 27 3.2 Ó.2: Phương pháp PCR |42| 27 3.2 6.3: Giải trình tự [43] 27 PHÀN IV: KẾT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 28 4.1 Kết thu thập mẫu 28 4.2 Phân lập xạ khuẩn từ trầm tích 29 4.3 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng nghiên cứu 31 4.4 Khả sinh enzyme chủng nghiên cứu 33 4.4.1 4.4.3 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan 33 Khá năng^.Rh^i^n Đại |TỌC M.cr.Ị.|ả.Nộ.ị 35 Xác định hình thái chủng xạ khuẩn môi trường thạch quan sát kính hiền vi điện từ SEM .36 4.6 Định danh xạ khuẩn bàng sinh học phân tứ 37 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn 37 4.6.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phàn ứng PCR 38 4.6.3 Nhângenl6S ADN riboxom 38 4.6.4 Kết giái trình tự gene 16S ba chùng xạ khuẩn 39 PHẦN V: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 42 5.1: Kết luận .42 5.2: Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHÁO 43 LỜI CAM ĐOAN 48 DANH MỤC CÁC CHỦ VIÉT TẤT Chữ viết tắt Chú thích ADN Axit deoxyribonuclcotit Agar Agarose ARN Axil ribonucleotit BLAST Basic Local Alignment Search Tool CKS Chất kháng sinh CMC Carboxymethyl cellulose EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G(-) Gram âm G(+) Gram dương HTKS T|iư vjện yị( Hoạt tính kháng sinh 'i \jộj KS Kháng sinh LB Lauria Betani PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Scanning Electron Microscope uv Ultraviolet VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật VSVKĐ Vi sinh vật kiểm định XK Xạ khuẩn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Một sổ hình ành xạ khuẩn Hình 2.2 Một số hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn [411 Hình 2.3 Alexander Fleming [46] Hình 2.4 Cấu trúc chất trao đổi thứ cấp từ Streptomyces 14 Hình 2.5 Các chất trao đổi thứ cấp từ Marinispora 16 Hình 2.6 Các chất trao đồi thứ cấp Salinispora 18 Hình 2.7 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ Micromonosporaceae 19 Hình 2.8 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ họ kháccủa Actinobacteria 20 Hình 4.1: Một sốhình ảnh nơi lấy mẫu mẫu thu 29 Hình 4.2 Một sốhình ánh phân lập xạ khuấn 29 Hình 4.3 Một sốhình ánh làm chủng xạ khuân 31 Hình 4.4: Một sốhình ành thử hoạt tính kháng VSVKĐ 33 Hình 4.5 Khả thủy phân tinh bột tan 34 Hình 4.6 Khả phân giái casein cùa XK14 XK16 (A); XK13 (B) 34 Hình 4.7 Khà phấn^fẩítèlliitóseĐ.tì) !).Q.Q M.Q !.Ị.ậ NQ.Ị 35 Hình 4.8: Hình ảnh khuẩn lạc chúng XK13(AI), XK14(A2), XK16(A3) Hình ảnh chụp kính hiển vi điện tử quét SEM tương ứng B1, B2 B3 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bàng 2.1.Các chất kháng sinh phát qua năm Bàng 4.1 Đanh sách mẫu trầm tích thu thập Cơ Tơ - Thanh Lân 28 Bàng 4.2 Danh sách 20 chùng xạ khuẩn phân lập dược 30 Báng 4.3 Kct thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định chùng xạ khuẩn 32 Bàng 4.4: Trình tự thơng số cặp mồi sứ dụng cho phàn ứng PCR 38 Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội TÓM TẲT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu Tên đề tài l Phân lập định danh số chủng xạ khuấn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định từ trầm tích biến thu thập Cô Tô - Thanh Lân Đối tưọug Chúng xạ khuẩn phân lập từ trầm tích biển thuộc khu vực biển Cô Tô Thanh Lân dùng để tuyến chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học