Đề tài nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không ở bà rịa – vũng tàu

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GC – MC: Gas Chromatography – Mass Spectometry VPC: Vapour Phase Chromatography TSB: Tryptic Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB MHA: Mueller Hinton Agar – Môi trường dinh dưỡng MHA PDA: Potato dextrose agar (PDA) – Môi trường dinh dưỡng PDA MHB: Mueller Hinton Broth (MHB – Môi trường dinh dưỡng MHB XLD: Xylose Lysine Deoxycholate – Môi trường dinh dưỡng XLD MYP: Mannitol Egg Yolk Polymixin – Môi trường dinh dưỡng MYP EMB: Eosin Methylene Blue – Môi trường dinh dưỡng EMB DMSO: Dimethyl sulfoxide - Hợp chất hữu lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO DNA: Acid deoxyribonucleic - Phân tử mang thơng tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng, phát triển, chuyên hóa chức sinh sản sinh vật nhiều loài virus STEC: Shiga toxin-producing E coli – Một số E coli sản sinh độc tố có tên độc tố Shiga gây tiêu chảy CFU/ml: Colony Forming Unit/ đơn vị hình thành khuẩn lạc v/w: Volume/weight (Thể tích/ Khối lượng) w/w: Weight/weight (Khối lượng/ Khối lượng) i DANH MỤC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH Hình 1:Một số loài thuộc họ hồ tiêu .3 Hình 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography) 18 Hình 3: Sắc ký đồ 19 Hình 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 20 Hình 5: Vi khuẩn Bacilus cereus kính hiển vi mơi trường thạch MP 22 Hình 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus kính hiển vi môi trường thạch MSA .24 Hình 7: Vi khuẩn Escherichia coli kính hiển vi mơi trường thạch EMB .26 Hình 8: Vi khuẩn Salmonella kính hiển vi mơi trường XLD 27 Hình 9: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kính hiển vi mơi trường MP .28 Hình 1: Lá Trầu không 30 Hình 2: Hệ thống chưng cất tinh dầu Trầu khơng phịng thí nghiệm .33 Hình 3: Mơ tả cách đo vòng tròn kháng khuẩn (Hudzicki, 2009) .42 Hình 1: Mẫu tinh dầu chiết phịng thí nghiệm 48 Hình 2: Sắc ký đồ tinh dầu Trầu không 52 Hình 3: Khả kháng B cereus tinh dầu Trầu khơng .56 Hình 4: Khả kháng E Coli tinh dầu Trầu không .56 Hình 5: Khả kháng S typhi tinh dầu Trầu không 57 Hình 6: Khả kháng S aureus tinh dầu Trầu không 57 Hình 7: Khả kháng P aeruginosa tinh dầu Trầu không 58 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Bảng dụng cụ thiết bị 30 Bảng 1: Các thông số sử dụng để khảo sát tỷ lệ nước/nguyên liệu 43 Bảng 2: Kết khảo sát tỷ lệ nước ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 43 Bảng 3: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian ngâm .44 Bảng 4: Kết khảo sát thời gian ngâm ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 44 Bảng 5: Các thông số sử dụng để khảo sát thời gian chưng cất 45 Bảng 6: Kết khảo sát thời gian chưng cất ảnh hưởng đến tỷ lệ tinh dầu 45 Bảng 7: Kết trung bình cộng ba lần cân ống tiêm để đo tỷ trọng tinh dầu 48 Bảng 8: Kết định tính thành phần dịch chiết Trầu không .49 Bảng 9: Kết phân tích thành phần hóa học tinh dầu Trầu khơng .53 Bảng 10: So sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu huyện Châu Đức với vùng khác Việt Nam 54 Bảng 11: Đường kính vịng kháng khuẩn tinh dầu Trầu không (mm) 55 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1: Quy trình cơng nghệ chiết tách tinh dầu Trầu không 32 Sơ đồ 2: Quy trình chiết tách xác định tỷ lệ nước/nguyên liệu 34 Sơ đồ 3: Quy trình chiết tách xác định thời gian ngâm .35 Sơ đồ 4: Quy trình chiết tách xác định thời gian chưng cất 36 Sơ đồ 1: Quy trình hồn thiện chiết tách tinh dầu Trầu khơng .47 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Thể tinh dầu thu phụ thuộc vào tỷ lệ nước/nguyên liệu 43 Biểu đồ 2: Thể lượng tinh dầu thu phụ thuộc vào thời gian ngâm 45 Biểu đồ 3: Thể lượng tinh dầu thu phụ thuộc vào thời gian chưng cất 46 iii Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày mà xã hội không ngừng phát triển, đời sống vật chất tinh thần người