Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất sinh khổi nấm từ dịch hèm

Trang 1

TRUONG DAI HOC MO HA NOI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP

Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất sinh khối

nắm từ dịch hèm

Trang 2

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MUC TU VIET TAT

DANH MUC BANG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

1.2 Đặc điểm chung của nấm sợi

1.2.1 Hình thái và cấu trúc của sợi nắm

1.2.2 Sinh sản của nắm sợi

1.3 Lên men sinh khối nắm sợ

1.4 Các kỹ thuật lên men chìm

PHAN 2: PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 Vật liệu 2.2 Hĩa chất, thiết bị 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Quan sát hình th:

2.4.2 Phương pháp xác định khối lượng sinh khơi

2.4.3 Phương pháp phân tích đường khử tổng bang DNS

Phương pháp xác định pH

2.4.5 Xác định nồng d6 chat tan Brix 2.4.6 Nơng độ protein

2.4.7 Phương pháp lên men

Trang 3

Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học

3.2.2 Thay đổi kích thước hệ sợi trong lên men

ự thay đổi các thơng số lên men trên quy mơ thiết

3.3.1 Thay đơi của pH trong quá trình lên men

3.4, Đánh giá sự thay đổi các thơng số lên men trên quy mơ thiết bị lên men khuấy trộn

na52

3.4.1 Thay đổi của pH trong quá trình lên men

3.4.2 Nơng độ chat tan Bx 3.4.3 Nong độ đường khử 3.4.4 Nồng độ oxy hịa tan 3.4.4 Nồng độ protein

3.5 So sánh lên men sục khí va lên men khi

Trang 5

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Các chủng nắm mốc sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2 2 Bảng xây dựng đường chuẩn đường khử

Bảng 2 3 Bảng xây dựng đường chuẩn protei

Bảng 3 I Hình ảnh năm chủng lên men bình tam giác 100ml

Bảng 3 2 Néng độ đường khử theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam

giác 100ml

Bảng 3 3 pH theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam giác 100m

Bảng 3 4 4 Nơng độ chất tan theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam giác 100ml

I1 Sinh khơi khơ thu được sau sây bình 1én men 250m 12 Sinh khơi khơ của 5 chủng lên men bình tam giác 250m 13 Hình thái hệ sợi của 5 chủng

14 Bảng hình ảnh chụp 5 chủng cùng thước đo theo thời gian

l5 Kích thước hệ sợi của 5 chủng

16 Hình ảnh hệ sợi 5 chủng lên men sục khí

17 Độ pH trong quá trình lên men sục khí

.18 Nơng độ chat tan trong qua trình lên men sục kl

19 Nồng độ đường khử trong quá trình lên men sục khí

20 Nồng độ protein trong quá trình lên men sục khí

21 Hình ảnh hệ sợi 5 chủng lên men khuấy trội

22 Độ pH trong quá trình lên men khuấy trộn

.23 Nơng độ chất tan Brix trong quá trinh lên men khuây

24 Nồng độ đường khử trong quá trình lên men khuấy

25 Nơng độ protein trong quá trình lên men khuấy trộn

Trang 6

Hình 2 Hình 2 Hình 2 Hình 2

Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 trộn

1 Sơ đỗ quy trình nghiên cứu

2 Đường chuân Protein - Lowry

3 Hệ thơng lên men sục khí

4 Hệ thống lên men khuấy trộn

1 Lên men bình tam giác 100mL 2 Lên men bình tam giác 250mL 3 Bình lên men sục khí theo thời gian

4 Kết quả thu được lên men sục khí

5 Độ pH trong quá trình lên men sục khi

6 Nơng độ chất tan trong quá trình lên men sục khí

7 Nịng độ đường khử trong quá trình lên men sục khí 8 Nồng độ protein trong quá trình lên men sục khí

9 Thiết bị lên men khuấy trộn theo thời gian

10 Kết quả thu được lên men khuấy trội

11 Độ pH trong quá trình lên men khuấy trộn

12 Nơng độ chất tan Brix trong quá trình lên men khuấy trộn

13 Nơng độ đường khử trong quá trình lên men khuấy trộn

14 Nơng độ oxy hịa tan trong quá trình lên men khuấy trộn

15 Nồng độ protein trong quá trình lên men khuấy trộn

Trang 7

MỞ ĐÀU

Hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học cơng nghệ, cơng nghệ sinh

học đã cĩ những nghiên cứu ứng dụng ngày càng đa dạng trong nhiều lĩnh vực

như thực phẩm, y học, nơng nghiệp, cơng nghệ mơi trường, Những sản

phẩm ứng dụng của cơng nghệ sinh học trong các lĩnh vực cĩ thê kể đến như:

thực phâm, kháng sinh, enyme, chế phẩm sinh học, nhiên liệu sinh học, hợp

chất cĩ hoạt tính sinh học trong y dược

Nắm sợi là một trong những giới vi sinh vật đa đa dạng trên trên trái đất được tìm thấy ở hau hết mọi nơi: trong đắt, nước, khơng khí và bên trong các

sinh vật khác Các ước tính gần đây cho thấy cĩ tới 3,8 triệu lồi nắm khác

nhau, trong đĩ chỉ cĩ 120 000 lồi đã được chính thức cơng nhận và chỉ cĩ 35

000 lồi được đặt tên [6] Chúng ta thường nghĩ nắm mốc là những sinh vật gây

hại như âm mốc nhà cửa, quần áo, thực phẩm và gây nên vấn đề về sức khoẻ nhưng thực tế nắm sợi luơn đĩng gĩp nhiều tác dụng tích cực cho cuộc sống, ví dụ như tổng hợp kháng sinh, thuốc, sản xuất thực phẩm và đồ uống, làm sạch nước và khử ơ nhiễm đất, Sinh khối nắm sợi vốn đã được lợi dụng đẻ làm

thay đổi cấu trúc và hương vị của nguyên liệu trong một số thực phẩm truyền thống như tương, tempch, phơ mai chưa kẻ đến các lồi nắm mũ làm nguyên

liệu thực phẩm Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học hiện nay, một trong những

xu hướng mới là sản xuất sinh khối sợi làm mycoprotein và vật liêu mới

Trong quá trình sản xuất cthanol cơng nghiệp sẽ sản sinh một lượng địch

hém thải (bã rượu) rất lớn từ quá trình lên men và chưng cắt với nồng độ chất

hữu cơ cao Thêm vào đĩ, nước vệ sinh, các chất thải khác trong sản xuất cũng

gĩp phân làm tăng chất thải của quá trình sản xuất Với lượng chất thải lớn như

vậy, nếu khơng được xử lý tốt sẽ gây hậu quả nghiêm trọng tới mơi trường

“Thơng thường, các sản phẩm bã hèm từ ngơ cĩ giá trị dinh dưỡng cao thường

được sử dụng cho chăn nuơi, bã hèm từ sắn cĩ giá trị dinh dưỡng thấp và chứa nhiều chất xơ nên hiệu quả trong chăn nuơi khơng cao Đề xử lý dịch hèm hiệu