Mục tiêu > Tuyến chọn nghiên cứu số chúng xạ khn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết > Phân lập làm chung xạ khuấn từ mẫu trầm tích > Kiếm tra hoạt tính kháng sinh chúng xạ khuấn với vi sinh vật kiếm định > Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội Tuyến chọn 2-3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, có kha kháng vi sinh vật kiếm định > Kiêm tra hoạt tính sinh enzyme: amylase, protease cellulase chúng xạ khuẩn tuyền chọn > Định danh chúng tuyến chọn PHÀN I: MỎ ĐÀU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa, bệnh nhiễm khuấn nỗi lo đáng ngại người Chính điều thơi thúc nhà khoa học giới phái tìm chất có khả phòng chống điều trị bệnh nhiễm khuẩn Năm 1928, A.Fleming phát penicillin-CKS có nguồn gốc từ nấm Penicillium phải 10 năm sau năm 1941 penicillin thức sứ dụng y học cứu sống bệnh nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, từ kỷ nguyên CKS bắt đầu Đây thành tựu vĩ đại cùa nhân loại kỳ XX Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý làm cho tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển ngày lan rộng Việc sứ dụng so chất đặc hiệu đế chữa trị số loại bệnh khơng cịn mang lại hiệu q mong muốn Số lượng vi khuấn đề kháng với kháng sinh ngày gia tăng Chính việc tìm kiếm CKS nrới thu hút,sự quan tâm nhiêu nhà khoa học Cho đến người phát khoảng 17.000 CKS có nguồn gốc vsv, 3.000 CKS bán tổng họp mồi năm có khoảng vài trăm CKS phát Trong số vsv sinh CKS xạ khn đóng vai trị quan trọng hàng đầu, chiếm 80% chất kháng sinh mơ tà, dó chù yếu thuộc chi Streptomyces [4][6] Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành thực đề tài: Phân lập định danh số chúng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định từ trầm tích biến thu thập Cô Tô - Thanh Lân 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập làm xạ khuân từ mầu tram tích - Nghiên cứu tuyền chọn số chúng xạ khuẩn có khã kháng vi sinh vật kiểm định - Kiếm tra khả sinh enzym ngoại bào đe chọn chúng có hoạt tính enzyme cao - 1.3 Định danh tên khoa học cùa số chung xạ khuẩn có hoạt tính cao Ý nghĩa đề tài Tiến hành nghiên cứu hệ xạ khuấn từ trầm tích biển, từ tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biến nói chung xạ khuấn từ trầm tích biến nói riêng Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội Hình 4.5 Kha thủy phân tinh bột tan Ket quà thí nghiệm cho thấy chúng xạ khuấn nghiên cứu XK13, XK14 XKI6 có khả sinh enzyme amylase Môi trường xung quanh chung xạ khn khơng màu, suốt, bên ngồi có màu xanh tím đường kính vịng phân giải 5mm, Imm 20,5mm Từ kết quà trên, ta thấy chúng chủng XK16 có vịng phân giãi rộng rõ (20,5mm), điều chứng tỏ khà sinh enzyme amylase cùa chúng XK16 tốt (hình 4.5) 4.4.2 Khả năngthĩ]ty>fiằịlỉfbầiiwiỉlaỉắẳ) học Mơ Ha Nọi Ni cấy xạ khuẩn mơi trường có 1-3% casein Sau 1-2 ngày ni cấy điều kiện thích hợp lấy nhỏ l-2ml dung dịch lugol đế thứ Neu xạ khuẩn có enzyme có khà phân hũy casein chúng tạo vịng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vịng phân giãi có màu trong, bên ngồi có màu nâu Hình 4.6 Khá phân giái casein XK14 XK16 (A); XK13 (B) 34 Ket cho thấy ba chúng xạ khuẩn nghiên cứu có phán ứng dương tính: mơi trường xung quanh nấm khơng màu suốt Phía bên ngồi có màu nâu Ba chủng có sinh enzyme protease với đường kính