Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình nuôi cấy cây dứa Md2 (Ananas comosus) in vitro

ĐẠI HOC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CỒNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN KHỐNG VÀ CHẤT ĐIỀU HỊA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT ĐÉN Q TRÌNH NI CẤY CÂY DỨA MD2 (Ananas comosus) IN VITRO Sinh viên thực : Trần Thanh Thúy Kiều MSSV : 1711546517 Giảng viên hướng dẫn : ThS Mai Thị Phương Hoa ThS ĐỒ Tiến Vinh TP HCM, 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC .ii TÓM TẮT iv SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIẾU vii DANH MỤC CHƯ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix Tính cấp thiết đề tài ix Mục tiêu đề tài X CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây dứa MD2 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Đặc diêm thực vật 1.1.3 Giá trị dược liệu giá trị kinh tế 1.2 Tình hình phát triến nước 1.2.1 Tình hình phát triển giới 1.2.2 Tình hình phát triển Việt Nam 1.3 Phương pháp nhân giống dứa MD2 1.3.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 1.3.2 Phương pháp nhân giống công nghệ sinh học 1.3.3 Các yeu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô 1.4 Các cơng trình nghiên cứu ngồi nước 11 1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu nước 11 1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Nơi thực .14 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 14 ii 2.4 Sơ đồ tổng quan 14 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống đến sinh trưởng phát triển cùa dứa MD2 in vitro 15 2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo chồi dứa MD2 in vitro 15 2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng auxin đến trình hình thành rễ dứa MD2 in vitro 15 2.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 16 2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu 16 2.5.2 Xử lý số liệu 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Ket thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường khống đến sinh trưởng phát triến dứa MD2 ỉn vitro 17 3.2 Ket thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng cùa BA, kinetin đến khả tạo chồi dứa MD2 in vitro 19 3.3 Kết thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng auxin đến trình hình thành rề dứa MD2 22 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25 Kết luận 25 Đe nghị 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 PHỤ LỤC 28 iii TÓM TẤT Đe tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khoáng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến trình ni cấy dứa MD2 (Ananas contosus) in vitro” Được thực Phịng thí nghiệm Ni cấy mơ thực vật trường Đại học Nguyền Tất Thành, Tp.Hồ Chí Minh thời gian từ tháng 06/2020 - 09/2020 với mục tiêu xác định ảnh hưởng thành phần khoáng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến trình ni cấy dứa MD2 (Ananas comosus) in vitro Các thí nghiệm bố trí cách ngẫu nhiên CRD Đe tài gồm nội dung khảo sát sau: - Khảo sát thành phần mơi trường khống thích họp cho sinh trưởng phát trien dứa MD2 in vitro - Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tạo chồi dứa MD2 in vitro - Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng auxin đến trình hình thành rễ dứa MD2 in vitro Ket đạt được: - Mơi trường MS thích họp cho sinh trưởng phát triển dứa MD2 in vitro với chiều cao 4,67 cm; số 3,43 lá/mầu; số rễ 4,43 rễ/mẫu - Mơi trường thích họp đe tạo chồi dứa MD2 in vitro' MS bo sung BA nồng độ mg/1, đường 30 g/1 agar g/1 - Mơi trường thích họp để hình thành rễ dứa MD2 in vitro' MS bô sung IAA nồng độ mg/1, đường 30 g/1 agar g/1 IV