Trang 8

quả hơn, giảm thiểu tác động tới mơi trường, sử dụng nắm sợi phát triển trên

dich hém làm giảm các chất hữu cơ và thu sinh khối hệ sợi là một hướng đi cĩ

tiềm năng ứng dụng nâng cao giá trị của dịch hèm

Trong quá trình sản xuất sinh khối nắm sợi, quá trình lên men diễn ra phức

ê kích

tạp hơn so với lên men vi khuẩn và nắm men do diễn ra sự thay đổi

thước hệ sợi Nghiên cứu khảo sát các thơng số về thay đổi thành phần dinh dưỡng và biến đồi đặc tính canh trường lên men giúp hiểu hơn về quá trình lên men nhằm mục tiêu điều khiển và tối ưu quá trình lên men Trong nghiên cứu

này, chúng tơi tập trung vào nội dung “Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất

sinh khối nắm từ địch hèm ” nhằm mục tiêu ứng dụng trong lên men sinh khối

nắm sợi từ dịch hèm thải của nhà máy

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu và khảo sát các thơng số biến

đổi của canh trường lên men bao gồm các thơng số chính như pH, nồng độ

đường khử, oxy hịa tan nhằm thu được sinh khối tối đa trong quá trình lên

men

Nội dung chính của nghiên cứu bao gồm:

Trang 9

đồ đá, người ta cắt nắm Fomes /omenarius khỏi các gốc cây và biến nĩ thành vật liệu giống như ni Amadou để làm mũ và áo khốc Trong một thời gian dài, Amadou là vật liệu làm từ nấm duy nhất được sử dụng phơ biến, nhưng điều này sắp thay đổi Trong mười năm qua, các vật liệu làm bằng hoặc từ nấm đã bắt đầu xuất hiện trên các tạp chí thiết kế và nghệ thuật, làm ghế, chụp đèn, ví, Lên men nắm sợi đã được sớm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất kháng

sinh vào năm 1982, lên men enzyme từ nắm sợi là một trong những mảng cĩ

nhiều ứng dụng nhất như amylase từ 4spergillus niger, Aspergillus ory2ae;

cellulase từ A niger, Trichoderma reesei; glucoamylase tir A niger, A

oryzae (Rokem, 2010) Người đầu tiên phát hiện ra chất kháng sinh là bác sĩ

người Anh Alexander Fleming (1881-1955) Năm 1928 ơng là người đầu tiên

tách được chủng nắm sinh chất kháng sinh penixilin, mở ra một kỉ nguyên mới

cho khả năm tự đây lùi nhanh chĩng các bệnh nhiễm khuẩn Ơng được nhận

giải thưởng Nobel vào năm 1952 Hàng loạt các chất kháng sinh quan trong

khác đã được liên tiếp phát hiện ra và ứng dụng vào các năm tiếp sau: baxitraxin

(1945), cloramphenicol (1947), polimixin (1947), clotetraxiclin (1948),

xephalosporin (1948), neomixin (1949), eritromixin (1952), grizeofulvin

(1959), gentamixin (1963), kasugamixin (1964), bleomixin (1965), validaxin

(1970), 4spergillus oryzae là một loại nắm được sử dụng rộng rãi trong các

nghành cơng nghiệp lên men truyền thống của Nhật Bản, tạo ra nước tương,

rượu sake, giắm sản xuất Nĩ được sử dụng lần đầu tiên về sản xuất thương mại

của enzyme lipase trong bột giặt năm 1988 [5]

1.2 Đặc điểm chung của nấm sợi

Nấm sợi là tất cả các nắm khơng phải nám men và cũng khơng sinh mũ nắm

như ở các nắm lớn Tuy nhiên ở tất cả các giai đoạn chưa sinh mũ nắm thì khuẩn

Trang 10

tỉ thể (hệ sợi nắm) của nắm lớn vẫn được coi là nâm sợi và được nghiên cứu về

các mặt sinh lí, sinh hố, di truyền, như các nắm sợi khác

Méc là chủng lồi nằm lớn và đa dạng về mặt phân loại, khi mà sự phát triển

của sợi nắm làm chúng mắt đi màu sắc và cĩ dạng xù xì, đặc biệt là trên thực phẩm Mạng lưới của những sợi nắm dạng ống này được gọi là thể sợi, được xem là một cơ thể duy nhất Sợi nắm thường là trong suốt, vì vậy mà thề sợi trơng giống như là những sợi chỉ mịn và xù xì bao phủ trên bề mặt Các vách ngăn (septa) cĩ thẻ phân chia những ngăn nhỏ liên kết với nhau dọc theo sợi nắm, mỗi ngăn cĩ chứa một hoặc nhiều nhân tế bào giống nhau về mặt di truyền

Kết cầu giống như bụi của nhiều loại mốc là do sự tạo thành vơ số các bào tử

vơ tính (conidia) bởi sự phân hĩa ở cuối sợi nắm Kiểu tạo thành và hình dạng

của những bào tử này thường được dùng đẻ phân loại mĩc Nhiều loại bào tử

này cĩ màu sắc, làm cho nắm trơng rõ ràng hơn khi quan sát vào giai đoạn này

trong vịng đời

Nắm sợi cịn được gọi là nắm mốc, tức là chỉ tắt cả các mốc mọc trên thực

phẩm, trên chiếu, trên quần áo, trên giày dép, trên sách vở, Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn co chat hữu cơ khi gặp khí hậu nĩng ẩm Trên nhiều vật liệu vơ cơ dính bụi bẳn (như các thấu kính ở ống nhịm, máy ảnh, kính hiền vi, ) nắm mốc vẫn cĩ thể phát triển, sinh axit và làm mờ các vật liệu này [5]

1.2.1 Hình thái và cầu trúc của sợi nắm

Các sợi nắm đều cĩ chiều ngang tương tự như đường kính nấm men Cấu trúc của sợi nắm cũng tương tự như cấu trúc của tế bào nắm men Bên ngồi cĩ thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân phân hố Màng nhân cĩ cấu tạo 2 lớp và trên màng cĩ nhiều lỗ nhỏ Trong nhân cĩ

hạch nhân Bên trong tế bào nắm cịn cĩ khơng bào, tỉ thể, mạng lưới nội chất,

bào nang, thể màng biên Thể màng biên là một kết cầu màng đặc biệt, nằm ở giữa thành tế bảo và màng tế bảo chất, bao bọc bởi một lớp màng đơn và cĩ hình dáng biến hố rất nhiều (hình ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hoặc

Trang 11

nhiều lớp ) Cơng dụng của thể màng biên cịn chưa được làm sáng tỏ, cĩ thể

là cĩ liên quan đến sự hình thành tế bào

Đỉnh sợi nắm bao gồm một chĩp nĩn, khơng tăng trưởng và cĩ tác dụng che

chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nắm Đây là phần mà chất nguyên sinh khơng cĩ nhân và ít chứa các cơ quan tử Phần này rất dễ tách rời với các phần cịn lại của ngọn sợi nắm vì dưới chop nĩn là một phần cĩ thành rat mỏng Dưới nữa là phần tạo ra thành tế bào Các sợi nhỏ trên thành tế bào xếp ngang (chéo gĩc với trục sợi nắm) Dưới nữa là phần tăng trưởng Thành của phần này cĩ cấu

trúc sợi dạng mạng lưới Ngọn sợi nắm tăng trưởng được là nhờ phần này Dưới

nữa là phần thành cứng hay cịn gọi là phần thành thục của sợi nấm Thành tế

sat

bào ở phần này ngồi các sợi ngang cịn được tăng cường bởi các sợi dọ:

đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nắm Giữa hai

phần nĩi trên là một miền yếu và dễ gẫy Ở phần tăng trưởng sợi nắm chứa đầy

chất nguyên sinh với nhiều nhân, nhiều cơ quan tử, nhiều enzyme, nhiều axit

nucleic Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và sự phân nhánh của sợi nắm Ở các lồi nắm khuẩn tỉ khơng cĩ vách ngăn bên trong khuẩn tỉ cĩ nhiều nhân Người ta gọi đĩ là các tế bào đa nhân Ở các lồi nắm cĩ vách ngăn thì

do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào cĩ thể chứa 1 nhân, 2 nhân,

nhiều nhân hoặc chẳng cĩ nhân nào Nắm cĩ sợi nắm khơng ngăn vách gặp ở

các lớp Chụridiomycetes, Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Zygomycetes,

Trichomycetes Nam thuộc tất cả các lớp khác trong ngành Nấm thất

(Eumycota) đều cĩ sợi nắm ngăn vách [5] 1.2.2 Sinh sản của nắm sợi

Lúc bào tử rơi vào một điều kiện mơi trường thích hợp nĩ sẽ nảy mầm mọc

ra theo cả ba chiều thành một hệ sợi nắm hay gọi là khuẩn tỉ thể Trên khuẩn tỉ

thể ta phân biệt được hai loại khuẩn tỉ Khuẩn tỉ cơ chất hay khuẩn tỉ dinh dưỡng và khuẩn tỉ khí sinh Khuẩn tỉ cơ chất cắm sâu vào mơi trường cịn khuẩn tỉ khí

sinh phát triển tự do trong khơng khí

Trang 12

Hệ sợi nắm cĩ thể tiến hố đề thích nghỉ với các điều kiện sống khác nhau

thành các dạng đặc biệt sau:

+ Rễ giả (rhizoid): Trơng gần giống như một chùm rễ phân nhánh, cĩ tác dung

giúp nấm bám chặt vào cơ chất và hấp thụ chất dinh dưỡng từ cơ chất Cĩ thể

thấy rõ rễ gia khi quan sat nam Rhizopus

+ Soi hut (haustoria): Gap ở các nắm kí sinh bắt buộc Chúng được mọc ra từ

khuẩn tỉ và phân nhánh rồi đâm sâu vào tế bào vật chủ, ở đĩ chúng cĩ thể biến thành hình cầu, hình ngĩn tay hay hình sợi Chúng sử dụng các sợi hút này để hút chất dinh dưỡng từ cơ thể của vật chủ

+ Soi dp (appresspria): Gặp ở các nắm kí sinh ở thực vật Phần sợi nắm tiếp xúc vật chủ sẽ phĩng to ra, tăng diện tiếp xúc với vật chủ Phần này thường cĩ hình

đĩa, cĩ nhiều nhân tế bào, áp chặt vào vật chủ Các mơ của vật chủ dưới sự tác

dụng của enzyme do nắm sinh ra sẽ bị phá huỷ từng phan hay hồn tồn Qua

mơ bị phá huỷ này các sợi nắm sẽ lắn sâu vào bên trong vật chủ và tiếp tục sinh

enzyme để tiêu hố cơ thể vật chủ Khác với sợi hút, sợi áp khơng phát triển

thành các nhánh đâm sâu vào tế bào cịn sống của vật chủ

+ Sợi bị hay thân bị (stolon): Đĩ là đoạn sợi nấm khí sinh khơng phân nhánh

phát sinh từ các sợi nắm cơ chất, cĩ hình thăng hoặc hình cung Đầu mút của

các sợi bị chạm vào cơ chất phát triển thành các rễ giả để bám chắc vào cơ

chất sợi bị cứ lan dần ra mọi phía kể cả trên thành thuỷ tỉnh của ống nghiệm,

của nắp đậy Petri Sợi bị và rễ giả thường gặp ở bộ Mucorales

+ Vong nam hay mạng nắm: Đĩ là những biến đổi ở các lồi nám cĩ khả nắng, bẫy các động vật nhỏ trong đất (như amip, tuyến trùng, ) Vịng nắm cĩ thể cĩ

dang bong dinh mọc ra từ những cuống ngắn xếp thẳng gĩc với sợi nắm chính

Trang 13

Từ khuẩn tỉ khí sinh cĩ thể mọc ra những sợi sinh sản vơ tính hoặc hữu tính

+ Đầu bào tử trần (conidinal head): Các cơ quan sinh sản vơ tính cĩ thể cĩ cầu

tạo chứa các bào tử vơ tính Ở nắm thuộc các chỉ Penicillium va Aspergillus c6 các đầu bào tử trần với nhiều sợi nắm phân hố khác nhau Chăng hạn ở chỉ Penicillium bat dau tir doan sgi chua phân nhánh gọi là cuống nắm rồi đến các

sợi phân nhánh bậc một gọi là cành tiếp đĩ là sợi phân nhánh bậc hai gọi là

cành nhánh Phần sinh ra các bào tử trần gọi là thể bình Thẻ bình cĩ thể cĩ một

lớp hoạ

bọng cịn gọi là bao nang Cac bao tir trin 6 Aspergillus cé thé toa trịn ra thành hai lớp 6 Aspergillus thường chỉ cĩ các cành nhánh mọc ra từ một

hình phĩng xạ, cũng cĩ thể hướng cả về một phía tạo thành hình trụ

+ Nang bào tử kín (sporangia) : Là dạng biến đổi ở bộ A#wcoraies, mọc lên từ

cuống nang Mỗi nang bào tử kín Các bào tử kín được sinh ra bên trong các nang này

+ Đảm (basidia) : Là cơ quan sinh sản hữu tính do tế bào song nhân ở đỉnh sợi phình to ra mà tạo thành Trong đảm hai nhân sẽ phối hợp với nhau để hình thành một nhân lưỡng bội Sau đĩ do phân cắt giảm nhiễm mà sinh ra 4 nhân

đơn bội Khi đĩ trên đảm sẽ mọc ra 4 cuống nhỏ đầu phình to ra Các nhân đơn bội sẽ đi vào 4 cuống nhỏ này và về sau phát triển thành 4 bào tử đảm

+ Túi giá (piemidium): Lả dạng hình thái cĩ hình cầu hay hình chai mà vỏ cấu

các đệm gồm nhiều cuống dính với nhau một phần hoặc tắt cả

Trang 14

+ Bĩ giá (coremium; synnema): Là nhiều cuống bào tử trần dài, xếp song song với nhau ở phần gốc hoặc suốt dọc cuống, mang các bào tử trần ở phần ngọn

hoặc suốt dọc thân

+ Hạch nắm (sclepotium) : Là khối sợi nắm rắn chắc thường cĩ tiết diện trịn,

khơng mang các cơ quan sinh sản Hạch nắm chỉ cĩ ở các nắm cĩ sợi nắm ngăn

vách Đĩ là một dạng sống nghỉ của nắm đề bảo vệ nấm trải qua được các điều kiện bắt lợi của mơi trường sống,

+ Thể đệm (stroma): Cịn gọi là đệm nắm, là một khối sợi nắm cĩ thành tế bào

dính liền nhau theo nhiều hướng Trên hoặc trong thẻ đệm cĩ mang các cơ quan

sinh sản

+ Quả túi (fruit— bodes): Là loại thể đệm gặp ở Nắm túi Cĩ dạng quả túi hình cầu (eleistotheeium) cĩ loại quả túi hình chai (perithecium), cĩ loại quả túi hình

