TRUONG DAI HOC MO HA NOI
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP
Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất sinh khối
nắm từ dịch hèm
Trang 2MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MUC TU VIET TAT
DANH MUC BANG DANH MỤC HÌNH ẢNH MO DAU PHAN 1: TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Lịch sử của nắm sợi
1.2 Đặc điểm chung của nấm sợi
1.2.1 Hình thái và cấu trúc của sợi nắm
1.2.2 Sinh sản của nắm sợi
1.3 Lên men sinh khối nắm sợ
1.4 Các kỹ thuật lên men chìm
PHAN 2: PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 Vật liệu 2.2 Hĩa chất, thiết bị 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Quan sát hình th:
2.4.2 Phương pháp xác định khối lượng sinh khơi
2.4.3 Phương pháp phân tích đường khử tổng bang DNS
Phương pháp xác định pH
2.4.5 Xác định nồng d6 chat tan Brix 2.4.6 Nơng độ protein
2.4.7 Phương pháp lên men
Trang 3Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
3.2.2 Thay đổi kích thước hệ sợi trong lên men
ự thay đổi các thơng số lên men trên quy mơ thiết 3.3.1 Thay đơi của pH trong quá trình lên men 3.3.2 Nồng độ chất tan Brix 3.3.3 Nồng độ đường khử 3.3.4 Nồng độ oxy hịa tan 3.3.5 Nồng độ protein 3.4, Đánh giá sự thay đổi các thơng số lên men trên quy mơ thiết bị lên men khuấy trộn na52 3.4.1 Thay đổi của pH trong quá trình lên men
3.4.2 Nơng độ chat tan Bx 3.4.3 Nong độ đường khử 3.4.4 Nồng độ oxy hịa tan 3.4.4 Nồng độ protein
3.5 So sánh lên men sục khí va lên men khi
Trang 5Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2 1 Các chủng nắm mốc sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2 2 Bảng xây dựng đường chuẩn đường khử
Bảng 2 3 Bảng xây dựng đường chuẩn protei Bảng 2 4 Thể tích cấp giống của 5 chủng
Bảng 3 I Hình ảnh năm chủng lên men bình tam giác 100ml
Bảng 3 2 Néng độ đường khử theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam
giác 100ml
Bảng 3 3 pH theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam giác 100m
Bảng 3 4 4 Nơng độ chất tan theo thời gian của 5 chủng lên men bình tam giác 100ml
I1 Sinh khơi khơ thu được sau sây bình 1én men 250m 12 Sinh khơi khơ của 5 chủng lên men bình tam giác 250m 13 Hình thái hệ sợi của 5 chủng
14 Bảng hình ảnh chụp 5 chủng cùng thước đo theo thời gian
l5 Kích thước hệ sợi của 5 chủng
16 Hình ảnh hệ sợi 5 chủng lên men sục khí
17 Độ pH trong quá trình lên men sục khí
.18 Nơng độ chat tan trong qua trình lên men sục kl
19 Nồng độ đường khử trong quá trình lên men sục khí
20 Nồng độ protein trong quá trình lên men sục khí
21 Hình ảnh hệ sợi 5 chủng lên men khuấy trội
22 Độ pH trong quá trình lên men khuấy trộn
.23 Nơng độ chất tan Brix trong quá trinh lên men khuây
24 Nồng độ đường khử trong quá trình lên men khuấy
25 Nơng độ protein trong quá trình lên men khuấy trộn
Trang 6Hình 2 Hình 2 Hình 2 Hình 2 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 Hình 3 trộn DANH MỤC HÌNH ẢNH
1 Sơ đỗ quy trình nghiên cứu
2 Đường chuân Protein - Lowry
3 Hệ thơng lên men sục khí
4 Hệ thống lên men khuấy trộn
1 Lên men bình tam giác 100mL 2 Lên men bình tam giác 250mL 3 Bình lên men sục khí theo thời gian
4 Kết quả thu được lên men sục khí
5 Độ pH trong quá trình lên men sục khi
6 Nơng độ chất tan trong quá trình lên men sục khí
7 Nịng độ đường khử trong quá trình lên men sục khí 8 Nồng độ protein trong quá trình lên men sục khí
9 Thiết bị lên men khuấy trộn theo thời gian
10 Kết quả thu được lên men khuấy trội
11 Độ pH trong quá trình lên men khuấy trộn
12 Nơng độ chất tan Brix trong quá trình lên men khuấy trộn
13 Nơng độ đường khử trong quá trình lên men khuấy trộn
14 Nơng độ oxy hịa tan trong quá trình lên men khuấy trộn
15 Nồng độ protein trong quá trình lên men khuấy trộn
Trang 7Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
MỞ ĐÀU
Hiện nay, cùng với sự phát triển của khoa học cơng nghệ, cơng nghệ sinh
học đã cĩ những nghiên cứu ứng dụng ngày càng đa dạng trong nhiều lĩnh vực
như thực phẩm, y học, nơng nghiệp, cơng nghệ mơi trường, Những sản
phẩm ứng dụng của cơng nghệ sinh học trong các lĩnh vực cĩ thê kể đến như:
thực phâm, kháng sinh, enyme, chế phẩm sinh học, nhiên liệu sinh học, hợp
chất cĩ hoạt tính sinh học trong y dược
Nắm sợi là một trong những giới vi sinh vật đa đa dạng trên trên trái đất được tìm thấy ở hau hết mọi nơi: trong đắt, nước, khơng khí và bên trong các
sinh vật khác Các ước tính gần đây cho thấy cĩ tới 3,8 triệu lồi nắm khác nhau, trong đĩ chỉ cĩ 120 000 lồi đã được chính thức cơng nhận và chỉ cĩ 35
000 lồi được đặt tên [6] Chúng ta thường nghĩ nắm mốc là những sinh vật gây
hại như âm mốc nhà cửa, quần áo, thực phẩm và gây nên vấn đề về sức khoẻ nhưng thực tế nắm sợi luơn đĩng gĩp nhiều tác dụng tích cực cho cuộc sống, ví dụ như tổng hợp kháng sinh, thuốc, sản xuất thực phẩm và đồ uống, làm sạch nước và khử ơ nhiễm đất, Sinh khối nắm sợi vốn đã được lợi dụng đẻ làm
thay đổi cấu trúc và hương vị của nguyên liệu trong một số thực phẩm truyền thống như tương, tempch, phơ mai chưa kẻ đến các lồi nắm mũ làm nguyên liệu thực phẩm Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học hiện nay, một trong những
xu hướng mới là sản xuất sinh khối sợi làm mycoprotein và vật liêu mới
Trong quá trình sản xuất cthanol cơng nghiệp sẽ sản sinh một lượng địch
hém thải (bã rượu) rất lớn từ quá trình lên men và chưng cắt với nồng độ chất
hữu cơ cao Thêm vào đĩ, nước vệ sinh, các chất thải khác trong sản xuất cũng
gĩp phân làm tăng chất thải của quá trình sản xuất Với lượng chất thải lớn như
vậy, nếu khơng được xử lý tốt sẽ gây hậu quả nghiêm trọng tới mơi trường
“Thơng thường, các sản phẩm bã hèm từ ngơ cĩ giá trị dinh dưỡng cao thường
được sử dụng cho chăn nuơi, bã hèm từ sắn cĩ giá trị dinh dưỡng thấp và chứa nhiều chất xơ nên hiệu quả trong chăn nuơi khơng cao Đề xử lý dịch hèm hiệu