ngày nâng cao, vấn đề chăm sóc bảo vệ sức khỏe người ngày trọng Với việc ứng dụng tiến khoa học vào lĩnh vực y học người nghiên cứu tổng hợp điều chế nhiều loại dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Các dược liệu có hợp chất tự nhiên ngồi tác dụng chữa bệnh bổ sung cho thể dưỡng chất, không độc hại, thể hấp thụ tốt không gây tác dụng phụ Do đó, việc phát sâu nghiên cứu hợp chất có thảo dược trọng Việt Nam ta nước nhiệt đới, nóng, ẩm mưa nhiều, có nguồn dược liệu phong phú lên đến 12000 loài, đa dạng y học dân tộc phát triển lâu đời Từ xa xưa, ông cha ta biết sử dụng nhiều loại thảo dược việc dưỡng thương, trị bệnh bồi bổ thể Những năm gần đây, thuốc tân dược y học đại sử dụng cách rộng rãi vị thuốc dân gian đóng vai trị quan trọng đời sống ngày người, có nhiều bệnh tật chữa khỏi nhờ loại thảo Lá Trầu không quen thuộc với chúng ta, dân gian sử dụng xông cho phụ nữ sau sinh, tắm cho trẻ sơ sinh Trong y học cổ truyền, trầu vị nồng, cay, tính ấm, cơng dụng ơn trung (làm ấm bụng), tán hàn (trừ lạnh) So với nhiều loại dược liệu khác thông tin khoa học trầu không chưa rộng rãi Trên tinh thần mong muốn đóng góp phần tìm hiểu mối quan hệ thành phần hóa học với cơng dụng dược tính sử dụng em chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Trầu không tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu” Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu Trầu khơng - Nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng, từ xây dựng quy trình chiết tinh dầu - Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trầu không Đối tượng nghiên cứu GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Lá Trầu khơng sử dụng nghiên cứu thu hái xã Nghĩa Thành, huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Nhiệm vụ nghiên cứu - Xây dựng quy trình chiết xuất tinh dầu, xác định thành phần hóa học tinh dầu Trầu không - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết tinh dầu - Xác định tỷ trọng tinh dầu - Định tính flavonoids, ankaloid, steroid, anthraquinones, saponin, tanin dịch chiết Trầu không - Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trầu khơng Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm Nghiên cứu Khoa học, Viện Kỹ thuật – Kinh tế biển, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp thu thập, tổng hợp tài liệu - Phương pháp phân tích, đánh giá tài liệu - Phương pháp xử lý số liệu Các kết đạt đề tài - Trích ly tinh dầu với phương pháp điều kiện tối ưu - Xác định tỷ trọng, màu sắc, mùi vị tinh dầu Trầu không - Khả kháng khuẩn tinh dầu Trầu không hiệu chủng vi khuẩn Cấu trúc đồ án Cấu trúc báo cáo gồm chương: Chương 1: Tổng quan lý thuyết Chương 2: Thực nghiệm Chương 3: Kết thực nghiệm Chương 4: Kết luận kiến nghị GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Khái quát họ Hồ tiêu [1] Họ Hồ tiêu (Piperaceae) họ thực vật chứa 2.000 lồi, nhóm chi Chúng loại bụi hay dây leo khu vực nhiệt đới Các lồi họ nói chung có hoa chia thành chuỗi, thơng thường có mùi thơm mạnh, cay nồng Quan trọng mặt kinh tế họ bao gồm loại ăn hạt, tiêu, trầu, lốt, xem hình 1.1 Hình 1:Một số lồi thuộc họ hồ tiêu 1.1.1 Phân loại khoa học [1] Tên khoa học trầu Piper betle Cây trầu gọi trầu không, betel Baum (Đức), árbol de betel (Tây Ban Nha), arbre de betel (Pháp), pokok sirih (Malaisia), Betel Boom (Hà Lan) 1.1.2 Phân bố [1] Loài có nguồn gốc vùng Đơng Nam Á trồng Ấn Độ, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia Lá trầu loại tốt thuộc giống "Magahi" (từ vùng Magadha) sinh trưởng gần Patna Bihar, Ấn Độ Ở nước ta, trầu trồng khắp vùng miền với quy mơ lớn nhỏ khác Có thể trồng riêng lẻ hộ GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học gia đình trồng thành vườn 1.1.3 Đặc tính thực vật [1] Cây trầu hay trầu không gia vị, thuốc Đây loại thường có màu xanh, dây leo, sống lâu năm, hình trái tim có mặt bóng hoa sóc màu trắng 1.1.4 Thành phần hóa học trầu [1] Các cơng trình nghiên cứu trước cho thấy trầu chứa thành