đĩa (apothecium), loại quả túi hình cầu gặp ở lớp Plectomycetes, loại quả túi

hình chai gặp ở lớp Pyrenomycetes, loại túi hình đĩa gặp ở lớp Discomycetes [5]

1.3 Lên men sinh khối nắm sợi -_ Sản phẩm lên men truyền thống

Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất của sự chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn Sự xuất hiện, qui trình chế biến, và sử dụng của thực phẩm lên men đã được viết nhiều [9] Một vài sản phẩm

lên men (phĩ-mat, bia, rượu, nước tương) đã cĩ kinh nghiệm sản xuất một

lượng lớn, với việc sử dụng giống chủng ưu việt, mặt khác nhiều thực phẩm lên

men vẫn cịn được sản xuất sử dụng kỹ thuật truyền thống lâu đời dưới những

điều kiện đơn giản hoặc ngay cả nguyên sơ

Pho-mát Camembert: Camembert là loại pho mát mềm của Pháp Nĩ

Trang 15

Camembcrt là 1 loại pho mát làm từ sữa bị tươi để lên men Thời gian để

thường là 3 tuần hoặc 4 tuần Pho mát Camembert được làm từ sữa bị chưa

được diệt khuẩn theo phương pháp Pasteur, và được làm chín bằng các loại mốc Penicillium candida va Penicillium camemberti trong it nhat 3 tuan

Pho mát Camembert thường được ủ theo từng bánh trịn nặng khoảng 250 gram,

bọc trong giấy và đĩng trong hộp gỗ Pho mát Camembert cĩ thể được dùng

trong nhiều mĩn ăn, nhưng nĩ thường được ăn (khơng qua nấu) với bánh mì hoặc thịt, hoặc làm đồ nhắm rượu vang, đẻ cĩ thê thưởng thức được hương vị tỉnh tế sẽ bị mất nêu qua đun nấu Lớp da bên ngồi của camembert phải cĩ màu bạc hoặc hơi vàng nâu, bề mặt phải trơn bĩng, cĩ những vết rạn nâu nhỏ,

ngửi mùi phải nhẹ, thơm vị phơ mai

Chao (sufu): Chao (sufu) cũng được viết như fu-ru, là do hoa sữa đậu

nành lên men mốc cĩ mùi khá nặng (Su, 1986) Chao được sản xuất chủ yếu ở

“Trung Quốc cho tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, sản lượng hàng năm ước tính ít

nhất 300 triệu tấn Chao được tiêu thụ như một chất gia vị, ví dụ với cơm điểm tâm sáng hoặc bánh mì hấp Chao được làm từ khối đậu hũ (thu được từ kết tũa

sữa đậu nành) Đậu hũ được dùng làm chao cứng hơn bởi ép hoặc được sử lý

hơi nĩng nhanh, và tuần tự được chủng giống trên bề mặt và ủ ở âm độ cao tại

nhiệt độ 20-35°C, tuỳ thuộc vào địa điểm và mùa (trong năm) Các loại nắm

mốc tham gia chủ yếu là Acrinomueor và Mucor spp Những nhà máy sản xuất

lớn cĩ sử dụng giống thuần chủng, chẳng hạn như Actinomucor elegans, ngược

lại tại các cơ sở sản xuất nhỏ, sử dụng rơm lên mốc để chủng lên khối đậu hũ với một hệ vi sinh vật hỗn hợp của nắm mốc và vi khuẩn Actinomucor elegans khơng phát triển tốt ở nhiệt độ vượt quá 25°C, các méc khac vi dy nhu Mucor

°hiemalis hoặc Rhizopus chinensis được sử dụng ở nhiệt độ cao hơn

Tempeh: Tempeh cĩ nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ

biến ở Hà Lan và nĩ đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và

Uc Tempeh là một bánh cĩ thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên

Trang 16

men bề mặt với nắm của những hạt đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác

sau khi đã ngâm rồi nấu Cơ chất được dùng nhiều và phơ biến nhất là đậu nành

(Nout and Rombouts, 1990; Wood, 1998) Tempeh cung cấp một nguồn đạm

thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hố và an tồn Nĩ thường được ăn chỉ

khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu Nắm mốc duge ding 1a Rhizopus oligosporus va R oryzae, ching nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lắn át các dịng tạm nhiễm

khác như Aspergillus spp [11]

Rugu sake: Méc Koji la mot nhém cia ching loai Aspergillus, dang chi

ý là Aspergillus oryzae, và sau đĩ là A sojae, đã được nuơi cấy ở vùng Đơng, Á trong hàng thế kỷ Chúng được sử dụng để làm lên men hỗn hợp đậu nành

và bột mì dé làm miso và xì dầu Mốc Kò/¡ phân rã tỉnh bột trong gạo, dai mach, khoai lang quy trình đĩ được gọi là thủy phân, ứng dụng trong sản xuất rượu

sake, Shõchũ và những loại rượi chưng cắt khác A⁄ốc Koji cũng được sử dụng để chế biến cá bảo [8]

Gạo đỏ lên men là một sản phẩm của mốc ÄMonaseus Pwrpureus khi nĩ phát triển trên gạo, và khá phỏ biến trong những khâu phần ăn ở châu Á Men cĩ chứa vài hợp chất được biết là monacolin, được cho là cĩ thể ngăn cản sự tổng hợp cholesterol Một nghiên cứu cho thấy rằng gạo đỏ lên men khi được sử dụng làm thực phẩm chức năng, kết hợp với dầu cá và thay đổi cách sống lành mạnh, cĩ thể giúp giảm lượng cholesterol hiệu quả như một vài loại thuốc

statin nhất định Một số loại xúc xích, chẳng hạn như salami, kết hợp với việc

cấy nắm mốc đề làm tăng hương vị và giảm sự hình thành vi khuẩn trong suốt

quá trình lên men Ví dụ như Penicillium nalgiovense cĩ thê xuất hiện dưới dạng,

một lớp phủ màu trắng dạng bột trên một số xúc xích lên men phơi khơ

Những loại mốc khác mà được sử dụng trong chế biến thức ăn bao gồm:

Fusarium venenatum — quorn; Geotrichum candidum — Pho mat; Penicillium

spp — Nhiều loại pho mát đa dạng như pho mat Brie và pho mát xanh;

Trang 17

Rhizomucor' miehei ~ Enzym rennet đề làm các loại pho mat chay và những loại pho mat khác

-_ Sản phẩm lên men hiện đại

Mycoprotein: Vào giữa thế kỷ 20, trong tình hình thế giới sớm bị cạn

kiệt protein, là một nhà sản xuất ngũ cốc lớn, tập đồn thực phẩm của Anh

Rank Hovis McDougall (RHM) da tim ra loai nam Fusarium venenatum dé ché

biến tỉnh bột dư phụ phẩm thành loại protein nỗi tiếng với tên gọi mycoprotein

Nĩ đã làm cho thương hiệu Quorn cĩ trị giá hàng trăm triệu đơ la Họ tìm kiếm

nắm vì nĩ cĩ ưu điểm là phát triển rất hiệu quả trong những điều kiện đơn giản Hầu hết chúng phát triển và nhân đơi số lượng chỉ trong nửa giờ Bên trong tế bào của chúng biến thành các chất dinh dưỡng mà chúng đã hấp thụ thành protein thực phẩm hơn bắt kỳ con gà hay bị nào