Trang 8
quả hơn, giảm thiểu tác động tới mơi trường, sử dụng nắm sợi phát triển trên
dich hém làm giảm các chất hữu cơ và thu sinh khối hệ sợi là một hướng đi cĩ
tiềm năng ứng dụng nâng cao giá trị của dịch hèm
Trong quá trình sản xuất sinh khối nắm sợi, quá trình lên men diễn ra phức
ê kích
tạp hơn so với lên men vi khuẩn và nắm men do diễn ra sự thay đổi
thước hệ sợi Nghiên cứu khảo sát các thơng số về thay đổi thành phần dinh dưỡng và biến đồi đặc tính canh trường lên men giúp hiểu hơn về quá trình lên men nhằm mục tiêu điều khiển và tối ưu quá trình lên men Trong nghiên cứu
này, chúng tơi tập trung vào nội dung “Nghiên cứu quá trình lên men sản xuất
sinh khối nắm từ địch hèm ” nhằm mục tiêu ứng dụng trong lên men sinh khối
nắm sợi từ dịch hèm thải của nhà máy
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu và khảo sát các thơng số biến
đổi của canh trường lên men bao gồm các thơng số chính như pH, nồng độ
đường khử, oxy hịa tan nhằm thu được sinh khối tối đa trong quá trình lên
men
Nội dung chính của nghiên cứu bao gồm:
Trang 9Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học PHAN 1: TONG QUAN TAI LIEU 1.1 Lịch sử của nấm s Nắm sợi cĩ mặt trên thế giới xuyên suốt trong hàng triệu năm qua Từ thời
đồ đá, người ta cắt nắm Fomes /omenarius khỏi các gốc cây và biến nĩ thành vật liệu giống như ni Amadou để làm mũ và áo khốc Trong một thời gian dài, Amadou là vật liệu làm từ nấm duy nhất được sử dụng phơ biến, nhưng điều này sắp thay đổi Trong mười năm qua, các vật liệu làm bằng hoặc từ nấm đã bắt đầu xuất hiện trên các tạp chí thiết kế và nghệ thuật, làm ghế, chụp đèn, ví, Lên men nắm sợi đã được sớm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất kháng
sinh vào năm 1982, lên men enzyme từ nắm sợi là một trong những mảng cĩ
nhiều ứng dụng nhất như amylase từ 4spergillus niger, Aspergillus ory2ae;
cellulase từ A niger, Trichoderma reesei; glucoamylase tir A niger, A
oryzae (Rokem, 2010) Người đầu tiên phát hiện ra chất kháng sinh là bác sĩ
người Anh Alexander Fleming (1881-1955) Năm 1928 ơng là người đầu tiên
tách được chủng nắm sinh chất kháng sinh penixilin, mở ra một kỉ nguyên mới
cho khả năm tự đây lùi nhanh chĩng các bệnh nhiễm khuẩn Ơng được nhận
giải thưởng Nobel vào năm 1952 Hàng loạt các chất kháng sinh quan trong
khác đã được liên tiếp phát hiện ra và ứng dụng vào các năm tiếp sau: baxitraxin
(1945), cloramphenicol (1947), polimixin (1947), clotetraxiclin (1948),
xephalosporin (1948), neomixin (1949), eritromixin (1952), grizeofulvin
(1959), gentamixin (1963), kasugamixin (1964), bleomixin (1965), validaxin
(1970), 4spergillus oryzae là một loại nắm được sử dụng rộng rãi trong các
nghành cơng nghiệp lên men truyền thống của Nhật Bản, tạo ra nước tương,
rượu sake, giắm sản xuất Nĩ được sử dụng lần đầu tiên về sản xuất thương mại của enzyme lipase trong bột giặt năm 1988 [5]
1.2 Đặc điểm chung của nấm sợi
Nấm sợi là tất cả các nắm khơng phải nám men và cũng khơng sinh mũ nắm
như ở các nắm lớn Tuy nhiên ở tất cả các giai đoạn chưa sinh mũ nắm thì khuẩn
Trang 10
tỉ thể (hệ sợi nắm) của nắm lớn vẫn được coi là nâm sợi và được nghiên cứu về
các mặt sinh lí, sinh hố, di truyền, như các nắm sợi khác
Méc là chủng lồi nằm lớn và đa dạng về mặt phân loại, khi mà sự phát triển
của sợi nắm làm chúng mắt đi màu sắc và cĩ dạng xù xì, đặc biệt là trên thực phẩm Mạng lưới của những sợi nắm dạng ống này được gọi là thể sợi, được xem là một cơ thể duy nhất Sợi nắm thường là trong suốt, vì vậy mà thề sợi trơng giống như là những sợi chỉ mịn và xù xì bao phủ trên bề mặt Các vách ngăn (septa) cĩ thẻ phân chia những ngăn nhỏ liên kết với nhau dọc theo sợi nắm, mỗi ngăn cĩ chứa một hoặc nhiều nhân tế bào giống nhau về mặt di truyền
Kết cầu giống như bụi của nhiều loại mốc là do sự tạo thành vơ số các bào tử
vơ tính (conidia) bởi sự phân hĩa ở cuối sợi nắm Kiểu tạo thành và hình dạng
của những bào tử này thường được dùng đẻ phân loại mĩc Nhiều loại bào tử
này cĩ màu sắc, làm cho nắm trơng rõ ràng hơn khi quan sát vào giai đoạn này
trong vịng đời
Nắm sợi cịn được gọi là nắm mốc, tức là chỉ tắt cả các mốc mọc trên thực
phẩm, trên chiếu, trên quần áo, trên giày dép, trên sách vở, Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn co chat hữu cơ khi gặp khí hậu nĩng ẩm Trên nhiều vật liệu vơ cơ dính bụi bẳn (như các thấu kính ở ống nhịm, máy ảnh, kính hiền vi, ) nắm mốc vẫn cĩ thể phát triển, sinh axit và làm mờ các vật liệu này [5]
1.2.1 Hình thái và cầu trúc của sợi nắm
Các sợi nắm đều cĩ chiều ngang tương tự như đường kính nấm men Cấu trúc của sợi nắm cũng tương tự như cấu trúc của tế bào nắm men Bên ngồi cĩ thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân phân hố Màng nhân cĩ cấu tạo 2 lớp và trên màng cĩ nhiều lỗ nhỏ Trong nhân cĩ
hạch nhân Bên trong tế bào nắm cịn cĩ khơng bào, tỉ thể, mạng lưới nội chất,
bào nang, thể màng biên Thể màng biên là một kết cầu màng đặc biệt, nằm ở giữa thành tế bảo và màng tế bảo chất, bao bọc bởi một lớp màng đơn và cĩ hình dáng biến hố rất nhiều (hình ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hoặc
Trang 11
Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
nhiều lớp ) Cơng dụng của thể màng biên cịn chưa được làm sáng tỏ, cĩ thể
là cĩ liên quan đến sự hình thành tế bào
Đỉnh sợi nắm bao gồm một chĩp nĩn, khơng tăng trưởng và cĩ tác dụng che
chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nắm Đây là phần mà chất nguyên sinh khơng cĩ nhân và ít chứa các cơ quan tử Phần này rất dễ tách rời với các phần cịn lại của ngọn sợi nắm vì dưới chop nĩn là một phần cĩ thành rat mỏng Dưới nữa là phần tạo ra thành tế bào Các sợi nhỏ trên thành tế bào xếp ngang (chéo gĩc với trục sợi nắm) Dưới nữa là phần tăng trưởng Thành của phần này cĩ cấu