vịng phân giãi là: 5mm (XK13), 9.5 mm (XK14) 26,3mm (XK16) Trong chúng chủng XK16 có vịng phân giải 26,3mm rộng rõ nhất, điều chứng tỏ sinh enzyme protease cúa chủng XK16 tốt (Hình 4.6) 4.4.3 Khả thủy phân CMC Ni cấy xạ khuẩn mơi trường có 1-3% CMC Sau 2-3 ngày ni cấy điều kiện thích hợp lay nhó l-2ml dung dịch lugol đế thừ Neu xạ khn có enzyme có phân hủy CMC chúng tạo vòng phân giải xung quanh vị trí xạ khuẩn phát triển, vịng phân giải có màu trong, bên ngồi có màu nâu đỏ Hình 4.7 Khả phân giải cellulose Kct quã thí nghiệm cho thay chúng xạ khuẩn nghiên cứu có khả sinh enzyme cellulase: môi trường xung quanh xạ khuần không màu bên ngồi màu nâu đỏ Đường kính vịng phân giãi chúng XK13, XK.14 XK16 4,5mm (A), 19mm (B) 12mm (A) Trong chủng chùng XK14 có vịng phân giãi rộng rõ nhất, điều chứng tở khả sinh enzyme cellulose chủng XK14 tốt (Hình 4.7) 35 4.5 Xác định hình thái chủng xạ khuấn mơi tru'0'ng thạch quan sát bang kính hiến vi diện tử SEM Hình 4.8: Hình ánh khuấn lạc chúng XK13(A1), XK14(A2), XK16(A3) Hình ảnh chụp kính hiến vi điện tử quét SEM tưoiig ứng Bl, B2 B3 Kết quà nghiên cứu ỡ hình 4J8 choẠẩy- ọc Mơ I lcl Nọi Chúng XK13 môi trường Al khuân lạc nhơ cao, nhăn tâm, dạng phấn Đường kính khuẩn lạc 6-12mm Màu sắc khuẩn ty khí sinh trắng đục Màu sắc khuẩn ty chất nâu xám Quan sát kính hiển vi ta thấy chuỗi bào từ dạng xoăn Chúng XKI4 môi trường Al khuẩn lạc nhơ cao, bào tử khí sinh phát triển tốt Đường kính khuẩn lạc 4-11 mm Màu sẳc khuẩn ty khí sinh tráng Màu sắc khuấn ty chất nâu sẫm Quan sát kính hiến vi ta thấy chuỗi bào tứ dạng thẳng, hệ sợi phân nhánh Chúng XK16 mơi trường Al, khuẩn lạc phẳng, Đường kính khuẩn lạc 5-9mm Màu sac khuấn ty khí sinh trắng Màu sắc khuấn ty chất nâu nhạt Quan sát kính hiển vi ta thấy chuỗi bào tứ dạng thăng, bào tữ có hình bầu dục, xếp thành chuồi dài Các khuẩn lạc chúng có khác biệt mặt kích thước, kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào chùng độ tuổi dao động từ vài mm, bề mặt 36 khuẩn lạc (mềm, cứng, nhăn nheo, cấu trúc hạt), độ dày (phồng hay phăng) Các khuẩn lạc tạo thành hệ sợi chất sợi khí sinh với loại màu khác trang nâu vàng Đặc điếm bào tứ chuồi bào tứ quan sát kính hiến vi điện từ SEM, chuỗi bào từ cúa chủng có thề chia thành hai loại: Dạng thẳng có chuỗi bào tử thăng ngoằn ngoèo, hệ sợi khí sinh phân nhánh màu trang Hoặc dạng xoắn có hệ sợi khí sinh tạo thành sợi mang bào tử phân nhánh có hình móc, vịng mờ bào tử có hình bầu dục hình xoắn, xếp thành chuỗi dài Các đặc điếm hình thái chủng xạ khuấn mơi trường thạch quan sát bàng kính hiến vi điện tứ SEM cho thấy chúng XK13, XK14, XK16 mang đầy đủ đặc điểm chung cùa chi xạ khuấn Streptomyces theo khóa phân loại Bergey (1963) Đế khắng định xác việc định danh đến chi chúng nghiền cứu, tiến hành giãi trình tự gen 16S ARN riboxom XK13, XK14, XKI6 so sánh chúng với Ngân hàng gen Quốc tế 4.6 Dinh danh xạ khuẩn sinh học phân tử 4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn Từ l,5ml dịch nuôi cấyVủa mọt chùng'Xạ khuầh đằ chọn, qua nhiều bước xứ lý thu ADN gcnom Độ tinh sản phẩm kiếm tra bàng phố hấp thụ tử ngoại điện di gel agaroza 1% Hình ánh điện di (Hình 4.9) cho thấy mẫu ADN bị đứt gầy sử dụng làm khuôn cho phân ứng PCR Hình 4.9: Kết điện di AND tống số cùa ba chùng xạ khuấn Đường chạy số AND tống số cúa chủng XK13 Đường chạy số AND tống số cúa chủng XK14 Đường chạy số AND tống số cùa chùng XK16 37 4.6.