Mycoprotein được sản xuất trong các thiết bị lên men lớn với hỗn hợp

đường, nước và một số khống chất ở một nhiệt độ nhất định Khơng khí sục

qua chất lỏng, trộn đều dinh dưỡng và cung cấp oxy bão hồ Trong bể sục dinh dưỡng này, một lượng nhỏ canh trường nấm bắt đầu được cấp giống theo cách vơ trùng để đảm bảo rằng khơng cĩ gì khác ngồi chủng nắm đã lựa chọn phát triển bên trong bẻ Các tế bào nắm được bao quanh bởi những điều kiện lý tưởng nhất mà chúng cĩ thê phát triển và phân chia một cách nhanh chĩng, hình thành những đám sợi dày, mềm mịn Nếu khơng bồ sung thêm chất dinh dưỡng, sợi nấm sẽ phát triển và tồn bộ quá trình hồn thành trong vịng chưa đầy 24h Sợi nắm được thu hoạch bằng cách tách nĩ ra khỏi chất lỏng Các sợi nhỏ dan xem của sợi nắm khiến cho mycoprotein giống thịt một cách đáng ngạc nhiên Nĩ cĩ hàm lượng protein và chất xơ cao, rất ít chất béo và đường và

khơng cĩ mùi Quorn thực hiện một quy trình lên men liên tục, trong đĩ các sợi

nắm đã phát triển được lấy ra khỏi bé va dinh dưỡng luơn được thêm vào để

giữ một lượng chất dinh dưỡng ồn định và khơng gian cho các sợi nắm mới

phát triển[7] Bằng cách này một quá trình duy nhất cĩ thể chạy tối đa trong 6

Trang 18

tuần và tạo hàng trăm cân mycoprotein mỗi giờ, hơn cả thời gian bị phát triển từ lúc thụ thai đến khi xuất chuồng Điều đĩ cĩ thể thấy rõ tại sao sản xuất mycoprotein lại là một các cực kỳ hiệu quả để sản xuất protein

-_ Các nghiên cứu gân đây

Những nghiên cứu ứng dụng nắm mốc trong các lĩnh vực gần đây cĩ thé

kế đến như: Lên men axit gluconic hiệu giá cao bằng cách sử dụng axit lỗng,

khơ đã được xử lý trước thủy phân mà khơng cần giải độc Chủng lên men

la Aspergillus niger SIM M276 Nghiên cứu này cung cap sản xuất axit gluconic hiệu giá cao đầu tiên từ nguyên liệu lignocellulosic cĩ tiềm năng ứng, dụng cơng nghiệp Sản xuất axit citric bằng cách lên men Aspergillus niger d& được cải tiến về mặt di truyền Sản lượng cơng nghiệp của axit xitric lớn hơn sản lượng của hầu hết các chất chuyển hĩa chính khác cĩ nguồn gốc từ quá

trình lên men, và vượt quá 400000 tắn trên tồn thể giới (Bigelis va Tsai,

1995) Tại Hoa Kỳ, nĩ chủ yếu cĩ lương thực (62% tổng số sản lượng trong,

nước), chất tây rửa (24%), dược phẩm (8%) và các ứng dụng cơng nghiệp khác

(6%) Hầu hết các quá trình lên men với 4 øiger đều là được hình thành trong các máy lên men khí lớn, được điều khiển bằng máy tính thiết kế cĩ cánh khuấy

hoặc sục khí (airlift fermenter), mặc dù khoảng 20% thế giới sản lượng vẫn thu

được bằng cách lên men bể mặt Nhiệt độ của quá trình lên men mơi trường là

28-33°C, và pH là 1,5~2 Một quá trình lên men điền hình kéo dài 5-8 ngày và

tạo ra một số sản phẩm phụ, chẳng hạn như oxalic axit hoặc axit gluconic [10]

Sinh khối ác

ám mốc 4spergillus niger T2 được ủ với tiêu nguyên liệu cĩ dụng đáng kế đến khả năng bĩc vỏ trong sản xuất tiêu sọ Hiệu suất bĩc vỏ tiêu của chủng nam Aspergillus niger T2 cao nhat dat 99,977% sau 4 ngay xt ly voi

ham lugng chung bé sung 1a 4%"), Chitosan va glucozamin được tổng hợp,

tách chiết và thu nhận từ sinh khối sợi ndm Rhizopusp.BG giau chitin, chitosan

& quy m6 phong thi nghiém[2] Ching Aspergillus protuberus thể hiện hoạt

tính chitinase Dịch enzyme được tách chiết từ sinh khối nắm mốc bằng nước

Trang 19

cất cĩ hoạt tính chitinase cao nhất ở nhiệt độ 55°C và pH 5,03] Sinh khối nắm Noumuraea rileyi được sản xuất đề khắc phụ hạn chế thuốc hố học gây ra cho

rau và đậu tương [4] Ngồi ra nắm sợi cịn được nghiên cứu phát triển trong

nhiều lĩnh vực khác như cơng nghiệp enzyme (sản xuất penixilin, xephalosporin, ecgoalcaloit, các streroit, ) sản xuất thuốc trừ sâu sinh học,

kích thích tố sinh trưởng thực vật (gibberellin )

Rhizomucor miehei thuộc chỉ Rhizomucor trong ho Mucoraceae Trong điều

kiện thí nghiệm, lồi này phát triển đặc biệt tốt ở nhiệt độ từ 24 đến 55°C, và phát triển khơng tốt trong điều kiện dưới 21°C hoặc trên 57°C Nĩ cĩ nhiều ứng dụng trong mỹ phẩm hay ứng dụng dùng dé tao enzym làm pho mát trong thực phẩm [9] Rhizopus microsporus thuge chi Rhizopus trong ho

Mucoraceae Loai nam này được tìm thấy nhiều nhất trong đất, mảnh vụn thực

vật và thực phẩm Ẩ mierospor„s thường được tìm thấy trong đất cĩ độ pH trung tính Những tầng đất này thường cĩ độ mặn thấp hơn để tạo điều kiện phát triển tối ưu Phạm vi phát triển của 8 mierosporus từ 25°C đến 55°C với nhiệt độ tối ưu là 28°C Một biến thể thuần hố của lồi này được sử dụng dé chuẩn bị lên men dau nanh truyén théng nhu tempeh va sufu (Rhizopus

oligosporus) [12]

1.4 Các kỹ thuật lên men chìm

Lên men chìm cĩ sục khí và khuấy trộn là phương pháp được phơ biến rộng nhất trong quy trình lên men cơng nghiệp, vì cĩ thể kiểm sốt được tồn bộ các

khâu trong quá trình một cách dé dang So với phương pháp lên men bề mặt,

thì lên men chìm cĩ nhiều ưu điểm đĩ là: ít chốn bề mặt (khơng mắt nhiều

diện tích), dễ cơ giới hĩa và tự động hĩa trong quá trình theo dõi Tuy nhiên

phương pháp lên men chìm địi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị

Ngồi ra, nếu một mẻ lên men, vì một lý do nào đĩ bị xử lý thì khơng thể xử lý

cục bộ được, đa phần phải hủy bỏ cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn Phế

Trang 20

liệu của quá trình lên men thải ra phải kèm theo cơng nghệ xử lý chống ơ nhiễm mơi trường