SUMMARY Subject: "Research on the effect of composition and quality of adult organisms in the process of culturing the model MD2 Pineapple (Ananas comosus) in vitro" Conducted at Nguyen Tat Thanh University model culture laboratory, Ho Chi Minh City was implemented from June 2020 to September 2020 with target orientation image of ingredients and maturation regulators, performed the process of culturing MD2 pineapple plant (Ananas comosus) in vitro The experiments were aranged randomly with CRDThe topic includes the following references: MS growth media is the most suitable for growth and development MD2 Pineapple Suitable medium for bud formation of MD2 Pineapple: MS supplemented with BA mg/1, sugar 30 g/1 and agar g/1 Suitable medium for root formation of MD2 Pineapple: MS supplemented with IAA mg/1, sugar 30 g/1 and agar g/1 V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH • Hình 1.1 Cây dứa MD2 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan nội dung thực 14 Hình 3.1 Ket khảo sát mơi trường khống 18 Hình 3.2 Chồi dứa MD2 sau 30 ngày nuôi cấy MT MS bố sung 21 Hình 3.3 Rễ thân dứa MD2 sau 30 ngày nuôi cấy MT MS bổ sung .24 vi DANH MỤC BẢNG BIẾU Bảng 3.1 Ket khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường khống 17 Bảng 3.2 Ket khảo sát nồng độ kinetin, BA đến sinh trưởng, phát triển chồi dứa MD2 in vitro 19 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng auxin đến trình hình thành rễ dứa MD2 22 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT NT Nghiệm thức MT Môi trường BA Benzyl adenyl MS Môi trường Murashige & Skoog - 1926 WPM Woody Plant Medium NAA a - Naphtyl axetic axit SAS Statistical Analysis Systems CRD Complete Randomized IAA p-indol-acetic acid IBA indol-3-acetic acid NAA a - Naphthaleneacetic acid 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid Vlll ĐẶT VẤN ĐÈ Tính cấp thiết đề tài Dứa MD2 lai tạo Hawaii (Mỹ) từ năm 1961, thuộc nhóm dứa Cayenne Nó sản phàm lai có chọn lọc dứa Queen dứa Cayenne, mang hầu hết ưu điểm nối trội hai giống bố mẹ ngọt, giòn thơm (như dứa Queen), trái to hốc mắt cạn, hàm lượng bromeline thấp (như dứa Cayenne) giống ăn tươi ưa chuộng giới giá trị dinh dưỡng dứa nguồn cung cấp mangan dồi dào, hàm lượng vitamin Bl; vitamin C; chất xơ loại vitamin khống cao nên dứa khơng tăng sức để kháng mà giúp thể kháng viêm bảo vệ thận, gan Tại Việt Nam, dứa MD2 Viện Nghiên cứu Rau nhập nội để tuyển chọn từ năm 2006 Đen giống dứa đà nhiều nơi miền Bắc, miền Nam trồng tỉnh Hậu Giang, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Tây Ninh, quy mơ trồng vần cịn bị hạn chế Là giống dứa dễ trồng, dễ chăm sóc, thích hợp với khí hậu tho nhưỡng Việt Nam, quan tâm phát triển nhiều ưu điếm vượt trội giống dứa truyền thống Điều đà góp phần làm cho nhu cầu phát triển diện tích trồng loài ngày tăng cao Tuy nhiên giống trồng hạn chế Việt Nam nhân giống khó chậm, nguồn cung chưa on định, chất lượng giống chưa đảm bảo Quá trình nhân giong phức tạp, chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nội sinh ngoại sinh Do đó, việc nghiên cứu phương pháp nhân giống loài cần thiết Trong giai đoạn nay, việc nhân nhanh giống cần thiết, giống khó nhân nhanh, dề bị lần tạp, giống dề nhiễm bệnh virus cần lượng lớn giống chất lượng Nhân giống phương pháp nuôi cấy mô xem phương pháp hữu ích đế tăng số lượng giống, chất lượng đảm bảo, đồng đều, bệnh, giá thành thấp, sè góp phần giảm chi phí sản xuất, nâng cao suất trồng Đe q trình ni cấy diễn thuận lợi vai trị yếu tố tham gia điều khiển trình chồi tạo rề dứa MD2 chất điều hòa sinh trưởng, thành phần đa lượng, vi lượng môi trường nuôi cấy cần nghiên