trúc sợi dạng mạng lưới Ngọn sợi nắm tăng trưởng được là nhờ phần này Dưới
nữa là phần thành cứng hay cịn gọi là phần thành thục của sợi nấm Thành tế
sat
bào ở phần này ngồi các sợi ngang cịn được tăng cường bởi các sợi dọ:
đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nắm Giữa hai
phần nĩi trên là một miền yếu và dễ gẫy Ở phần tăng trưởng sợi nắm chứa đầy
chất nguyên sinh với nhiều nhân, nhiều cơ quan tử, nhiều enzyme, nhiều axit
nucleic Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và sự phân nhánh của sợi nắm Ở các lồi nắm khuẩn tỉ khơng cĩ vách ngăn bên trong khuẩn tỉ cĩ nhiều nhân Người ta gọi đĩ là các tế bào đa nhân Ở các lồi nắm cĩ vách ngăn thì
do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào cĩ thể chứa 1 nhân, 2 nhân,
nhiều nhân hoặc chẳng cĩ nhân nào Nắm cĩ sợi nắm khơng ngăn vách gặp ở
các lớp Chụridiomycetes, Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Zygomycetes,
Trichomycetes Nam thuộc tất cả các lớp khác trong ngành Nấm thất
(Eumycota) đều cĩ sợi nắm ngăn vách [5] 1.2.2 Sinh sản của nắm sợi
Lúc bào tử rơi vào một điều kiện mơi trường thích hợp nĩ sẽ nảy mầm mọc
ra theo cả ba chiều thành một hệ sợi nắm hay gọi là khuẩn tỉ thể Trên khuẩn tỉ
thể ta phân biệt được hai loại khuẩn tỉ Khuẩn tỉ cơ chất hay khuẩn tỉ dinh dưỡng và khuẩn tỉ khí sinh Khuẩn tỉ cơ chất cắm sâu vào mơi trường cịn khuẩn tỉ khí
sinh phát triển tự do trong khơng khí
Trang 12
Hệ sợi nắm cĩ thể tiến hố đề thích nghỉ với các điều kiện sống khác nhau
thành các dạng đặc biệt sau:
+ Rễ giả (rhizoid): Trơng gần giống như một chùm rễ phân nhánh, cĩ tác dung
giúp nấm bám chặt vào cơ chất và hấp thụ chất dinh dưỡng từ cơ chất Cĩ thể
thấy rõ rễ gia khi quan sat nam Rhizopus
+ Soi hut (haustoria): Gap ở các nắm kí sinh bắt buộc Chúng được mọc ra từ
khuẩn tỉ và phân nhánh rồi đâm sâu vào tế bào vật chủ, ở đĩ chúng cĩ thể biến thành hình cầu, hình ngĩn tay hay hình sợi Chúng sử dụng các sợi hút này để hút chất dinh dưỡng từ cơ thể của vật chủ
+ Soi dp (appresspria): Gặp ở các nắm kí sinh ở thực vật Phần sợi nắm tiếp xúc vật chủ sẽ phĩng to ra, tăng diện tiếp xúc với vật chủ Phần này thường cĩ hình
đĩa, cĩ nhiều nhân tế bào, áp chặt vào vật chủ Các mơ của vật chủ dưới sự tác
dụng của enzyme do nắm sinh ra sẽ bị phá huỷ từng phan hay hồn tồn Qua
mơ bị phá huỷ này các sợi nắm sẽ lắn sâu vào bên trong vật chủ và tiếp tục sinh
enzyme để tiêu hố cơ thể vật chủ Khác với sợi hút, sợi áp khơng phát triển
thành các nhánh đâm sâu vào tế bào cịn sống của vật chủ
+ Sợi bị hay thân bị (stolon): Đĩ là đoạn sợi nấm khí sinh khơng phân nhánh
phát sinh từ các sợi nắm cơ chất, cĩ hình thăng hoặc hình cung Đầu mút của
các sợi bị chạm vào cơ chất phát triển thành các rễ giả để bám chắc vào cơ
chất sợi bị cứ lan dần ra mọi phía kể cả trên thành thuỷ tỉnh của ống nghiệm,
của nắp đậy Petri Sợi bị và rễ giả thường gặp ở bộ Mucorales
+ Vong nam hay mạng nắm: Đĩ là những biến đổi ở các lồi nám cĩ khả nắng, bẫy các động vật nhỏ trong đất (như amip, tuyến trùng, ) Vịng nắm cĩ thể cĩ
dang bong dinh mọc ra từ những cuống ngắn xếp thẳng gĩc với sợi nắm chính
Trang 13Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Từ khuẩn tỉ khí sinh cĩ thể mọc ra những sợi sinh sản vơ tính hoặc hữu tính sau đây:
+ Đầu bào tử trần (conidinal head): Các cơ quan sinh sản vơ tính cĩ thể cĩ cầu
tạo chứa các bào tử vơ tính Ở nắm thuộc các chỉ Penicillium va Aspergillus c6 các đầu bào tử trần với nhiều sợi nắm phân hố khác nhau Chăng hạn ở chỉ Penicillium bat dau tir doan sgi chua phân nhánh gọi là cuống nắm rồi đến các
sợi phân nhánh bậc một gọi là cành tiếp đĩ là sợi phân nhánh bậc hai gọi là
cành nhánh Phần sinh ra các bào tử trần gọi là thể bình Thẻ bình cĩ thể cĩ một
lớp hoạ
bọng cịn gọi là bao nang Cac bao tir trin 6 Aspergillus cé thé toa trịn ra thành hai lớp 6 Aspergillus thường chỉ cĩ các cành nhánh mọc ra từ một
hình phĩng xạ, cũng cĩ thể hướng cả về một phía tạo thành hình trụ
+ Nang bào tử kín (sporangia) : Là dạng biến đổi ở bộ A#wcoraies, mọc lên từ
cuống nang Mỗi nang bào tử kín Các bào tử kín được sinh ra bên trong các nang này
+ Đảm (basidia) : Là cơ quan sinh sản hữu tính do tế bào song nhân ở đỉnh sợi phình to ra mà tạo thành Trong đảm hai nhân sẽ phối hợp với nhau để hình thành một nhân lưỡng bội Sau đĩ do phân cắt giảm nhiễm mà sinh ra 4 nhân
đơn bội Khi đĩ trên đảm sẽ mọc ra 4 cuống nhỏ đầu phình to ra Các nhân đơn bội sẽ đi vào 4 cuống nhỏ này và về sau phát triển thành 4 bào tử đảm
+ Túi giá (piemidium): Lả dạng hình thái cĩ hình cầu hay hình chai mà vỏ cấu tạo thành một khĩi khá dày Bào tử trần sinh ra trên đỉnh cuống, tạo thành một
các đệm gồm nhiều cuống dính với nhau một phần hoặc tắt cả
Trang 14+ Bĩ giá (coremium; synnema): Là nhiều cuống bào tử trần dài, xếp song song với nhau ở phần gốc hoặc suốt dọc cuống, mang các bào tử trần ở phần ngọn
hoặc suốt dọc thân
+ Hạch nắm (sclepotium) : Là khối sợi nắm rắn chắc thường cĩ tiết diện trịn,
khơng mang các cơ quan sinh sản Hạch nắm chỉ cĩ ở các nắm cĩ sợi nắm ngăn
vách Đĩ là một dạng sống nghỉ của nắm đề bảo vệ nấm trải qua được các điều kiện bắt lợi của mơi trường sống,
+ Thể đệm (stroma): Cịn gọi là đệm nắm, là một khối sợi nắm cĩ thành tế bào
dính liền nhau theo nhiều hướng Trên hoặc trong thẻ đệm cĩ mang các cơ quan
sinh sản
+ Quả túi (fruit— bodes): Là loại thể đệm gặp ở Nắm túi Cĩ dạng quả túi hình cầu (eleistotheeium) cĩ loại quả túi hình chai (perithecium), cĩ loại quả túi hình
đĩa (apothecium), loại quả túi hình cầu gặp ở lớp Plectomycetes, loại quả túi
hình chai gặp ở lớp Pyrenomycetes, loại túi hình đĩa gặp ở lớp Discomycetes [5]
1.3 Lên men sinh khối nắm sợi -_ Sản phẩm lên men truyền thống
Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất của sự chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn Sự xuất hiện, qui trình chế biến, và sử dụng của thực phẩm lên men đã được viết nhiều [9] Một vài sản phẩm