Lên men chìm dùng mơi trường dịch thể Chủng vi sinh vật cấy vào mơi

trường được phân tán khắp mọi điểm và xung quanh bề mặt tế bào được tiếp

xúc với dịch dinh dưỡng Đặc điểm này địi hỏi trong suốt quá trình nuơi cấy

phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục

Phương pháp lên men chìm cĩ một số ưu điểm: Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyên, chỉ phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp, dễ tổ chức được xí nghiệp cĩ sản lượng lớn, các

thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hố, tự động hố Phương pháp chìm cũng cĩ

một số nhược điểm sau: Địi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng tồn

bộ Vì vậy, những thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẫn thận, chịu

áp lực cao, địi hỏi kín và làm việc với điều kiện vơ trùng tuyệt đối (trong nuơi

cấy bề mặt cĩ thể loại bỏ phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn cịn dùng

được)

Ngày nay, phương pháp lên men chìm được dùng phỏ biến trong cơng nghệ

vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm

phân bĩn, thuốc trừ sâu, các enzyme, các axit amin, vitamin, các chất khang sinh, các chất kích thích sinh học

Việc trộn trong quá trình lên men là cần thiết để ngăn ngừa sự phân tang

nhiệt độ, duy trì độ đồng nhất của pH, tăng sự tiếp xúc mật thiết giữa thức ăn

va vi sinh vật nuơi, đồng thời ngăn ngừa sự đĩng cặn và tạo bọt [14] Lên men

chìm cĩ sục khí mang lại lợi thế lớn là khơng cĩ bộ phận chuyền động, hiệu quả hấp thụ khí cao, đặc tính truyền nhiệt tốt và trộn nhanh [13] Đối với hoạt động sản xuất ở quy mơ lớn thì hệ thơng lên men khuấy trộn được sử dụng rộng,

rãi nhất đề thiết kế cho quá trình lên men cơng nghiệp Cường độ pha trộn cĩ

thể

ác nhau bằng các chọn loại cánh khuấy thích hợp và các tốc độ khuấy

khác Lên men khuấy trộn cũng cĩ thể được dùng cho các mơi trường cĩ độ

Trang 21

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học

nhớt cao Nĩ là một trong những hệ lên men quy mơ lớn đầu tiên được phát

triển trong cơng nghiệp dược

Trang 22

PHAN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Năm chủng nấm mốc được khảo sát lên men bình tam giác từ đĩ lựa chọn

01 chủng phù hợp lên men trên thiết bị lên men 2L Các chủng nắm lựa chọn là những chủng vi nấm cĩ khả năng lên men trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp từ bộ sưu tập giống của Viện Cơng nghiệp Thực phẩm

Mơi trường lên men: dịch hèm được thu nhận sau khi cất cồn Dịch hèm

được chuyển từ phân xưởng và bảo quản lạnh -20°C tại Trung tâm Vỉ sinh vật Cơng nghiệp

Tên chủng Mã chủng Rhizomucor miehei FCH 116.3 Rhizopus microsporus LPH 084 Rhizopus microsporus LPH 156 Myceliophthora thermophile CH 112.2

- Héa chit: Dinitrosalicylic acid (DNS), NaCl, D-glucose,

- Thiết bị: Tủ cấy, tủ nuơi lỏng 45°C, tủ nudi tinh 45°C, ndi hap, ta lanh, ta đơng, máy tron Vortex, máy đơng khơ, máy ly tâm, kính hiển vi, bể ồn nhiệt, buồng đếm hồng cầu

- Dung cu: Phéu thuy tinh, vai lọc, bình tam giác, cốc thuỷ tinh, bình định

Trang 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các chủng vi nắm được khảo sát khả năng lên men trên mơi trường dịch

hém lỏng và được đánh giá khả năng lên men dựa trên sinh khối tế bào sau khi

lên men

Các chủng được lựa chọn tiếp tục được tiến hành khảo sát lên men trên bình tam giác để đánh giá động học quá trình trên các thơng số như pH, Bx, nồng độ đường khử đề theo các thơng số trong quá trình lên men và khả năng chuyển hĩa cơ chất

Chủng được lựa chọn nghiên cứu quá trình lên men sẽ được tiến hành

lên men trên thiết bị lên men 2I trên hai mơ hình: lên men khuấy trộn và lên

men sục khí để theo dõi hình thái hệ sợi cũng như thơng số quá trình: Nồng độ

chất tan (Bx), Nồng độ đường khử, nồng độ oxy hịa tan (DO),

2.4.1 Quan sát hình thái hệ sợi sử dụng kính hiển vi

Quan sát bảo tử của nắm sợi sau khi nuơi bằng kính hiển vi Nắm sợi sau

khi lên men sẽ được lấy mẫu để quan sát bào tử theo dõi từng thời gian

Trang 24

Chuẩn bị phiến kính và lamen: phiến kính và lamen được rửa và lau sạch bằng cồn 709

Lấy giống: sử dụng que cấy, tăm, lấy 1 lượng bằng đầu tăm, di giống vừa

lấy lên phiến kính đã nhỏ sẵn 1 giọt nước, dàn trịn đều đường kính 1cm, tránh

bọt khí Nhẹ nhàng đặt lamen lên trên theo chiều nghiêng xuống, tránh tạo bọt

khí tối đa

Chọn vật kính muốn quan sát và điều chỉnh kính cho phù hợp Nếu hình ảnh

mờ cĩ thể dùng nút chỉnh tỉnh Quan sát hình thái bào tử, hệ sợi và sự sinh sản

theo thời gian của nắm sợi

Sau khi quan sát xong thì tắt đèn kính hiển vi, rửa phiến kính và lamen bằng

cơn và ngâm dung dịch vim pha lỗng

2.4.2 Phương pháp xác định khối lượng sinh khối

Sinh khĩi khơ được xác định bằng phương pháp sấy đến khĩi lượng khơng đổi Sinh khối tế bào sau khi nuơi cấy trên mơi trường được lọc qua giấy lọc đã được sấy khơ và xác định khối lượng Sau khi lọc, mẫu được sấy 55°C trong

24h sau đĩ được xác định hàm ẩm và khối lượng khơ

2.4.3 Phương pháp phân tích đường khử tổng bằng DNS

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường

khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Thuốc thử DNS sau phản ứng sẽ

tạo thành phức chất với 3-amino, 5-dinitrosalicylic acid, chuyển từ màu vàng

chuyên sang nâu Dụng cụ:

Bình định mức; cốc đong; ống đong thủy tỉnh; eppendorf; vi đĩa 96 giếng,

pippet; block nhiệt và máy do OD

Xây dựng đường chuẩn

-Đường D-glucose được sấy 105%€ C trong Ih Cân chính xác 5g D-

Trang 25

định mức đến đúng 50ml thu được dung dịch stock 100 mg/ml (bảo quản

D-glucose(mg/ml) [2 15 [l(ỗng!) |05 [0.2 D-Gmg/ml (ul) |200 |150 |100 50 200 uL của ơng 1 Nước cất (uL) 800 |850 |900 950 |800

-Tiễn hành xây dựng đường chuân

1 200 wL, D-glucose theo các nồng độ trên duge cho Eppendorf

1.5ml

2 Bé sung them 400 pL DNS, mix déu Phan tng mau 6 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

3 Lay 40 uL dịch phản ứng + 180 pL nude cat, mix déu trong vi dia

4 Do OD 540nm Dựng được đường chuẩn y=ax + b

Mẫu blank: nước cất thay cho đường D-glucose Làm tương tự mẫu thí nghiệm từ bước 2-4