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phún ứng PCR Moi PCR thiết kế sờ chọn vùng có tính bão thủ cao Đe thực điều này, tra cứu Ngân hàng gen quốc tế dựa sở số trình tự gen 16S ARN riboxom, sử dụng số phần mềm đế trợ giúp tính tốn thiết kế mồi Thơng số cặp mồi lựa chọn trình bày bảng 4.4 kích thước đoạn gcn thu theo tính tốn lý thuyết khống 1500bp Bảng 4.4: Trình tự thơng số cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR Mã hiệu Trình tự mồi cho 16S rARN Tm(uC) %GC 16SF AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 52 45 16SR TAC GGC TAC CTT GTT AGC ACTT 58 55.5 4.6.3 Nhân gen 16S ADN riboxom Từ ADN genom chúng nghiên cứu, sừ dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S với chu trình nhiệt dã nêu phần phương pháp Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự báo thú cùa gen 16S ARN riboxom xạ khuân khuôn ADN genom theo lý thuyết sán pham PCR có độ dài xấp xi 1500 bp Kết điện di đồ sán phẩm PCR (hình 4.10) cho thấy sản pham PCR chủng chi xuất băng có kích thước khoảng 1500bp Như chu trình phân ứng PCR thiết lập hồn tồn phù hợp với mục đích nhân dịng đoạn gen 16S chùng nghiên cứu 12 Hình 4.10: Điện di đồ săn phẩm PCR gen 16S ADN riboxom cùa chủng XK13, XK14 XK16 I 1500bp Giếng 1,2,3: sàn phẩm PCR cùa chùng xạ khuẩn XK13, XKI4 XK16 Giếng : thang ADN chuẩn 38 Như vậy, khuyếch đai đoạn gen 16S ARN riboxom cùa chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao Trên sờ chúng tơi tiến hành tinh lượng lớn sản phâm PCR đổ tiến hành đọc trình tự nucleotit 4.6.4 Kết giải trình tự gene 16S ba chung xạ khuẩn Trình tự gcn xác định theo phương pháp Sangcr&đtg Sau xừ lý liệu thu qua chương trình GENE DOC, chúng tơi nhận trình tự hồn chình gen 16S ARN riboxom chúng • Kết trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom cùa chủng XK13 có độ dài 1522 bp AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCCG CTTCGGTGGT GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTGCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATACGA CACAGGAAGG CATCTTCTCT GTGTGGAAAG CTCCGGCGGT GCAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGCA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCA CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGQG£TTAArCCGGGTQT GCATTCGAỊA CGpGCẠG£ỌT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTcĨtoUTVtlẨềtìA bẬẤAĩQyổA ldjẲAcXiậkG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC TTGACATACA TCGGAAAGCC GTAGAGATAC GGCCCCCCTT GTGGTCGGTG TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCTTTCG GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GTTGCGATGC CGTGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CTAACCCCCT TGTGGGGAGG GAATCGTCGA AGGTGGGACT GGCGATTGGG GACGAAGTCG TAACAAGGTA GCCGTACCGG AAGGGTGCGG CTGGATCACC CT Chúng tơi sử dụng chương trình BLAST đế so sánh trình tự đoạn gen chủng XK13 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế Ket cho thấy đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp VITTK3 mã số GƯ808333 dược phân lập từ mầu trầm tích biền Ấn Độ 39 • Kêt trình tự cùa đoạn gen 16S ARN riboxom cùa chủng XK14 có độ dài 1495 bp GAGTTTGATC CTGGCTCAGG ACGAACGCTG GCGGCGTGCT TAACACATGC AAGTCGAACG ATGAAGCCGC