lên men (phĩ-mat, bia, rượu, nước tương) đã cĩ kinh nghiệm sản xuất một
lượng lớn, với việc sử dụng giống chủng ưu việt, mặt khác nhiều thực phẩm lên
men vẫn cịn được sản xuất sử dụng kỹ thuật truyền thống lâu đời dưới những
điều kiện đơn giản hoặc ngay cả nguyên sơ
Pho-mát Camembert: Camembert là loại pho mát mềm của Pháp Nĩ
Trang 15Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
Camembcrt là 1 loại pho mát làm từ sữa bị tươi để lên men Thời gian để
thường là 3 tuần hoặc 4 tuần Pho mát Camembert được làm từ sữa bị chưa
được diệt khuẩn theo phương pháp Pasteur, và được làm chín bằng các loại mốc Penicillium candida va Penicillium camemberti trong it nhat 3 tuan
Pho mát Camembert thường được ủ theo từng bánh trịn nặng khoảng 250 gram,
bọc trong giấy và đĩng trong hộp gỗ Pho mát Camembert cĩ thể được dùng
trong nhiều mĩn ăn, nhưng nĩ thường được ăn (khơng qua nấu) với bánh mì hoặc thịt, hoặc làm đồ nhắm rượu vang, đẻ cĩ thê thưởng thức được hương vị tỉnh tế sẽ bị mất nêu qua đun nấu Lớp da bên ngồi của camembert phải cĩ màu bạc hoặc hơi vàng nâu, bề mặt phải trơn bĩng, cĩ những vết rạn nâu nhỏ,
ngửi mùi phải nhẹ, thơm vị phơ mai
Chao (sufu): Chao (sufu) cũng được viết như fu-ru, là do hoa sữa đậu
nành lên men mốc cĩ mùi khá nặng (Su, 1986) Chao được sản xuất chủ yếu ở
“Trung Quốc cho tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, sản lượng hàng năm ước tính ít
nhất 300 triệu tấn Chao được tiêu thụ như một chất gia vị, ví dụ với cơm điểm tâm sáng hoặc bánh mì hấp Chao được làm từ khối đậu hũ (thu được từ kết tũa
sữa đậu nành) Đậu hũ được dùng làm chao cứng hơn bởi ép hoặc được sử lý
hơi nĩng nhanh, và tuần tự được chủng giống trên bề mặt và ủ ở âm độ cao tại
nhiệt độ 20-35°C, tuỳ thuộc vào địa điểm và mùa (trong năm) Các loại nắm
mốc tham gia chủ yếu là Acrinomueor và Mucor spp Những nhà máy sản xuất
lớn cĩ sử dụng giống thuần chủng, chẳng hạn như Actinomucor elegans, ngược
lại tại các cơ sở sản xuất nhỏ, sử dụng rơm lên mốc để chủng lên khối đậu hũ với một hệ vi sinh vật hỗn hợp của nắm mốc và vi khuẩn Actinomucor elegans khơng phát triển tốt ở nhiệt độ vượt quá 25°C, các méc khac vi dy nhu Mucor
°hiemalis hoặc Rhizopus chinensis được sử dụng ở nhiệt độ cao hơn
Tempeh: Tempeh cĩ nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ
biến ở Hà Lan và nĩ đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và
Uc Tempeh là một bánh cĩ thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên
Trang 16
men bề mặt với nắm của những hạt đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác
sau khi đã ngâm rồi nấu Cơ chất được dùng nhiều và phơ biến nhất là đậu nành
(Nout and Rombouts, 1990; Wood, 1998) Tempeh cung cấp một nguồn đạm
thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hố và an tồn Nĩ thường được ăn chỉ
khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu Nắm mốc duge ding 1a Rhizopus oligosporus va R oryzae, ching nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lắn át các dịng tạm nhiễm
khác như Aspergillus spp [11]
Rugu sake: Méc Koji la mot nhém cia ching loai Aspergillus, dang chi
ý là Aspergillus oryzae, và sau đĩ là A sojae, đã được nuơi cấy ở vùng Đơng, Á trong hàng thế kỷ Chúng được sử dụng để làm lên men hỗn hợp đậu nành
và bột mì dé làm miso và xì dầu Mốc Kò/¡ phân rã tỉnh bột trong gạo, dai mach, khoai lang quy trình đĩ được gọi là thủy phân, ứng dụng trong sản xuất rượu
sake, Shõchũ và những loại rượi chưng cắt khác A⁄ốc Koji cũng được sử dụng để chế biến cá bảo [8]
Gạo đỏ lên men là một sản phẩm của mốc ÄMonaseus Pwrpureus khi nĩ phát triển trên gạo, và khá phỏ biến trong những khâu phần ăn ở châu Á Men cĩ chứa vài hợp chất được biết là monacolin, được cho là cĩ thể ngăn cản sự tổng hợp cholesterol Một nghiên cứu cho thấy rằng gạo đỏ lên men khi được sử dụng làm thực phẩm chức năng, kết hợp với dầu cá và thay đổi cách sống lành mạnh, cĩ thể giúp giảm lượng cholesterol hiệu quả như một vài loại thuốc
statin nhất định Một số loại xúc xích, chẳng hạn như salami, kết hợp với việc
cấy nắm mốc đề làm tăng hương vị và giảm sự hình thành vi khuẩn trong suốt
quá trình lên men Ví dụ như Penicillium nalgiovense cĩ thê xuất hiện dưới dạng,
một lớp phủ màu trắng dạng bột trên một số xúc xích lên men phơi khơ
Những loại mốc khác mà được sử dụng trong chế biến thức ăn bao gồm:
Fusarium venenatum — quorn; Geotrichum candidum — Pho mat; Penicillium
spp — Nhiều loại pho mát đa dạng như pho mat Brie và pho mát xanh;
Trang 17Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học Rhizomucor' miehei ~ Enzym rennet đề làm các loại pho mat chay và những loại pho mat khác
-_ Sản phẩm lên men hiện đại
Mycoprotein: Vào giữa thế kỷ 20, trong tình hình thế giới sớm bị cạn
kiệt protein, là một nhà sản xuất ngũ cốc lớn, tập đồn thực phẩm của Anh
Rank Hovis McDougall (RHM) da tim ra loai nam Fusarium venenatum dé ché
biến tỉnh bột dư phụ phẩm thành loại protein nỗi tiếng với tên gọi mycoprotein
Nĩ đã làm cho thương hiệu Quorn cĩ trị giá hàng trăm triệu đơ la Họ tìm kiếm
nắm vì nĩ cĩ ưu điểm là phát triển rất hiệu quả trong những điều kiện đơn giản Hầu hết chúng phát triển và nhân đơi số lượng chỉ trong nửa giờ Bên trong tế bào của chúng biến thành các chất dinh dưỡng mà chúng đã hấp thụ thành protein thực phẩm hơn bắt kỳ con gà hay bị nào
Mycoprotein được sản xuất trong các thiết bị lên men lớn với hỗn hợp
đường, nước và một số khống chất ở một nhiệt độ nhất định Khơng khí sục