Phương trình đường chuẩn: y = 0.7941x - 0.0447, R2 = 0.9982 Quy trình

1.5ml

2 Bổ sung thêm 200 wL DNS, mix đều Phản ứng màu 6 100°C

trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

Trang 26

X: số mg/ml đường khử

Y: giá trị đo OD 540nm B: giá trị của đường chuẩn

2.4.4 Phương pháp xác định pH

pH của mơi trường hoặc các mẫu thí nghiệm được phân tích bằng điện cực đo pH sử dụng thiết bị đo pH đề bàn pH trong quá trình lên men được theo dõi

bằng điện cực trên thiết bị lên men

Thử máy pH: Lấy điện cực cắm vào nước máy dé kiểm tra Nước máy

thường pH khoảng 7

Do pH: Điện cực sau khi được kiểm tra sẽ được lau nhẹ bằng giấy sau đĩ tiếp tục đo mẫu Sau khi cĩ kết quả thì điện cực sẽ rửa qua bằng nước Deion và cắm vào ống

2.4.5 Xác định nồng độ chất tan Brix

Nơng độ chất tan Brix của mẫu dịch lên men được phân tích bằng thiết bị

phân tích nồng độ Bx điện tử

Thử máy trước khi đo mẫu: nhỏ một giọt nước RO vào máy và kiểm tra

Nếu kết quả là 0,00% thì máy khơng bị sai số trong quá trình đo mẫu

Đo mẫu: Hút 40ul dịch mẫu vào máy và đo

Làm sạch: Sau khi cĩ kết quả thì lau sạch chỗ đo bằng giấy và nhỏ một giọt

nước RO và lau lại Sau đĩ tiếp tục đem đi đo mẫu mới 2.4.6 Nồng độ protein

Nguyên

hương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác

định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolframate (thuốc thử

Folin-Ciocalteu) với phức đồng-protein

Chuẩn bị hĩa chất:

Trang 27

Y: giá trị đo OD 540nm B: giá trị của đường chuẩn

2.4.4 Phương pháp xác định pH

pH của mơi trường hoặc các mẫu thí nghiệm được phân tích bằng điện cực đo pH sử dụng thiết bị đo pH đề bàn pH trong quá trình lên men được theo dõi

bằng điện cực trên thiết bị lên men

Thử máy pH: Lấy điện cực cắm vào nước máy dé kiểm tra Nước máy

thường pH khoảng 7

Do pH: Điện cực sau khi được kiểm tra sẽ được lau nhẹ bằng giấy sau đĩ tiếp tục đo mẫu Sau khi cĩ kết quả thì điện cực sẽ rửa qua bằng nước Deion và cắm vào ống

2.4.5 Xác định nồng độ chất tan Brix

Nơng độ chất tan Brix của mẫu dịch lên men được phân tích bằng thiết bị

phân tích nồng độ Bx điện tử

Thử máy trước khi đo mẫu: nhỏ một giọt nước RO vào máy và kiểm tra

Nếu kết quả là 0,00% thì máy khơng bị sai số trong quá trình đo mẫu

Đo mẫu: Hút 40ul dịch mẫu vào máy và đo

Làm sạch: Sau khi cĩ kết quả thì lau sạch chỗ đo bằng giấy và nhỏ một giọt

nước RO và lau lại Sau đĩ tiếp tục đem đi đo mẫu mới 2.4.6 Nồng độ protein

Nguyên

hương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác

định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolframate (thuốc thử

Folin-Ciocalteu) với phức đồng-protein

Chuẩn bị hĩa chất:

Trang 28

Dung dịch A: cân 10g NaCO; pha trong 500ml NaOH 0.1N

Dung dịch B: cân 0.5g CuSO¿.5H;O pha trong 100ml Postassium tartrate

1%

Dung dịch C: trộn A với B theo tỉ lệ 50:1

Thuốc thử Folin-ciocalteu: pha lỗng với nước cắt theo tỉ lệ 1:1 Bảng 2 3 Bảng xây dựng đường chuẩn protein

BSA (ug/ml) 0 | 50 | 100 | 200 | 300 | 500 Stock BSA 10mg/ml (11) o | 5 | 10 | 20 | 30 | 50

Nuc cat (11) 1000 | 995 | 990 | 980 | 970 | 950

- Pha stock BSA với nước cất để được các nồng độ BSA như bảng trên

- Cho 0.4 ml BSA + 2 ml thuốc thử C

- Trộn đều và giữ nguyên dung dịch trong 10 phút

~ Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin- ciocalteu

~ Trộn đều và giữ nguyên trong 30 phút

- Do d6 hap phụ quang ở bước sĩng 2.=660nm

Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ BSA và giá trị OD

660nm được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel

Trang 29

Hut 0.4 ml mẫu vào ống nghiệm cho tiếp 2 ml dung dịch C, lắc đều,

giữ nguyên trong 10 phút

“Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều, giữ nguyên trong 30

phút

~_Ðo độ hấp phụ quang ở bước sĩng À =660 nm

Mau Blank: thay 0.4 ml mẫu ở bước 1 bằng 0.4 ml nước cất, rồi làm

tương tự như các bước trên

Cơng thức tính: Protein (mg/ml) = [(OD - b)*D]/a

Trong đĩ: D: độ pha lỗng của mẫu

a,b: hệ số của đường chuẩn y= a.x + b

2.4.7 Phương pháp lên men

Lên men trên bình tam giác:

Lên men bình tam giác 100ml

Nam chủng được đem đi cấy vào đĩa PDA và nuơi tinh ở tủ 50°C trong 4

ngày để làm đĩa giống

Binh tam giác 100 ml đã bịt đầu bằng nắp cao su và giấy bạc đem đi hấp

thanh trùng ở 121°C trong 15 phút

Cân vào bình 50g dịch hèm sắn Đem hắp cách thủy 118°C trong 20 phút

tính từ lúc nước đã sơi

Cấy khoanh trịn Iem hệ sợi lấy từ các đĩa giống chuẩn bị sẵn vào bình

mơi trường, Cây 5 bình tam giác, mỗi bình 1 chủng nắm Đem nuơi lắc ở tủ

45°C trong 4 ngày

Thu mẫu: Mỗi ngày lấy 500 l dịch nuơi đề phân tích Bx, pH, DNS theo

Trang 30

- Chuan bj dich bao tir cap gidng:

Năm chủng được đem đi cấy vào đĩa PDA va muơi tĩnh ở tủ 50°C trong 4 ngày Thu 4ml Tween 80 0,1% trên đĩa patri, dung que chang cảo bảo tử trên đĩa thạch

Lọc qua vải màn đặt trên phễu đã thanh trùng, thu vào ống falcon 50ml

Đếm mật độ bào tử dịch cấp giống và tính tốn nồng độ cấp giống Bảng 2 4 Thể tích cấp giống của 5 chủng + Thể tích cấp