phần sau: - Lá trầu chứa tinh dầu gồm 23 thành phần, chủ yếu: 3-Allyl- 6-methoxyphenyl acetate (14,95%); 4-Allyl-1,2- diacetoxybenzene (8,98%); Chavicol (4,57%); Eugenol (9,03%); Beta-caryophyllene (7,06%); Linalool (1,55%) Tinh dầu có màu vàng nhạt, hương thơm nồng, nếm có vị nóng cay - Nhiều nghiên cứu gần cho biết trầu chứa chất tanin, đường khử, pectin 10%, flavonoid, alkaloid, phytosterol, steroid, axit hữu 1.1.5 Lợi ích trầu [14] - Lá dùng để xông giúp phụ nữ sau sinh kháng khuẩn vùng kín - Lá dùng để hơ trẻ sơ sinh giúp khử trùng tự nhiên kháng chủng vi khuẩn gây bệnh cho trẻ, chữa phát ban, chữa ho, mát xa trầu giảm chướng bụng, khó tiêu - Tại Thái Lan Trung Quốc chúng dùng để làm dịu bệnh đau Lá trầu nhai với vôi giúp sát trùng miệng, chữa viêm mũ chân răng, giúp khỏe - Ăn trầu giúp không bị bệnh đường tiêu hóa, kí sinh trùng ruột - Nước sắc trầu để rửa đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm - Lá trầu ngâm nước sôi dùng nhỏ mắt chữa viêm kết mạc - Các trầu không sử dụng chất kích thích, chất khử trùng chất làm thở Trong y học Ayurveda, chúng sử dụng thuốc kích dục - Tại Malaysia chúng sử dụng để điều trị chứng đau đầu, viêm khớp thương tổn khớp - Tại Indonesia chúng uống loại trà sử dụng thuốc kháng sinh Chúng sử dụng trà để điều trị chứng khó tiêu, thuốc mỡ hay thuốc hít để điều trị đau đầu, điều trị chứng táo bón, có GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học tác dụng thơng mũi hỗ trợ tiết sữa - Người Việt Nam từ hàng ngàn năm sử dụng Trầu Không + Cau để sáng tạo lên ăn truyền thống mang ý nghĩa nhân văn văn hóa người Việt Nam " miếng trầu đầu câu chuyện" 1.2 Tổng quan tinh dầu [5] Tinh dầu từ lâu loài người biết đến, từ thời thượng cổ người ta biết đến sử dụng loại có tinh dầu dạng phơi khô, thời kỳ trung cổ khoảng kỷ thứ 15 tinh dầu ngày phổ biến, từ kỷ thứ 15 đến kỷ thứ 17 tinh dầu sử dụng để làm thơm cho tóc da mặt, dùng để chữa bệnh dùng đời sống hàng ngày người Từ kỷ thứ 17 đến kỷ thứ 19, tinh dầu dùng nhiều để trang điểm, làm thuốc dùng công nghiệp với phạm vi rộng Từ kỷ 20 đến năm đầu kỷ 21, với tiến nhân loại tiến khoa học kỹ thuật, nghành công nghiệp sản xuất tinh dầu dần phát triển, tinh dầu trở thành sản phẩm thiếu đời sống người ứng dụng rộng rãi ngành công nghiệp như: hương liệu, thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm 1.2.1 Khái niệm [5] Tinh dầu hỗn hợp nhiều cấu tử dễ bay hơi, có mùi thơm hay mùi hắc khó chịu tách từ phận thực vật, sản phẩm trình chưng cất chiết nguyên liệu Tinh dầu sản phẩm cuối trình trao đổi chất không sử dụng lại hoạt động sống Mỗi loại tinh dầu lấy từ nguồn nguyên liệu khác có mùi vị khác nhau, phụ thuộc vào thành phần hợp chất có Hệ thực vật có tinh dầu khoảng 3000 lồi, có 150 – 200 lồi có ý nghĩa cơng nghiệp làm xà phịng, hương liệu bánh kẹo, nước giải khát; ngành y học có nhiều đóng góp giảm stress, tá dược thuốc… 1.2.2 Phân loại tinh dầu [5] Có hai loại tinh dầu: tinh dầu nguyên chất tinh dầu không nguyên chất: + Tinh dầu nguyên chất: Hồn tồn khơng có độc tố, khơng có chất bảo quản hóa học nên an tồn cho người sử dụng mang kết nhanh điều trị + Tinh dầu không nguyên chất: Là tinh dầu pha từ tinh dầu nguyên chất với GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học chất hóa học khác mà giữ hương tinh dầu 1.2.3 Tính chất vật lí thành phần hóa học tinh dầu [5] 1.2.3.1 Tính chất vật lý tinh dầu [5] - Tinh dầu thường tồn dạng thể lỏng nhiệt độ thường, mùi thơm nhẹ, có màu trừ tinh dầu chứa aluzen có màu xanh, tinh dầu có tỉ trọng nhỏ tỉ trọng nước nên nhẹ nước, số khúc xạ cao Tinh dầu bay được, tinh dầu tan nước làm cho nước có mùi thơm, tinh dầu hỗn hợp nên khơng có nhiệt độ sơi định, tinh dầu tan tốt cồn, ete, dung môi hữu chất béo - Để xác định tính chất vật lý tinh dầu, thông thường người ta tiến hành xác định số tỷ trọng, chiết suất, tỷ lệ hòa tan cồn 900C 2500C, nhiệt độ sôi, suất quay cực, màu sắc - Hầu hết tỷ trọng loại tinh dầu thường nhỏ 1, chúng