TTCGGTGGTG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG GGCAATCTGC CCTGCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC CGGATATGAC ACAGGAAGGC ATCTTCTCTG TGTGGAAAGC TCCGGCGGTG CAGGATGAGC CCGCGGCCTA TCAGCTTGTT GGTGGGGTGA TGGCCTACCÃ AGGCGACGAC GGGTAGCCGG CCTGAGAGGG CGACCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA ATATTGCACA ATGGGCGGAA GCCTGATGCA GCGACGCCGC GTGAGGGATG ACGGCCTTCG GGTTGTAAAC CTCTTTCAGC AGGGAAGAAG CGCAAGTGAC GGTACCTGCA GAAGAAGCAC CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGT GCGAGCGTTG TCCGGAATTA TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGCTTGT CACGTCGGAT GTGAAAGCCC GGGGCTTAAC CCCGGGTCTG CATTCGATAC GGGCAGGCTA GAGTTCGGTA GGGGAGATCG GAATTCCTGG TGTAGCGGTG AAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGGT GGCGAAGGCG GATCTCTGGG CCGATACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGTTGGG AACTAGGTGT GGGCGACATT CCACGTCGTC CGTGCCGCAG CTAACGCATT AAGTTCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG TGGCTTAATT CGACGCAACG CGAAGAACCT TACCAAGGCT TGACATACAT CGGAAAGCCG TAGAGATACG GCCCCCCTTG TGGTCGGTGT ACAGGTGGTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTATTCTGT GTTGCCAGCA TGCCTTTCGG GGTGATGGGG ACTCACAGGA GÃCTGCCGGG GTCAACTCGG AGGAAGGTGG GGACGACGTC AAGTCATCAT GCCCCTTATG TCTTGGGCTG CACACGTGCT ACAATGGCCG GTACAATGAG TTGCGATACC GTGAGGTGGA GCGAATCTCA AAAAGCCGGT CTCAGTTCGG ATTGGGGTCT GCAACTCGAC CCCATGAAGT CGGAGTCGCT AGTAATCGCA GATCAGCATT GCTGCGGTGA ATACGTTCiXrGGGCCjETGTA, CACACCGCCCjGTCACGTCAC GAAAGTCGGT AACACCCGAA GCCGGTGGCC4aACCCcLtT GTGGcSấớGG1MCTCGTCUKA (^TGGGACTG GCGATTGGGA CGAAGTCGTA ACAAGGTAGC CGTAA Kết so sánh trình tự đoạn gen chủng XK14 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thay, đoạn gen có độ tương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom cùa chúng Streptomyces sp CNP-942- SD01 mã số EƯ214914 phân lập từ mầu trầm tích biên Mỹ • Ket trình tự đoạn gen 16S ARN riboxom chủng XK16 có độ dài 1421 bp GGCTTACCAT GCAGTCGAAC GATGAAGCCG CTTCGGTGGT GGATTAGTGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GGGCAATCTG CCCTGCACTC TGGGACAAGC CCTGGAAACG GGGTCTAATA CCGGATACGA CACAGGAAGG CATCTTCTCT GTGTGGAAAG CTCCGGCGGT GCAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC AATGGGCGCA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGCAAGTGA CGGTACCTGC AGAAGAAGCA CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT GAAATGCGCA 40 GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC TTGACATACA TCGGAAAGCC GTAGAGATAC GGCCCCCCTT GTGGTCGGTG TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCTTTCG GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA GTTGCGATGC CGTGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA AGCCGGTGGC CTAACCCCCT TGTGGGGAGG GAATCGTCGA AGGTGGACCG G Kết quà so sánh trình tự đoạn gen cùa chủng XK16 với trình tự gen 16S ARN riboxom xạ khuẩn khác đăng ký Ngân hàng gen quốc tế cho thấy, đoạn gen có độ lương đồng cao (100%) so với gen 16S ARN riboxom chủng Streptomyces sp 133VN28 mà so KJ434942 phân lập vùng biển phía Nam Hàn Quốc Từ số đặc điểm hình thái so sánh trình tự gene 16S ARN riboxom chủng phân lặp .Chúng tơi có.thề kếtduận Cài3 ìehủng nghiên cứu XK13, XK14, XK16 thuộc chi Streptomyces spp Streptomyces chi lớn cũa ngành Actinobacteria chi thuộc nhánh Streptomycetaceae Chùng vi sinh sản xuất nửa số thuốc kháng sinh giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế Streptomyces họ hàng trở nên phồ biến nhờ vào khà sản xuất chế phẩm như: Thuốc kháng sinh: streptomycin, erythromycin, tetracyclin, neomycin, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin; thuốc kháng nam: nystatin, amphotericin; thuốc chống ung thư: doxorubicin, bleomycin, mitomycin; úc chế miễn dịch: rapamycin; thuốc diệt cỏ: bialaphos 41 PHÀN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1: Kết luận - Từ mẫu trầm tích thu Đào Cô Tô - Thanh Lân tuyển chọn 20 chung xạ khuấn thư hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định - Đã chọn chùng có khà kháng vi sinh vật kiểm định cao Chủng XK13 có đường kính kháng E.faecalis 20,33mm, kháng s.aureus 23,67mm, kháng c.albican 21mm Chủng XK14 có đường kính kháng B.cereus 24,03mm, s.aureus 23mm, c.albican 18,67mm Chùng XK16 có đường kính kháng E.faecalis 20.67mm, B.cereus 22mm, s.aureus 21mm c.albican 24,03mm - Cà ba chủng có khâ sinh enzyme với độ mạnh yếu khác nhau, chúng XK16 có khà sinh amylase cao với vịng phân giải 20,5mm chúng XK16 có khả sinh protease cao với vòng phân giãi 26,3mm chúng có khả sinh cellulase cao XK14với vịng phân giải I9mm - Đã xác định đặc diêm hình thái cùa 'chúng nghiện cứu quan sát chúng mơi trường thạch ni cay kính hiển vi điện tử SEM, kết họp với giãi trình tự 16S ARN riboxom cùa chùng, kết cho thấy cá chủng thuộc chi Streptomyces spp 5.2: Kiến nghị - Tối ưu hóa điều kiện trình lên men, tách chiết chất từ dịch lên men nghiên cứu cấu trúc hoạt chất cùa ba chúng: XK13, XK14 vàXKIÓ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Thu Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Đỗ Thu Hà Nghiên cừu xạ khuân sinh chất kháng sinh chong nam phân lập đất Quảng Nam - Đà Nằng, Luận án Tiến Sinh học, Hà Nội, 2004 Lê Gia Hy, Nghiên cứu xạ khuân thuộc chi Streptomyces sinh chát kháng sinh cong nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó liến sĩ Sinh học, Hà Nội 1994 Lê Mai Hương, Nguyên cứu xạ khuân sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học Hà Nội, 1993 Nguyen Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn Nguyễn Phùng Tiến Đặng Đức Trạch Phạm Vãn Ty, Một so phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXBKHKT Hà Nội, 1972 Nguyền Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo ĩbwến Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyền Lân Dũng, Nguyền Đình Quyến Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học tập II, Nhà xuất bán Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục 2007 Nguyền Lân Dùng, Nguyền Đình Quyến Phạm Vàn Ty, Vi sinh vật học, tập II, Nhà xuất bán Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, 1977 10 Nguyền Lân Dũng, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, 1993 11 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradva V.A.Poltorac, Tinh biến dị bề mặt bào từ xạ khuân sinh choromomycin, Act.A buraviensis, microbiologia TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974 12 Nguyền Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học Kì thuật, tr.17, 2004 43 13 Phan Quốc Kinh, Cơng nghiệp hóa chất, Thơng tin Kinh tế Công nghệ, số 1, 2004 14 Phan Quốc Kinh, Cơng nghiệp hóa chat, Thơng tin Kinh tế Công nghệ, số 1, 2004 15 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, Thực