qua chất lỏng, trộn đều dinh dưỡng và cung cấp oxy bão hồ Trong bể sục dinh dưỡng này, một lượng nhỏ canh trường nấm bắt đầu được cấp giống theo cách vơ trùng để đảm bảo rằng khơng cĩ gì khác ngồi chủng nắm đã lựa chọn phát triển bên trong bẻ Các tế bào nắm được bao quanh bởi những điều kiện lý tưởng nhất mà chúng cĩ thê phát triển và phân chia một cách nhanh chĩng, hình thành những đám sợi dày, mềm mịn Nếu khơng bồ sung thêm chất dinh dưỡng, sợi nấm sẽ phát triển và tồn bộ quá trình hồn thành trong vịng chưa đầy 24h Sợi nắm được thu hoạch bằng cách tách nĩ ra khỏi chất lỏng Các sợi nhỏ dan xem của sợi nắm khiến cho mycoprotein giống thịt một cách đáng ngạc nhiên Nĩ cĩ hàm lượng protein và chất xơ cao, rất ít chất béo và đường và
khơng cĩ mùi Quorn thực hiện một quy trình lên men liên tục, trong đĩ các sợi
nắm đã phát triển được lấy ra khỏi bé va dinh dưỡng luơn được thêm vào để
giữ một lượng chất dinh dưỡng ồn định và khơng gian cho các sợi nắm mới
phát triển[7] Bằng cách này một quá trình duy nhất cĩ thể chạy tối đa trong 6
Trang 18
tuần và tạo hàng trăm cân mycoprotein mỗi giờ, hơn cả thời gian bị phát triển từ lúc thụ thai đến khi xuất chuồng Điều đĩ cĩ thể thấy rõ tại sao sản xuất mycoprotein lại là một các cực kỳ hiệu quả để sản xuất protein
-_ Các nghiên cứu gân đây
Những nghiên cứu ứng dụng nắm mốc trong các lĩnh vực gần đây cĩ thé
kế đến như: Lên men axit gluconic hiệu giá cao bằng cách sử dụng axit lỗng,
khơ đã được xử lý trước thủy phân mà khơng cần giải độc Chủng lên men
la Aspergillus niger SIM M276 Nghiên cứu này cung cap sản xuất axit gluconic hiệu giá cao đầu tiên từ nguyên liệu lignocellulosic cĩ tiềm năng ứng, dụng cơng nghiệp Sản xuất axit citric bằng cách lên men Aspergillus niger d& được cải tiến về mặt di truyền Sản lượng cơng nghiệp của axit xitric lớn hơn sản lượng của hầu hết các chất chuyển hĩa chính khác cĩ nguồn gốc từ quá trình lên men, và vượt quá 400000 tắn trên tồn thể giới (Bigelis va Tsai,
1995) Tại Hoa Kỳ, nĩ chủ yếu cĩ lương thực (62% tổng số sản lượng trong,
nước), chất tây rửa (24%), dược phẩm (8%) và các ứng dụng cơng nghiệp khác
(6%) Hầu hết các quá trình lên men với 4 øiger đều là được hình thành trong các máy lên men khí lớn, được điều khiển bằng máy tính thiết kế cĩ cánh khuấy
hoặc sục khí (airlift fermenter), mặc dù khoảng 20% thế giới sản lượng vẫn thu
được bằng cách lên men bể mặt Nhiệt độ của quá trình lên men mơi trường là
28-33°C, và pH là 1,5~2 Một quá trình lên men điền hình kéo dài 5-8 ngày và
tạo ra một số sản phẩm phụ, chẳng hạn như oxalic axit hoặc axit gluconic [10]
Sinh khối ác
ám mốc 4spergillus niger T2 được ủ với tiêu nguyên liệu cĩ dụng đáng kế đến khả năng bĩc vỏ trong sản xuất tiêu sọ Hiệu suất bĩc vỏ tiêu của chủng nam Aspergillus niger T2 cao nhat dat 99,977% sau 4 ngay xt ly voi
ham lugng chung bé sung 1a 4%"), Chitosan va glucozamin được tổng hợp,
tách chiết và thu nhận từ sinh khối sợi ndm Rhizopusp.BG giau chitin, chitosan
& quy m6 phong thi nghiém[2] Ching Aspergillus protuberus thể hiện hoạt
tính chitinase Dịch enzyme được tách chiết từ sinh khối nắm mốc bằng nước
Trang 19
Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
cất cĩ hoạt tính chitinase cao nhất ở nhiệt độ 55°C và pH 5,03] Sinh khối nắm Noumuraea rileyi được sản xuất đề khắc phụ hạn chế thuốc hố học gây ra cho
rau và đậu tương [4] Ngồi ra nắm sợi cịn được nghiên cứu phát triển trong
nhiều lĩnh vực khác như cơng nghiệp enzyme (sản xuất penixilin, xephalosporin, ecgoalcaloit, các streroit, ) sản xuất thuốc trừ sâu sinh học,
kích thích tố sinh trưởng thực vật (gibberellin )
Rhizomucor miehei thuộc chỉ Rhizomucor trong ho Mucoraceae Trong điều
kiện thí nghiệm, lồi này phát triển đặc biệt tốt ở nhiệt độ từ 24 đến 55°C, và phát triển khơng tốt trong điều kiện dưới 21°C hoặc trên 57°C Nĩ cĩ nhiều ứng dụng trong mỹ phẩm hay ứng dụng dùng dé tao enzym làm pho mát trong thực phẩm [9] Rhizopus microsporus thuge chi Rhizopus trong ho
Mucoraceae Loai nam này được tìm thấy nhiều nhất trong đất, mảnh vụn thực
vật và thực phẩm Ẩ mierospor„s thường được tìm thấy trong đất cĩ độ pH trung tính Những tầng đất này thường cĩ độ mặn thấp hơn để tạo điều kiện phát triển tối ưu Phạm vi phát triển của 8 mierosporus từ 25°C đến 55°C với nhiệt độ tối ưu là 28°C Một biến thể thuần hố của lồi này được sử dụng dé chuẩn bị lên men dau nanh truyén théng nhu tempeh va sufu (Rhizopus
oligosporus) [12]
1.4 Các kỹ thuật lên men chìm
Lên men chìm cĩ sục khí và khuấy trộn là phương pháp được phơ biến rộng nhất trong quy trình lên men cơng nghiệp, vì cĩ thể kiểm sốt được tồn bộ các
khâu trong quá trình một cách dé dang So với phương pháp lên men bề mặt,
thì lên men chìm cĩ nhiều ưu điểm đĩ là: ít chốn bề mặt (khơng mắt nhiều
diện tích), dễ cơ giới hĩa và tự động hĩa trong quá trình theo dõi Tuy nhiên
phương pháp lên men chìm địi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị
Ngồi ra, nếu một mẻ lên men, vì một lý do nào đĩ bị xử lý thì khơng thể xử lý
cục bộ được, đa phần phải hủy bỏ cả quá trình lên men, gây tốn kém lớn Phế
Trang 20
liệu của quá trình lên men thải ra phải kèm theo cơng nghệ xử lý chống ơ nhiễm mơi trường
Lên men chìm dùng mơi trường dịch thể Chủng vi sinh vật cấy vào mơi
trường được phân tán khắp mọi điểm và xung quanh bề mặt tế bào được tiếp
xúc với dịch dinh dưỡng Đặc điểm này địi hỏi trong suốt quá trình nuơi cấy
phải khuấy và cung cấp oxy bằng cách sục khí liên tục
Phương pháp lên men chìm cĩ một số ưu điểm: Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyên, chỉ phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp, dễ tổ chức được xí nghiệp cĩ sản lượng lớn, các
thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hố, tự động hố Phương pháp chìm cũng cĩ
một số nhược điểm sau: Địi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng tồn
bộ Vì vậy, những thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẫn thận, chịu
áp lực cao, địi hỏi kín và làm việc với điều kiện vơ trùng tuyệt đối (trong nuơi
cấy bề mặt cĩ thể loại bỏ phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn cịn dùng