thường nhẹ nước Tùy nhiên, có vài tinh dầu có khối lượng riêng lớn nước (như tinh dầu quế, tinh dầu đinh hương, ) - Tinh dầu khơng tan tan nước chúng hòa tan tốt đa số dung môi hữu este, cồn, Mặc dù thành phần hóa học loại tinh dầu khác nhau, nhìn chung chúng có nhiệt độ sôi khoảng 800C – 1500C, dễ bay có mùi thơm - Về màu sắc, tinh dầu thường khơng màu có màu vàng nhạt Một số tinh dầu có màu (ví dụ: tinh dầu ngải cứu có màu xanh lơ, tinh dầu quế có màu sẵm) có mặt hợp chất có màu lơi kéo theo tinh dầu q trình chiết xuất (ví dụ: màu xanh có chlorophyll, màu vàng có carotenoid, ) Cịn mùi vị tinh dầu chủ yếu gây cấu tử bị oxy hóa 1.2.3.2 Các thành phần hóa học tinh dầu [5] - Tinh dầu loại chất lỏng tinh chế (thông thường cách chưng cất nước) từ cây, thân cây, hoa, vỏ cây, rễ cây, thành phần khác thực vật Tinh dầu đưọc ví nhựa sống cây, mang sức sống, lượng mạnh 100 lần loại thảo dược sấy khô - Hidrocacbon: Các hidrocacbon thường gặp tinh dầu terpen (C10H16)n mạch hở mạch vòng Bất kỳ loại tinh dầu có thành phần sau: GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học  Monoterpenes: Được tìm thấy hầu hết loại tinh dầu, Monoterpenes có cơng thức phân tử C10H16 mạch hở Tiêu biểu miaxene, oximene có tinh dầu hoa nguyệt quế Miaxene - Oximene Monoterpenes chất khử trùng thuốc bổ tự nhiên, chúng lọc khơng khí tốt có mặt hầu hết loại tinh dầu  Sesquiterpene: Mặc dù dễ bay Monoterpenes, Sesquiterpene mạch thẳng vòng tiêu biểu Farnesene, Zingiberene Farnesene - Sesquiterpene có khoảng 15 nguyên tử cacbon Và có số tác dụng làm dịu, chống viêm chống nhiễm trùng  Phenol: Một số chất phenol trích từ loại tinh dầu như: Thymol, Estragol, Eugenol, Thymol Estragol Eugenol - Các chất khử trùng hầu hết hóa chất có thực vật, kích thích thể, phenol có tác dụng sử dụng với liều lượng nhỏ Tuy nhiên, liều lớn chất độc cho hệ thần kinh gây kích ứng da GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học - Làm khan: cho Na2SO4 vào bình chiết đựng tinh dầu thơ, vừa cho vừa khuấy thấy tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời - Sản phẩm tinh dầu thu cho vào lọ tối màu, tránh ánh sáng chiếu vào Các tia UV ánh sáng làm phá vỡ phân tử, thúc đẩy hình thành gốc tự gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu Bảo quản tinh dầu nhiệt độ – 40C 3.3 Kết xác định số số lí hóa tinh dầu Trầu không 3.3.1 Đánh giá cảm quan Hình 1: Mẫu tinh dầu chiết phịng thí nghiệm a/ Màu sắc độ suốt: có màu vàng nhạt, suốt khơng bị đục b/ Mùi: nồng, đặc trưng tinh dầu Trầu không, c/Vị: cay 3.3.2 Tỷ trọng Bảng 7: Kết trung bình cộng ba lần cân ống tiêm để đo tỷ trọng tinh dầu TB cộng Ống tiêm không(G) Ống tiêm chứa nước cất(G1) 2,986 2,935 3,005 2,975 4,14 4,081 4,135 4,118 4,013 3,97 4,023 4,002 Ống tiêm chứa tinh dầu Trầu không(G2) GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 48 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học 𝑑= 𝐺−𝐺2 𝐺−𝐺1 = 2,975−4,002 2,975−4,118 = 0,898 G: Khối lượng ống tiêm không, (g) G1: Khối lượng ống tiêm có nước, (g) G2: Khối lượng ống tiêm có tinh dầu, (g) 3.4 Kết định tính thành phần dịch chiết Trầu không Để xác định sơ thành phần chất có mẫu tinh dầu Trầu khơng khảo sát, tơi tiến hành định tính số hợp chất có mẫu trình bày phần 2.8 Kết ghi nhận thể bảng 3.8 Bảng 8: Kết định tính thành phần dịch chiết Trầu khơng Thí nghiệm Kết Kết luận 1.Định tính Ankaloid Thuốc thử Wagner 2.Định tính Flavonoids Thử nghiệm NaOH 10% + GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 49 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Thử nghiệm FeCl3 + 3.Định tính Anthraquinones Phản ứng Bomtra eger + 4.Định tính Steroid + Thử nghiệm H2SO4đđ 5.Định tính Saponin Thử nghiệm 1: + Thử nghiệm 2: + 6.