phấm Mỹ phâm, NXB Giáo dục 16 Trịnh Ngọc Hoàng, Nghiên cứu tính đối kháng cùa xạ khuẩn với so vsv gây nhiễm trùng bệnh viện Luận văn Thạc sĩ Sinh học, 2009 17 Vi Thị Đoan Chính, Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh cùa chùng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 bang kỹ thuật dung hợp tế bào trần Luận án TS Sinh học, Viện công nghệ sinh học, HÀ Nội 2000 18 Vi Thị Đoan Chính, Tuyên chọn nghiên cứu xạ khuân có đoi kháng với so chúng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tồng kêt đê tài khoa học công nghệ câp Bộ Mã sô B2009 - TN07 - 02 Tài liệu Tiếng Anjfhư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội 19 Canedo, L M., Fernandez-Puentes, J L & Baz, J p., IB-96212, a novel cytotoxic macrolide produced by a marine Micromonospora 11 Physico- chemicalproperties and structure determination, Journal of Antibiotics, 2000 20 Chen M., Xiao X., Wang p Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp 301-305, 2008 21 Erba, E., Bergamaschi, D., Ronzoni, s., Faretta, M„ Taverna, s., Bonfanti, M., Catapano, c V., Faircloth, G„ Jimeno, J & D'incalci, M., Mode of action of thiocoraline, a natural marine compound with anti-tumour activity, British Journal of Cancer, 1999 22 Fred c Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J Med, 119, pp.3-10, 2006 44 23 Gontang E A., Fenical, w & Jensen, p R., Phylogenetic diversity of Grampositive bacteria cultured from marine sediments Applied and Environmental Microbiology, 2007 24 Hernandez, D Altuna, M., Cuevas, c., Aligue, R Albericio, F & Alvarez, M., Synthesis and antitumor activity of mecherchartnycin A analogues, Journal of Medicinal Chemistry 2008 25 Hozzein W.N., Li W.J., All M.I.A, Hammouda o., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang c L., Nocardiopsis alkliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int J Syst Evol Microbial, 54 pp.247-252, 2004 26 Imada, c., Okami, Y & Hotta, K Production of selenohomocystine as anantibiotic by a marine Bacillussp No 14 with selenomethionine resistance Journal of Antibiotics, 2002 27 Kanoh, K., Matsuo, Y„ Adachi, K., Imagawa, H„ Nishizawa,M & Shizuri, Y., Mechercharmycins A and B, cytotoxic substances from marine-derived Thermoactúị(Ỵ^ceS\Sp, FzV3-$51?) Journal of Antibiotics, $005 28 MA Elberson, F Malekzadeh, M.T Yazdi, N Kameranpour M.R Noori - Daloii, M H Matte, M Shahamat, R.R Colwell K.R Sower, Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose degrading bacteria isolated from forest soils, J Syst Evol Microbiol 50, p.993, 2000 29 Negri A Marco E., Garcia-Hernandez, V., Domingo, A Llamas-Saiz, A L., Porto-Sanda s„ Riguera, R Laine, W.,David-Cordonnier, M H„ Bailly, c., Garcia-Fernandez, L F., Vaquero, J J & Gago, Antitumor activity, x-ray crystal structure, and DNA binding properties of thiocoraline A, a natural bisintercalating thiodepsipeptide, Journal of Medicinal Chemistry, 2007 30 Past! M B Pometto A p., Nuti M p., Crawford D L Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp.2213-2218 1990 45 31 R Gupta O.K Beg, p Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial application Appl Microbiol Biotrechol 59 (1), p 15, 2002 32 Riedlinger, J., Reicke, A., Zahner, H., Krismer, B Bull, A T Maldonado, L A., Ward, A c., Goodfellow, M., Bister, B