được)
Ngày nay, phương pháp lên men chìm được dùng phỏ biến trong cơng nghệ
vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm
phân bĩn, thuốc trừ sâu, các enzyme, các axit amin, vitamin, các chất khang sinh, các chất kích thích sinh học
Việc trộn trong quá trình lên men là cần thiết để ngăn ngừa sự phân tang
nhiệt độ, duy trì độ đồng nhất của pH, tăng sự tiếp xúc mật thiết giữa thức ăn va vi sinh vật nuơi, đồng thời ngăn ngừa sự đĩng cặn và tạo bọt [14] Lên men
chìm cĩ sục khí mang lại lợi thế lớn là khơng cĩ bộ phận chuyền động, hiệu quả hấp thụ khí cao, đặc tính truyền nhiệt tốt và trộn nhanh [13] Đối với hoạt động sản xuất ở quy mơ lớn thì hệ thơng lên men khuấy trộn được sử dụng rộng,
rãi nhất đề thiết kế cho quá trình lên men cơng nghiệp Cường độ pha trộn cĩ
thể
ác nhau bằng các chọn loại cánh khuấy thích hợp và các tốc độ khuấy
khác Lên men khuấy trộn cũng cĩ thể được dùng cho các mơi trường cĩ độ
Trang 21
Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
nhớt cao Nĩ là một trong những hệ lên men quy mơ lớn đầu tiên được phát
triển trong cơng nghiệp dược
Trang 22
PHAN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Năm chủng nấm mốc được khảo sát lên men bình tam giác từ đĩ lựa chọn
01 chủng phù hợp lên men trên thiết bị lên men 2L Các chủng nắm lựa chọn là những chủng vi nấm cĩ khả năng lên men trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp từ bộ sưu tập giống của Viện Cơng nghiệp Thực phẩm
Mơi trường lên men: dịch hèm được thu nhận sau khi cất cồn Dịch hèm
được chuyển từ phân xưởng và bảo quản lạnh -20°C tại Trung tâm Vỉ sinh vật Cơng nghiệp Bang 2 1 Các chủng nắm mốc sử dụng trong nghiên cứu Tên chủng Mã chủng Rhizomucor miehei FCH 116.3 Rhizopus microsporus LPH 084 Rhizopus microsporus LPH 156 Myceliophthora thermophile CH 112.2 Rasamsonia emersonii LPHT 234 2.2 Hĩa chất, thiết bị
- Héa chit: Dinitrosalicylic acid (DNS), NaCl, D-glucose,
- Thiết bị: Tủ cấy, tủ nuơi lỏng 45°C, tủ nudi tinh 45°C, ndi hap, ta lanh, ta đơng, máy tron Vortex, máy đơng khơ, máy ly tâm, kính hiển vi, bể ồn nhiệt, buồng đếm hồng cầu
- Dung cu: Phéu thuy tinh, vai lọc, bình tam giác, cốc thuỷ tinh, bình định
Trang 23Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Các chủng vi nắm được khảo sát khả năng lên men trên mơi trường dịch
hém lỏng và được đánh giá khả năng lên men dựa trên sinh khối tế bào sau khi
lên men
Các chủng được lựa chọn tiếp tục được tiến hành khảo sát lên men trên bình tam giác để đánh giá động học quá trình trên các thơng số như pH, Bx, nồng độ đường khử đề theo các thơng số trong quá trình lên men và khả năng chuyển hĩa cơ chất
Chủng được lựa chọn nghiên cứu quá trình lên men sẽ được tiến hành
lên men trên thiết bị lên men 2I trên hai mơ hình: lên men khuấy trộn và lên
men sục khí để theo dõi hình thái hệ sợi cũng như thơng số quá trình: Nồng độ
chất tan (Bx), Nồng độ đường khử, nồng độ oxy hịa tan (DO), s chủng( - Sinh khối tế bảo vi nắm - Bx - pH Đường khử Lên men bình tam( -_ Hình thái tế bào giác - Bx - pH Đường khử Lên men thiết bị Hình thái pellet lênmen2L | - Bx - DO Đường khử Hình 2 1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Quan sát hình thái hệ sợi sử dụng kính hiển vi
Quan sát bảo tử của nắm sợi sau khi nuơi bằng kính hiển vi Nắm sợi sau
khi lên men sẽ được lấy mẫu để quan sát bào tử theo dõi từng thời gian
Trang 24
Chuẩn bị phiến kính và lamen: phiến kính và lamen được rửa và lau sạch bằng cồn 709
Lấy giống: sử dụng que cấy, tăm, lấy 1 lượng bằng đầu tăm, di giống vừa
lấy lên phiến kính đã nhỏ sẵn 1 giọt nước, dàn trịn đều đường kính 1cm, tránh
bọt khí Nhẹ nhàng đặt lamen lên trên theo chiều nghiêng xuống, tránh tạo bọt
khí tối đa
Chọn vật kính muốn quan sát và điều chỉnh kính cho phù hợp Nếu hình ảnh
mờ cĩ thể dùng nút chỉnh tỉnh Quan sát hình thái bào tử, hệ sợi và sự sinh sản
theo thời gian của nắm sợi
Sau khi quan sát xong thì tắt đèn kính hiển vi, rửa phiến kính và lamen bằng
cơn và ngâm dung dịch vim pha lỗng
2.4.2 Phương pháp xác định khối lượng sinh khối
Sinh khĩi khơ được xác định bằng phương pháp sấy đến khĩi lượng khơng đổi Sinh khối tế bào sau khi nuơi cấy trên mơi trường được lọc qua giấy lọc đã được sấy khơ và xác định khối lượng Sau khi lọc, mẫu được sấy 55°C trong
24h sau đĩ được xác định hàm ẩm và khối lượng khơ
2.4.3 Phương pháp phân tích đường khử tổng bằng DNS
Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường
khử với thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) Thuốc thử DNS sau phản ứng sẽ
tạo thành phức chất với 3-amino, 5-dinitrosalicylic acid, chuyển từ màu vàng
chuyên sang nâu Dụng cụ:
Bình định mức; cốc đong; ống đong thủy tỉnh; eppendorf; vi đĩa 96 giếng,
pippet; block nhiệt và máy do OD
Xây dựng đường chuẩn
-Đường D-glucose được sấy 105%€ C trong Ih Cân chính xác 5g D- glucose và hịa tan với 40ml nước cắt trong cốc đong thủy tỉnh, sau đĩ
Trang 25
Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học định mức đến đúng 50ml thu được dung dịch stock 100 mg/ml (bảo quản -20°C C) Bang 2 2 Bảng xây dựng đường chuẩn đường khử D-glucose(mg/ml) [2 15 [l(ỗng!) |05 [0.2 D-Gmg/ml (ul) |200 |150 |100 50 200 uL của ơng 1 Nước cất (uL) 800 |850 |900 950 |800
-Tiễn hành xây dựng đường chuân
1 200 wL, D-glucose theo các nồng độ trên duge cho Eppendorf
1.5ml
2 Bé sung them 400 pL DNS, mix déu Phan tng mau 6 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá
3 Lay 40 uL dịch phản ứng + 180 pL nude cat, mix déu trong vi dia
4 Do OD 540nm Dựng được đường chuẩn y=ax + b
Mẫu blank: nước cất thay cho đường D-glucose Làm tương tự mẫu thí nghiệm từ bước 2-4 Phương trình đường chuẩn: y = 0.7941x - 0.0447, R2 = 0.9982 Quy trình 1 Cho 100 pL miu da pha loang ở nồng độ phù hợp vào Eppendorf 1.5ml
2 Bổ sung thêm 200 wL DNS, mix đều Phản ứng màu 6 100°C
trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá
Trang 26X: số mg/ml đường khử Y: giá trị đo OD 540nm B: giá trị của đường chuẩn E: số lần pha lỗng, A: hệ số của phương trình đường chuẩn 2.4.4 Phương pháp xác định pH
pH của mơi trường hoặc các mẫu thí nghiệm được phân tích bằng điện cực đo pH sử dụng thiết bị đo pH đề bàn pH trong quá trình lên men được theo dõi
bằng điện cực trên thiết bị lên men
Thử máy pH: Lấy điện cực cắm vào nước máy dé kiểm tra Nước máy
thường pH khoảng 7
Do pH: Điện cực sau khi được kiểm tra sẽ được lau nhẹ bằng giấy sau đĩ tiếp tục đo mẫu Sau khi cĩ kết quả thì điện cực sẽ rửa qua bằng nước Deion và cắm vào ống
2.4.5 Xác định nồng độ chất tan Brix
Nơng độ chất tan Brix của mẫu dịch lên men được phân tích bằng thiết bị
phân tích nồng độ Bx điện tử
Thử máy trước khi đo mẫu: nhỏ một giọt nước RO vào máy và kiểm tra
Nếu kết quả là 0,00% thì máy khơng bị sai số trong quá trình đo mẫu
Đo mẫu: Hút 40ul dịch mẫu vào máy và đo
Làm sạch: Sau khi cĩ kết quả thì lau sạch chỗ đo bằng giấy và nhỏ một giọt
nước RO và lau lại Sau đĩ tiếp tục đem đi đo mẫu mới 2.4.6 Nồng độ protein
Nguyên
hương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác
định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolframate (thuốc thử
Folin-Ciocalteu) với phức đồng-protein
Chuẩn bị hĩa chất:
Trang 27
Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học X: số mg/ml đường khử Y: giá trị đo OD 540nm B: giá trị của đường chuẩn E: số lần pha lỗng, A: hệ số của phương trình đường chuẩn 2.4.4 Phương pháp xác định pH
pH của mơi trường hoặc các mẫu thí nghiệm được phân tích bằng điện cực đo pH sử dụng thiết bị đo pH đề bàn pH trong quá trình lên men được theo dõi
bằng điện cực trên thiết bị lên men
Thử máy pH: Lấy điện cực cắm vào nước máy dé kiểm tra Nước máy
thường pH khoảng 7
Do pH: Điện cực sau khi được kiểm tra sẽ được lau nhẹ bằng giấy sau đĩ tiếp tục đo mẫu Sau khi cĩ kết quả thì điện cực sẽ rửa qua bằng nước Deion và cắm vào ống
2.4.5 Xác định nồng độ chất tan Brix
Nơng độ chất tan Brix của mẫu dịch lên men được phân tích bằng thiết bị
phân tích nồng độ Bx điện tử
Thử máy trước khi đo mẫu: nhỏ một giọt nước RO vào máy và kiểm tra
Nếu kết quả là 0,00% thì máy khơng bị sai số trong quá trình đo mẫu
Đo mẫu: Hút 40ul dịch mẫu vào máy và đo
Làm sạch: Sau khi cĩ kết quả thì lau sạch chỗ đo bằng giấy và nhỏ một giọt
nước RO và lau lại Sau đĩ tiếp tục đem đi đo mẫu mới 2.4.6 Nồng độ protein
Nguyên
hương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác
định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolframate (thuốc thử
Folin-Ciocalteu) với phức đồng-protein
Chuẩn bị hĩa chất:
Trang 28
Dung dịch A: cân 10g NaCO; pha trong 500ml NaOH 0.1N
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO¿.5H;O pha trong 100ml Postassium tartrate
1%
Dung dịch C: trộn A với B theo tỉ lệ 50:1
Thuốc thử Folin-ciocalteu: pha lỗng với nước cắt theo tỉ lệ 1:1 Bảng 2 3 Bảng xây dựng đường chuẩn protein
BSA (ug/ml) 0 | 50 | 100 | 200 | 300 | 500 Stock BSA 10mg/ml (11) o | 5 | 10 | 20 | 30 | 50
Nuc cat (11) 1000 | 995 | 990 | 980 | 970 | 950
- Pha stock BSA với nước cất để được các nồng độ BSA như bảng trên
- Cho 0.4 ml BSA + 2 ml thuốc thử C
- Trộn đều và giữ nguyên dung dịch trong 10 phút
~ Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin- ciocalteu
~ Trộn đều và giữ nguyên trong 30 phút
- Do d6 hap phụ quang ở bước sĩng 2.=660nm
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ BSA và giá trị OD
660nm được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel
Trang 29Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
Hut 0.4 ml mẫu vào ống nghiệm cho tiếp 2 ml dung dịch C, lắc đều,
giữ nguyên trong 10 phút
“Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều, giữ nguyên trong 30
phút
~_Ðo độ hấp phụ quang ở bước sĩng À =660 nm
Mau Blank: thay 0.4 ml mẫu ở bước 1 bằng 0.4 ml nước cất, rồi làm
tương tự như các bước trên
Cơng thức tính: Protein (mg/ml) = [(OD - b)*D]/a
Trong đĩ: D: độ pha lỗng của mẫu
a,b: hệ số của đường chuẩn y= a.x + b
2.4.7 Phương pháp lên men
Lên men trên bình tam giác:
Lên men bình tam giác 100ml
Nam chủng được đem đi cấy vào đĩa PDA và nuơi tinh ở tủ 50°C trong 4
ngày để làm đĩa giống
Binh tam giác 100 ml đã bịt đầu bằng nắp cao su và giấy bạc đem đi hấp
thanh trùng ở 121°C trong 15 phút
Cân vào bình 50g dịch hèm sắn Đem hắp cách thủy 118°C trong 20 phút
tính từ lúc nước đã sơi
Cấy khoanh trịn Iem hệ sợi lấy từ các đĩa giống chuẩn bị sẵn vào bình
mơi trường, Cây 5 bình tam giác, mỗi bình 1 chủng nắm Đem nuơi lắc ở tủ
45°C trong 4 ngày
Thu mẫu: Mỗi ngày lấy 500 l dịch nuơi đề phân tích Bx, pH, DNS theo
Trang 30- Chuan bj dich bao tir cap gidng:
Năm chủng được đem đi cấy vào đĩa PDA va muơi tĩnh ở tủ 50°C trong 4 ngày Thu 4ml Tween 80 0,1% trên đĩa patri, dung que chang cảo bảo tử trên đĩa thạch
Lọc qua vải màn đặt trên phễu đã thanh trùng, thu vào ống falcon 50ml
Đếm mật độ bào tử dịch cấp giống và tính tốn nồng độ cấp giống Bảng 2 4 Thể tích cấp giống của 5 chủng + Thể tích cấp Tên chủng Mật độ gốc (BT/ml) oe giong
Rhizomucor miehei FCH 116.3 4.4 x 108 23ul Rhizopus microsporus LPH 084 4.6 x 10° 22ul Rhizopus microsporus LPH 156 3.1.x 108 32ul Myceliophthora thermophile ee 4.65 x 10 22ul FCH 112.2 Rasamsonia emersonii LPAT 5.98 x 108 1ul 234 - Chuan ¡ lên men: Bình tam giác 250ml đã bịt đầu bằng nắp cao su và giấy bạc đem đi hấp thanh trùng ở 121°C trong 15 phút Cân vào bình 100g dich hèm sắn Dem hấp cách thủy 1 18°C trong 20 phút tính từ lúc nước đã sơi
Cấy 5 bình tam giác, mỗi bình 1 chủng nắm theo thể tích đã tính tốn được
tùy mỗi chủng Đem nuơi lắc ở tủ 45°C trong 4 ngày
Trang 31
Trường Đại học Mớ Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