Định tính Tanin GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 50 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Thử nghiệm FeCl3 + Nhận xét: Từ thử nghiệm khảo sát định tính trình bày, có thử nghiệm có kết dương tính: Flavonoids; Anthraquinones; Steroid; Saponin; Tanin Theo nghiên cứu Nguyễn Nho Dũng (2011) dịch chiết trầu có chứa Ankaloid, theo nghiên cứu khơng có Ngun nhân khác giống, khác điều kiện canh tác, đất đai, thời tiết nên dẫn đến kết khơng có giống 3.5 Kết xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu theo công thức: η= 𝑉𝑇𝐷 𝑑𝑇𝐷 𝑚𝑁𝐿 = 1,5 1,046 500 = 0,27% Trong đó: η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%) 𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu (ml) 𝑑 𝑇𝐷 : tỷ trọng tinh dầu (g/ml) 𝑚𝑁𝐿 : khối lượng nguyên liệu đem chưng (g) GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 51 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học 3.6 Kết xác định thành phần hóa học mẫu tinh dầu Trầu không tối ưu phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS 3.6.1 Sắc ký đồ tinh dầu Trầu không Hình 2: Sắc ký đồ tinh dầu Trầu không Nhận xét: Qua kết sắc ký đồ, tơi nhận thấy có 18 giá trị có thời gian lưu khác nhau, điều có nghĩa mẫu tinh dầu Trầu khơng thu có chứa 18 cấu tử, ứng với 18 hợp chất Các cấu tử điểm peak: 14,994; 28,801; 21,47 có thời gian lưu cách xa có cường độ tương đối lớn, chứng tỏ cấu tử có hàm lượng cao tinh dầu Các cấu tử lại có cường độ tương đối thấp nên có hàm lượng không đáng kể tinh dầu Trầu không Cũng có số cấu tử có thời gian lưu gần nhau, chúng đồng phân cấu tử peak: 21,592; 21,792 GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 52 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học 3.6.2 Thành phần hóa học tinh dầu Trầu khơng Bảng 9: Kết phân tích thành phần hóa học tinh dầu Trầu không Hàm lượng TT RT Tên chất 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 5.079 6.840 7.093 8.212 11.899 14.289 14.994 15.198 15.563 15.736 16.314 17.140 17.653 17.802 18.172 18.351 18.800 18.920 20.233 20.425 20.637 21.207 21.470 -Pinene Eucalyptol β-Ocimene Linalool p-Allylphenol Chavicol, acetate Eugenol -Copaene β-Elemen Methyleugenol Caryophyllene Humulene -Muurolene Germacrene D (+)-Bicyclogermacrene β-Bisabolene Aceteugenol (E)--Bisabolene (-)-Globulol (+)-Viridiflorol Rosifoliol 1,10-Diepicubenol 2-(Acetyloxy)-4allylphenyl acetate -Cadinol -Cadinol 23 24 25 21.592 21.792 0.629 0.642 0.493 0.323 0.755 2.337 33.142 0.334 0.655 0.274 3.118 0.794 2.159 5.017 3.041 0.672 28.801 0.256 0.381 0.375 0.166 0.178 14.749 0.167 0.543 Mass 136 154 136 154 134 176 164 204 204 178 204 204 204 204 204 204 206 204 222 222 222 222 234 222 222 Độ tương hợp khối phổ 945 941 952 928 911 957 938 915 909 923 948 943 938 942 910 823 918 902 915 905 858 856 901 899 911 Nhận xét: Theo bảng phân tích thành phần hóa học mẫu tinh dầu Trầu không cho thấy có tổng cộng 25 cấu tử định danh, sắc ký đồ thể 18 điểm peak có tên biểu đồ Có lẽ nguyên nhân điểm peak cấu tử cịn lại có cường độ thấp nên tên cấu tử lên biểu đồ Kết bảng phân tích cho thấy thành phần tinh dầu Trầu không Châu Đức, TP.Bà Rịa gồm 25 cấu tử thành phần chủ yếu là: Eugenol chiếm 33,142%; Aceteugenol chiếm GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 53 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học 28,801%; 2-(Axetyloxy)-4-allylphenyl acetate chiếm 14,749%; Germacrene D chiếm 5,017%; Caryophyllene chiếm 3,118%; (+)-Bicyclogermacrene chiếm 3,041%; Chavicol,acetate chiếm 2,337%; 𝛾-Muurolene chiếm 2,159% Kết chạy sắc ký phổ cho thấy diện tích peak Eugenol có diện tích lớn nhất, mẫu tinh dầu Eugenol thành phần chủ yếu 3.6.3 So sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu huyện Châu Đức, thành phố Bà Rịa với số vùng khác công bố Việt Nam Sau có kết thành phần hóa học tinh dầu Trầu khơng Châu Đức, Tp Bà rịa tiến hành so sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu khơng với vùng khác công bố Việt Nam Thành phần tinh dầu Châu Đức, Tp Bà rịa có 25 cấu tử, thành phần tinh dầu Trầu Hậu Giang có cấu tử, thành phần tinh dầu Trầu Quãng Nam có 49 cấu tử, thành phần tinh dầu Trầu Hóc Mơn, Tp Hồ Chí Minh có 51 cấu tử thành phần cấu tử trình bày bảng 