Tên chủng Mật độ gốc (BT/ml) oe

Rhizomucor miehei FCH 116.3 4.4 x 108 23ul Rhizopus microsporus LPH 084 4.6 x 10° 22ul Rhizopus microsporus LPH 156 3.1.x 108 32ul Myceliophthora thermophile ee 4.65 x 10 22ul FCH 112.2 Rasamsonia emersonii LPAT 5.98 x 108 1ul

tính từ lúc nước đã sơi

Cấy 5 bình tam giác, mỗi bình 1 chủng nắm theo thể tích đã tính tốn được

tùy mỗi chủng Đem nuơi lắc ở tủ 45°C trong 4 ngày

Trang 31

Thu mẫu: Mỗi ngày lấy 10ml dịch nuơi đề phân tích Bx, pH, DNS theo thời gian Sau 4 ngày thu lấy sinh khối bằng bộ lọc và xác định lượng sinh khối

khơ

Lên men trên thiết bị lên men:

Chủng được nuơi hoạt hĩa trên bình tam giác trước khi cấp vào mơi trường

lên men (500 — 1000 ml) trong thiết bị lên men Quá trình lên men được tiền

hành ở 45°C khuấy trộn 100-200rpm (đối với thí nghiệm khuấy trộn sục khí),

sục khí, trong thời gian 4-7 ngày Mẫu được thu 10ml tại các thời điểm nghiên

cứu (0-4/7 ngày) và bảo quản lạnh -20°C cho tới khi phân tích

“Thiết bị lên men sục khí khuấy trộn: Jupiter Solaris 2L (Solaris Biotechnology,

Italy) Thiết bị lên men hai vỏ gia nhiệt và làm lạnh bằng dung mơi nước, thể

tích lên men: 2l (0+1.6 bar), hệ cánh khuấy hai tầng dạng turbine cánh thang

Các điện

điều khiển LEONARDO Các thơng số điều khiển tự động bao gồi

khuấy trộn (0+2000rpm), pH, nhiệt độ, dO (oxy hịa tan), dCO2 Cho phép theo

: sục khí,

doi va điều khiển thiết bị online từ xa Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động: Hệ

thống bao gồm ba phần chính:() Cabinet điều khiển và máy tính hiển thị; (ii) thiết bị lên men và (iii) Thiết bị phụ trợ; máy nén khí và máy làm lạnh Nguyên tắc hoạt động: cabinet nhận tín hiệu vào từ các cảm biến trên thiết bị lên men sau đĩ xử lý tín hiệu và truyền tải lệnh Tất cả các tín hiệu và thơng số được điều khiển qua máy tính kết nối với hộp điều khiển

Hệ thống lên men sục khí tự thiết kế tại phịng thí nghiệm: sử dụng hệ thống thiết bị lên men và hệ thống điều khiển của hệ thống lên men sục khí khuấy trộn Trong đĩ, mặt nắp thiết bị lên men đã được phịng thí nghiệm thiết kế lại và thay bằng hệ thống trụ rỗng lõi bên trong Hệ thống lên men sục khí sử dụng

cấp khí để tạo dịng chảy trong mơi trường lên men

Trang 33

PHAN 3: KET QUA

3.1 So sánh sinh khối tế bào của 5 chủng nắm sợi trong mơi trường hèm sắn

lỏng

Năm chủng nắm sợi được lên men bình tam giác 100ml và bình tam giác

250ml trong dịch hèm sắn lỏng dé so sánh sinh khối tế bào Bình tam giác 100ml được lấy mẫu từ ngày 1 đến ngày 4 với thê tích mẫu là 5001 Dưới đây

là hình ảnh chụp các bình lên men ở các mĩc thời gian khác nhau:

Trang 34

Kết quả quan sát hình thái các chủng trên mơi trường hèm sẵn lỏng cho thấy: Các chủng đều mọc tốt trong điều kiện nuơi cấy và phát triển nhanh nhất

trong ngày thứ 2 và thứ 3 Chủng FCH 112.2 cĩ hiện tương đổi màu sau ngày

thứ nhất Chủng LPHT 234 tạo hạt sau 2 ngày nuơi Hiện tượng này cĩ lặp lại

khi tiếp tục lên men trên bình tam giác 250ml

Các bình lên men được lấy mẫu theo ngày và đem xác định nồng độ đường khử, nồng độ chất tan và pH mỗi ngày Sau 4 ngày lên men, sinh khối

sẽ được tách bằng vải lọc sau đĩ xác định sinh khối khơ

Trang 36

23

š

——

Hình 3 1 Lén men binh tam gidc 100mL

A Nơng độ đường khử theo thời gian, B pH theo thời gian, C Nồng độ chất tan Brix theo thời gian, D Sinh khối khơ

Từ đồ thị cho thấy nồng độ đường khử giảm theo thời gian Chủng LPHT

234 tăng đột ngột vào ngày thứ 2, FCH 116.3 tăng vào ngày thứ 3 Các chủng

cịn lại giảm dần theo thời gian Nồng độ đường khử cao nhất là 5.07 của FCH 112.2 ở ngày thứ nhất, nồng độ thấp nhất là 2.33 của LPH 156 ở ngày thứ 4

Đồ thị pH cho thấy xu hướng tăng lên của các chủng FCH 112.2 tăng

cao hơn các chủng khác vào ngày thứ 3 và thứ 4 và cĩ pH cao nhất là 6.58 vào

ngày thứ 4 Độ pH thấp nhất là 3.93 của chủng LPHT 234 ở ngày thứ 1

Trang 37

Nồng độ chất tan cho thấy xu hướng giảm dần của các chủng Nồng độ thấp nhất là 3.1 của LPH 156 ở ngày thứ 4 và cao nhất là 5.1 của chủng LPHT

vào ngày thứ I

Sinh khối khơ thu được từ chủng FCH 112.2 là cao nhất với số lượng là

6.92g/1, chủng LPH 156 cĩ sinh khối khơ ít nhất là 4.62g/1

Sau đĩ năm chủng lên men bằng bình tam giác 250ml với dịch hèm sắn

lỏng Các bình được chụp theo thời gian đề so sánh sinh khối

Trang 38

72 96

Các chủng đều mọc tốt trong điều kiện nuơi cấy và phát triển nhanh nhất

trong ngày thứ 2 và thứ 3 Chủng FCH 112.2 cĩ hiện tương đổi màu sau ngày thứ nhất Chủng LPHT 234 tạo hạt sau 1 ngày nuơi Hiện tượng này cĩ lặp lại

khi tiếp tục lên men trên bình tam giác 250ml so với bình tam giác 100ml

Các bình lên men được lấy mẫu theo thời gian, mỗi lần lấy 10ml để xác định nồng độ đường khử, độ pH, nồng độ chất tan Sau khi kết thúc lên men, sinh khối được tách bằng vải lọc và đem đi xác định sinh khĩi khơ

Trang 40

Bảng 3 10 Nơng độ chất tan 5 chủng lên men bình tam giác 250ml

Giờ 8 12 24 48 72 9% Ching Rhizomucor miehei FCH116.3 52 51 49 46 43 3.9 Rhizopus microsporus LPH084 5] 5 47 42 38 33 Rhizopus microsporwsLPHIS6 5] 5 47 43 39 32

S151 49 44 3.7 34 FCH 112.2 Rasamsonia emersonii LHHT 51 5l 48 45 39 33 234 ĐC 5

Bảng 3 11 Sinh khối khơ thu được sau sấy bình lên men 250ml

Rhizomucor| Rhizopus | Rhizopus | Myceliophthora | Rasamsonia

Bảng 3 12 Sinh khĩi khơ của 5 chủng lên men bình tam gide 250ml

Rhizomucor | Rhizopus | Rhizopus | Myceliophthora | Rasamsonia

(g/L) | 7.975 5.9 48 10.4 5.95 0