Thu mẫu: Mỗi ngày lấy 10ml dịch nuơi đề phân tích Bx, pH, DNS theo thời gian Sau 4 ngày thu lấy sinh khối bằng bộ lọc và xác định lượng sinh khối
khơ
Lên men trên thiết bị lên men:
Chủng được nuơi hoạt hĩa trên bình tam giác trước khi cấp vào mơi trường
lên men (500 — 1000 ml) trong thiết bị lên men Quá trình lên men được tiền
hành ở 45°C khuấy trộn 100-200rpm (đối với thí nghiệm khuấy trộn sục khí),
sục khí, trong thời gian 4-7 ngày Mẫu được thu 10ml tại các thời điểm nghiên
cứu (0-4/7 ngày) và bảo quản lạnh -20°C cho tới khi phân tích
“Thiết bị lên men sục khí khuấy trộn: Jupiter Solaris 2L (Solaris Biotechnology,
Italy) Thiết bị lên men hai vỏ gia nhiệt và làm lạnh bằng dung mơi nước, thể
tích lên men: 2l (0+1.6 bar), hệ cánh khuấy hai tầng dạng turbine cánh thang
Các điện
điều khiển LEONARDO Các thơng số điều khiển tự động bao gồi
khuấy trộn (0+2000rpm), pH, nhiệt độ, dO (oxy hịa tan), dCO2 Cho phép theo ue sensor Hamiliton Điều khiền quá trình tự động sử dụng quy trình
: sục khí,
doi va điều khiển thiết bị online từ xa Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động: Hệ
thống bao gồm ba phần chính:() Cabinet điều khiển và máy tính hiển thị; (ii) thiết bị lên men và (iii) Thiết bị phụ trợ; máy nén khí và máy làm lạnh Nguyên tắc hoạt động: cabinet nhận tín hiệu vào từ các cảm biến trên thiết bị lên men sau đĩ xử lý tín hiệu và truyền tải lệnh Tất cả các tín hiệu và thơng số được điều khiển qua máy tính kết nối với hộp điều khiển
Hệ thống lên men sục khí tự thiết kế tại phịng thí nghiệm: sử dụng hệ thống thiết bị lên men và hệ thống điều khiển của hệ thống lên men sục khí khuấy trộn Trong đĩ, mặt nắp thiết bị lên men đã được phịng thí nghiệm thiết kế lại và thay bằng hệ thống trụ rỗng lõi bên trong Hệ thống lên men sục khí sử dụng cấp khí để tạo dịng chảy trong mơi trường lên men
Trang 33
Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
PHAN 3: KET QUA
3.1 So sánh sinh khối tế bào của 5 chủng nắm sợi trong mơi trường hèm sắn lỏng
Năm chủng nắm sợi được lên men bình tam giác 100ml và bình tam giác
250ml trong dịch hèm sắn lỏng dé so sánh sinh khối tế bào Bình tam giác 100ml được lấy mẫu từ ngày 1 đến ngày 4 với thê tích mẫu là 5001 Dưới đây
là hình ảnh chụp các bình lên men ở các mĩc thời gian khác nhau:
Trang 34
Kết quả quan sát hình thái các chủng trên mơi trường hèm sẵn lỏng cho thấy: Các chủng đều mọc tốt trong điều kiện nuơi cấy và phát triển nhanh nhất
trong ngày thứ 2 và thứ 3 Chủng FCH 112.2 cĩ hiện tương đổi màu sau ngày
thứ nhất Chủng LPHT 234 tạo hạt sau 2 ngày nuơi Hiện tượng này cĩ lặp lại
khi tiếp tục lên men trên bình tam giác 250ml
Các bình lên men được lấy mẫu theo ngày và đem xác định nồng độ đường khử, nồng độ chất tan và pH mỗi ngày Sau 4 ngày lên men, sinh khối
sẽ được tách bằng vải lọc sau đĩ xác định sinh khối khơ
Trang 36—#—FCHI163 —#—LPH084 - —#—LPHISỐ XCFCHII22 —X—LPHT234 $0 — ———————— S—FCHI122 =LPHT234 8 sị š 450 „ 2 4.00 23 2 350 = 3.00 Z 2.50 4 2.00 ” 4 n 96 4 48 72 96 Thời gian (h) Thời gian (h) (A) (B) ®—FCHII63 HR LPHOS4 ae LPHIS6 2 Sinh khơi khơ 3 TỸCFCHII22 _=*CLPHT234 š xã LPHT234 —— a FH 12 Bs 3 LPH156 BS 3 Ps 35 HS 3 0 2 4 6 8 4 48 72 96 el “Thời gian (h) (© (D)
Hình 3 1 Lén men binh tam gidc 100mL
A Nơng độ đường khử theo thời gian, B pH theo thời gian, C Nồng độ chất tan Brix theo thời gian, D Sinh khối khơ
Từ đồ thị cho thấy nồng độ đường khử giảm theo thời gian Chủng LPHT
234 tăng đột ngột vào ngày thứ 2, FCH 116.3 tăng vào ngày thứ 3 Các chủng
cịn lại giảm dần theo thời gian Nồng độ đường khử cao nhất là 5.07 của FCH 112.2 ở ngày thứ nhất, nồng độ thấp nhất là 2.33 của LPH 156 ở ngày thứ 4
Đồ thị pH cho thấy xu hướng tăng lên của các chủng FCH 112.2 tăng
cao hơn các chủng khác vào ngày thứ 3 và thứ 4 và cĩ pH cao nhất là 6.58 vào
ngày thứ 4 Độ pH thấp nhất là 3.93 của chủng LPHT 234 ở ngày thứ 1
Trang 37
Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Cơng nghệ Sinh học
Nồng độ chất tan cho thấy xu hướng giảm dần của các chủng Nồng độ thấp nhất là 3.1 của LPH 156 ở ngày thứ 4 và cao nhất là 5.1 của chủng LPHT
vào ngày thứ I
Sinh khối khơ thu được từ chủng FCH 112.2 là cao nhất với số lượng là
6.92g/1, chủng LPH 156 cĩ sinh khối khơ ít nhất là 4.62g/1
Sau đĩ năm chủng lên men bằng bình tam giác 250ml với dịch hèm sắn
lỏng Các bình được chụp theo thời gian đề so sánh sinh khối
Trang 3872 96 Kết quả quan sát hình thái các chủng trên mơi trường hèm sắn lỏng cho thấy:
Các chủng đều mọc tốt trong điều kiện nuơi cấy và phát triển nhanh nhất
trong ngày thứ 2 và thứ 3 Chủng FCH 112.2 cĩ hiện tương đổi màu sau ngày thứ nhất Chủng LPHT 234 tạo hạt sau 1 ngày nuơi Hiện tượng này cĩ lặp lại
khi tiếp tục lên men trên bình tam giác 250ml so với bình tam giác 100ml
Các bình lên men được lấy mẫu theo thời gian, mỗi lần lấy 10ml để xác định nồng độ đường khử, độ pH, nồng độ chất tan Sau khi kết thúc lên men, sinh khối được tách bằng vải lọc và đem đi xác định sinh khĩi khơ
Trang 40
Bảng 3 10 Nơng độ chất tan 5 chủng lên men bình tam giác 250ml Giờ 8 12 24 48 72 9% Ching Rhizomucor miehei FCH116.3 52 51 49 46 43 3.9 Rhizopus microsporus LPH084 5] 5 47 42 38 33 Rhizopus microsporwsLPHIS6 5] 5 47 43 39 32 Myceliophthora thermophile S151 49 44 3.7 34 FCH 112.2 Rasamsonia emersonii LHHT 51 5l 48 45 39 33 234 ĐC 5
Bảng 3 11 Sinh khối khơ thu được sau sấy bình lên men 250ml
Rhizomucor| Rhizopus | Rhizopus | Myceliophthora | Rasamsonia
miehei | microsporus | microsporus | thermophile | emersonii | ĐC FCH 116.3 | LPH084 | LPH 156 | FCHII22 | LPHT234 0.319 0.236 0.192 0.416 0.238 0 Bảng 3 12 Sinh khĩi khơ của 5 chủng lên men bình tam gide 250ml
Rhizomucor | Rhizopus | Rhizopus | Myceliophthora | Rasamsonia
miehei | microsporus | microsporus | thermophile | emersonii | ĐC FCH 116.3 | LPH 084 | LPH 156 | FCHII22 | LPHT234
(g/L) | 7.975 5.9 48 10.4 5.95 0