3.9 Bảng 10: So sánh thành phần hóa học tinh dầu Trầu huyện Châu Đức với vùng khác Việt Nam STT Hợp chất Hàm lượng % I II III IV Eugenol 33,142 - - - Methyleugenol 0,274 34,55 8,34 6,31 Aceteugenol 28,801 20,14 16,55 13,68 Germacrene D 5,017 - 5,21 4,12 𝛾-Muurolene 2,159 1,33 - - 𝛼-Cadiol 0,543 5,51 - - Trong đó: (I) Trầu Châu Đức, Tp.BR, (II) Trầu Hậu Giang [3], (III) Trầu Quãng Nam [1], (IV) Trầu Hóc Mơn, Tp.HCM [1] Nhận xét: Đối chiếu thành phần hóa học tinh dầu Trầu huyện Châu Đức với vùng khác Việt Nam nhận thấy có khác hợp chất bốn tinh dầu vùng khác Trong hợp chất chủ yếu tinh dầu Trầu huyện Châu Đức Eugenol (33,142%) Methyleugenol (35,55%) thành phần chiếm hàm lượng cao tinh dầu Trầu Hậu Giang; Quãng Nam với Hồ Chí Minh Aceteugenol lại chiếm hàm lượng cao là: 16,55% 13,68% Có GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 54 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học khác điều kiện khí hậu, thỗ nhưỡng phương pháp trích ly tinh dầu Ngồi ba hợp chất Eugenol cịn có ba hợp chất là: Germacrene D, 𝛾-Muurolene, 𝛼-Cadiol, chứng tỏ tinh dầu tách chiết phịng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu đem phân tích Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam tinh dầu Trầu khơng Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu phương pháp 3.7 đo đường kính vịng kháng khuẩn Khả kháng khuẩn xác định dựa khả ức chế phát triển vi khuẩn thể qua đường kính kháng khuẩn tạo đĩa Petri trình bày bảng 3.8 Bảng 11: Đường kính vịng kháng khuẩn tinh dầu Trầu khơng (mm) STT Nồng độ µl/ml 1024 B cereus E coli P S typhi S areus 8,33±1,11 3,00±0,00 3,5±0,5 4,33±1,11 5,33±2,44 512 5,33±1,55 2,67±0,44 2,5±0,5 2,33±0,44 3,00±0,0 256 5,00±1,00 1,00±0,00 - 2,33±0,44 1,00±0,00 128 4,00±0,67 - 1,3±1,00 - Tetracyclin Ampicilin Amoxycilin - aeruginosa 2,67±0,89 4,00±0,00 5,00±0,00 8,00±0,00 6,00 ±0,00 7,33±0,44 4,00±0,00 - - 2,00±0,00 - - - - 3,00±0,00 - - - - - DMSO 2% + TWEEN 80 0,2% Theo bảng 3.8 đánh giá sơ khả kháng khuẩn tinh dầu Trầu không chủng vi khuẩn rút số nhận xét sau: Trên chủng vi khuẩn B cereus khảo sát nồng độ nhận thấy nồng độ GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 55 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học 1024 µl/ml có hoạt tính kháng khuẩn cao với kết 8,33±1,11mm, hai nồng độ 512µl/ml 256µl/ml khơng chênh lệch đáng kể kết 5,33±1,55 mm 5,00±1,00mm Nồng độ cịn lại 128µl/ml kết thu 4,00±0,67mm Kết cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Trầu khơng chủng B cereus tương đối cao, nhận thấy tinh dầu Trầu khơng có khả kháng chủng tốt kể nồng độ thấp (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): Tetracyclin, (6): Ampicilin, (7): DMSO 2% + Tween 80 0,2% Hình 3: Khả kháng B cereus tinh dầu Trầu không Trên chủng vi khuẩn E coli, sau tiến hành khảo sát nhận thấy hai nồng độ 1024µl/ml 512µl/ml khả kháng khuẩn khơng chênh lệch nhiều, mức 3,00±0,00mm 2,67±0,44 mm Nồng độ 256µl/ml khả kháng đạt 1,00±0,00mm khơng kháng nồng độ 128µl/ml Qua kết cho thấy, hoạt tính kháng vi khuẩn E coli tinh dầu Trầu không thấp so với chủng vi khuẩn cịn lại Hình 4: Khả kháng E Coli tinh dầu Trầu khơng (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 56 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Trên chủng vi khuẩn S typhi, sau tiến hành khảo sát ta nhận thấy tinh dầu Trầu không kháng vi khuẩn S typhi hai nồng độ 1024µl/ml 512µl/ml, kết là: 3,5±0,5mm 2,5±0,5mm Còn nồng độ 256µl/ml 128µl/ml khơng có khả kháng S typhi Như vậy, qua kết cho thấy khả kháng vi khuẩn S typhi tinh dầu Trầu khơng Hình 5: Khả kháng S typhi tinh dầu Trầu không (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin Trên chủng vi khuẩn S aureus, nồng độ khảo sát giảm dần vịng kháng khuẩn là: 1024 µl/ml ứng với 4,33±1,11mm, 512 µl/ml 256 µl/ml có vịng kháng 2,33±0,44mm, 128 µl/ml ứng với 1,3±1,00mm Qua kết cho thấy, khả kháng vi khuẩn S aureus tinh dầu Trầu không thấp B cereus, cao E coli S typhi Hình 6: Khả kháng