Bischoff D., Sussmulh, R D & Fiedler, H p Abyssomicins, inhibitors of the para-aminobenzoic acid pathway produced by the marine Verrucosisporastrain AB-18-032 Journal of Antibiotics, 2004 33 Saga T., Yamaguchi K History of antimicrobial agents and resistant bacteria J Japan Med Assoc, 137 pp.513-517, 2008 34 Seong c N„ Kim Y s., Baik K s„ Lee s D„ Hah Y c Kim s B„ Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge foam, J Microbiol, 37 pp.66-72, 1999 35 Sherif s Ebada and Peter Proksch (2012), The Chemistry of Marine Sponges Handbook of Marine Natural Products (190-294) 36 Sitachitta, N., Gadepalli M & Davidson B s., AYvv a-pyrone-containing metabolites from a marine-derived actinomycete, Tetrahedron , 1996 37 Steger K, PhD Thesis: Composition of microbial communities in composts A tool to assess process development and quality of the final product Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006 38 Suzumura, K„ Yokoi, T„ Funatsu, M„ Nagai, K., Tanaka, K Zhang, H & Suzuki K., YM-266183 and YM-266184 novel thiopeptide antibiotics produced by Bacillus cereus isolated from a marine sponge II Structure elucidation Journal of Antibiotics, 2003 39 Teasdale, M E., Liu, J., Wallace, J., Akhlaghi, F & Rowley, D c., Secondary metabolites produced by the marine bacterium Halobacillus salinusthat inhibit quorum sensing-controlled phenotypes in gram-negative bacteria, Applied and Environmental Microbiology, 2009 40 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu c, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinomacells in vitro Transpl Immunol 2007 46 Các trang web tham kháo 41 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuanO htm 42 http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR 43 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 44 http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-nghien-cuu-xa-khuan-thuoc-chi- streptomvces-sinh-chat-khang-sinh-chong-nam-gav-benh-tren-cav-che-othai-nguven-1761/ 45 http://vietscicnccs.frcc.fr/khaocuu/nguvcnlandung/phanloaixakhuanOI.htm 46 http://www.slideshare.net/phongphunguyen 16/khng-sinh 47 http://www.vnua.edu.vn:85/tc khktnn/Upload%5C2102014tc%20.so%205%204.pdf 48 http://vi.wikipedia.org/wiki/K%C3%ADnh_hi%E1%BB%83n_vi_%C4%91i %E1 %BB%87n_t%El %BB%AD_qu%C3%A9t Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội 47 LÒI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quà số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa sứ dụng đế bào vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dần luận văn chì rõ nguồn gốc Sinh viên Âu Hoài Thương Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội 48 ... cứu số chúng xạ khn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết > Phân lập làm chung xạ khuấn từ mẫu trầm tích > Kiếm tra hoạt tính kháng sinh chúng xạ khuấn với vi sinh vật kiếm định > Thư vi? ??n... đề tài: Phân lập định danh số chúng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định từ trầm tích biến thu thập Cơ Tơ - Thanh Lân 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập làm xạ khuân từ mầu tram tích -... Đanh sách mẫu trầm tích thu thập Cô Tô - Thanh Lân 28 Bàng 4.2 Danh sách 20 chùng xạ khuẩn phân lập dược 30 Báng 4.3 Kct thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiếm định chùng xạ khuẩn 32 Bàng