S aureus tinh dầu Trầu khơng (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 57 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học Trên chủng vi khuẩn P aeruginosa có thay đổi vòng kháng rõ rệt thay đổi nồng độ từ cao đến thấp Ở nồng độ cao 1024 µl/ml vịng kháng tương ứng 5,33±2,44mm, nồng độ giảm xuống 512 µl/ml vịng kháng cịn 3,00±0,0mm, nồng độ giảm thêm cịn 256 µl/ml vòng kháng 1,00±0,0mm; nồng độ thấp 128 µl/ml hồn tồn khơng kháng P aeruginosa Hình 7: Khả kháng P aeruginosa tinh dầu Trầu khơng (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin Dựa kết thí nghiệm với DMSO 2% + Tween 80 0,2%, mẫu chứng âm khơng xuất vịng kháng khuẩn, điều khẳng định đa số thí nghiệm kháng khuẩn dùng DMSO làm chứng âm [10] DMSO Tween 80 dùng để phân tách tinh dầu nhỏ để dễ dàng khuếch tán vào đĩa giấy Vì kết luận DMSO hịa tan đa số hợp chất sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh hưởng đến kết kháng khuẩn [12] - Tinh dầu Trầu khơng có khả kháng chủng vi khuẩn thử nghiệm Mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu thử nghiệm Hiệu kháng tinh dầu Trầu không tốt chủng B cereus thấp chủng E coli S typhi Đối với S aureus P aeruginosa mức độ kháng không cao so với B cereus Ở nồng độ thấp (128µl/ml) khơng kháng chủng E coli, S typhi P aeruginosa; có kháng B cereus S areus 4,00±0,67mm 1,3,00±0,0mm - Ở nồng độ 1024µl/ml, hiệu kháng tinh dầu Trầu không thấp Tetracyclin mức 30µg, tương đương với Ampicilin mức 10µg cao Amoxylin mức 10µg GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 58 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu tinh dầu Trầu không, rút số kết luận sau: - Qua q trình thực nghiệm tơi xây dựng quy trình trích ly tinh dầu Trầu khơng kết hợp với điều kiện thích hợp nhằm thu lượng tinh dầu cao sau: Tỷ lệ nước/nguyên liệu 4/1 (v/w) Thời gian ngâm 90 phút Thời gian chưng cất 270 phút Tỷ lệ khối lượng tinh dầu Trầu không 0,27% (w/w) - Bằng phương pháp chưng cất lôi nước tách tinh dầu Trầu không Tinh dầu chất lỏng, có màu vàng nhạt, nhẹ nước có tỷ trọng 0,898g/cm3, mùi nồng, đặc trưng tinh dầu Trầu không vị cay - Dịch chiết Trầu khơng có chứa Flavonoid, Steroid, Anthraquinone, Saponin, Tanin - Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS xác định 25 cấu tử có tinh dầu Trong thành phần Trầu không hợp chất Eugenol chiếm 33,142% - Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu Trầu không chủng vi khuẩn thử nghiệm cho thấy nồng độ cao 1024µl/ml đạt đường kính vịng kháng khuẩn cao loại chủng vi khuẩn nồng độ thấp 128µl/ml tinh dầu Trầu khơng cịn hoạt tính B cereus S areus, chủng lại nồng độ thấp khơng có hoạt tính kháng Ngồi ra, nồng độ 1024µl/ml nhận thấy tinh dầu Trầu khơng có khả kháng tốt kháng sinh Amoxylin tương đương với Ampicilin, thấp so với Tetracyclin 4.2 Kiến nghị Đề tài cần nghiên cứu thêm: GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 59 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học - Các giống Trầu khơng nhiều nơi khác, điều kiện đất canh tác, mùa khô mùa mưa, phương pháp bảo quản Trầu không ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước thành phần tinh dầu - Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần chất có thân, rễ hoa Trầu không, so sánh với thành phần chất có Trầu khơng Từ chọn nguồn nguyên liệu tối ưu nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu hoạt tính sinh học để phục vụ cho ngành y học - Áp dụng phương pháp vào q trình trích ly như: chưng cất nước muối NaCl, chưng cất nước kết hợp với vi sóng, … - Xác định tính chất vật lý khác tinh dầu như: độ khúc xạ ánh sáng, góc quay cực - Xác định số hóa học tinh dầu như: số acid, số este, số xà phịng hóa - Tìm hiểu thêm trình làm tinh chế tinh dầu - Thử nghiệm thêm số vi khuẩn khác để đo độ kháng khuẩn tinh dầu Trầu không - Xác định khả chống oxi hóa tinh dầu Trầu khơng GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 60 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Nho Dũng, “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu dịch chiết từ Trầu khơng”, Tóm tắt luận văn Thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng – 2011 [2] Huỳnh Kỳ Trân, Trần Nguyễn Ngọc Châu, Hà Mỹ Thuận, Nguyễn Khoa Nam, Đỗ Việt Hà, “Tinh dầu trầu Piper Betle.L hoạt tính sinh học”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học – Tập 20, số 3/2015 [3] Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm, Phạm Khánh Ngọc, Đỗ Duy Phúc, Dương Tùng Kha, Nguyễn Thị Thu Thủy, “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu trầu khơng (Piper betle.L), họ hồ tiêu (Piperaceae)”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2016, 45a: 28 - 32 [4] Đỗ Tất Lợi (2004), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất Y học [5] Đoàn Ngọc Dũng, “Chiết xuất tinh dầu Bạch đàn phương pháp chưng cất lôi nước”, Đề tài nghiên cứu khoa học 2017, Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu [6] Bùi Thị Hồng Loan, “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng”, Đồ án tốt nghiệp 2017, Trường ĐH Bà Rịa – Vũng Tàu [7] Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Quang Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên, “Khả kháng khuẩn tinh dầu tía tơ”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2015, Tập 13, số 2: 245 – 250 [8] Nguyễn Thị Thắm, Phạm Kim Ngọc, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Đống Thị Anh Đào, “Khả kháng khuẩn chống oxy hóa dịch chiết củ cải trắng”, Tạp chí khoa học, Tập 46, số 2A (2017), tr.66 – 72 [9] Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm 2012 Vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp HCM [10] Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình 2013 Kháng sinh - Đề kháng kháng Sinh - Kỹ thuật kháng sinh đồ Các vấn đề thường gặp Nhà xuất Y học, pp 61 – 63 GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 61 SVTH: Phạm Minh Tú Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học TÀI LIỆU NƯỚC NGỒI [11] Su, Pai-Wei, Yang, Cheng-Hong, Yang, Jyh-Femg, Su, Pei-Yu, Chuang, Li- Yeh, 2015, ‘Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens’, Molecules 2015, Vol 20, pp 11119 - 11130 [12] Yusuf, A Z., Zarik, A., Shemau, Z., Abdullahi, M., Halima, S A “Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol 6, No 2, pp 10 - 16 [13] Senthilkumar, A., Venkatesalu, V.,2013, ‘Chemical constituents, in vitro antioxidant and antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood apple’, Industrial Crops and Products, Vol 46, pp 66 - 72 TÀI LIỆU WEBSIDE [14] Lợi ích Trầu [Internet] Lấy từ URL: https://vietessence.com/san-pham/tinhdau-trau-khong/ [15] Ứng dụng tinh dầu Trầu không [Internet] Lấy từ URL: http://tld.vn/tinh-dautrau-khong.html [16] Vi khuẩn Bacillus cereus [Internet] Lấy từ URL: https://www.scribd.com/doc/33904341/Vi-khuan-Bacillus-cereus [17] Phương pháp hoạt tính sinh học Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên [Internet] Lấy từ URL: http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danhgia-hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html [18] Phương pháp chưng cất nước [Internet] Lấy từ URL: https://www.academia.edu/28723409/3.4_PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT HƠI NƯỚC GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 62 SVTH: Phạm Minh Tú ... kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Trầu không tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu Trầu không - Nghiên cứu khảo sát... chiết Trầu không - Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật trầu không Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành phịng thí nghiệm Nghiên cứu Khoa học, Vi? ??n Kỹ thuật – Kinh tế biển, Trường Đại học Bà. .. Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Vi? ??n Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học chất hóa học khác mà giữ hương tinh dầu 1.2.3 Tính chất vật lí thành phần hóa học tinh dầu [5] 1.2.3.1 Tính chất vật