cứu làm rõ Nhằm xác định ảnh IX hưởng cùa chất điều hòa sinh trưởng yếu tố đa lượng vi lượng đến trình tạo chồi tạo rễ dứa MD2 in vitro Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần khống chất điều hịa sinh trưởng thực vật đến q trình ni cấy dứa MD2 (Ananas contosus) in vitro” Mục tiêu đề tài Xác định thành phần khống chất điều hịa sinh trưởng thích hợp để nhân giông dứa MD2 (Ananas comosus) in vitro X Chương 3: Kết thảo luận thu thí nghiệm này, dứa Thơm Son mơi trường thích hợp để nhân chồi MS bổng sung BA nồng độ mg/1, mơi trường thích hợp để nhân chồi MS bổ sung BA nồng độ 0,5 mg/1 Hình 3.2 Chồi dứa MD2 sau 30 ngày nuôi cấy MT MS bổ sung BA kinetin Mầu cấy ban đầu (A); kinetin 0,5 mg/1 (B); BA mg/1 (C); BA mg/1 sau 60 ngày (D) 21 Chương 3: Kết thảo luận 3.3 Kết thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng ciia hàm lượng auxin đến trình hình thành rễ ciia dứa MD2 Auxin chất điều hòa sinh trưởng có nhiều vai trị khác sinh trưởng phát triển thực vật Auxin kích thích tế bào kéo dài tăng trưởng, kích thích phân chia tế bào cách đặc biệt trình hình thành callus hình thành rề bất định Ngồi auxin hoạt hố phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho tạo mạch dần rễ, tăng trưởng quả, tạo không hạt, kích thích sinh trưởng ống phấn Các chất điều hòa sinh trưỏng thường sử dụng là: IAA, IBA, NAA với nồng độ: 0,25; 0,5 mg/1 Dưới bảng khảo sát nong độ auxin đến trình hình thành rễ dứa MD2 in vitro Bảng 3.3 Ket khảo sát ảnh hưỏng hàm lượng auxin đến trình hình thành rề Dứa MD2 NT IAA (mg/1) NAA (mg/1) Chỉ tiêu khảo sát IBA (mg/1) Chiều cao (cm) Số (lá) Số rễ (rễ) 1.1 0,25 - - 4,50de 5,06d 3,32b 1.2 0,5 - - 4,90c 5,51c 3,40b 1.3 - - 5,57a 6,50a 4,50a 1.4 - 0,25 - 4,57d 5,83d 2,16c 1.5 - 0,5 - 4,97c 5,23c 1,83d 1.6 - - 5,20b 4,83b l,66ed 1.7 - - 0,25 4,36e 3,83h l,17f 1.8 - - 0,5 4,38e 4,11® l,43e - 4,52de 5,58f l,55e 1.9 Các ký tự theo sau giá trị trung bình cột thê khác biệt nghiệm thức với mức ý nghĩa p í0,01 bang trắc nghiệm phân hạng LSD 22 Chương 3: Kết thảo luận Các thông số bảng 3.3 cho thấy nghiệm thức có bổ sung IAA nồng độ mg/1 thu chiều cao (5,57 cm), số rễ (4,50 rề/mẫu), số (6,50 lá/mầu) có khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức ni cấy cịn lại Ket nghiên cứu cho thấy, tất cơng thức kích thích tạo rễ sau 30 ngày nuôi cấy nghiệm thức bổ sung IBA 0,25; 0,5 mg/1, không phát triển nhiều mặt chiều cao, chậm lớn, thấp, nhiên số phát sinh lại nhiều nhỏ, có màu xanh nhạt, tương tự rễ phát triển từ 1- rề/mầu, có khơng rễ Lại xét ở nồng độ IBA mg/1 (NT 1.9) lại phát triển tốt so với hai nồng độ cịn lại, có rễ rễ ngắn nhỏ không cắm sâu vào môi trường nuôi cấy môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng NAA có phát triển tương tự, tốt so với mơi trường có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng IBA, thể rõ qua tiêu khảo sát bảng 3.3 Hầu hết công thức môi trường kích thích tạo rễ, cao vần NT 1.3 (4,50 rề/mầu), chênh lệch số rễ giừa NT 1.3 với NT lại từ 1,3 đến 3,8 lần mơi trường ni cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IAA cho thấy sinh trưởng phát triển cùa Dứa tốt so với IBA NAA Tuy nhiên chiều cao tất nghiệm thức khơng có khác biệt mặt thống kê, điều chứng auxin gần khơng ảnh hưởng đến tăng chiều cao cây, thân vần to chắc, số NT chứa IAA có màu xanh đậm, phiến to dày NT lại, số nhiều 6,50 (NT 1.3) số thấp 5,06 (NT 1.1), chênh lệch so nghiệm thức 1,2 lần Vậy cơng thức thích họp đề kích thích hình thành rễ dứa MD2 là: MS bo sung IAA nồng độ mg/1, đường sucrose 30 g/1 agar g/1 Các kết có trùng trùng họp với với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Điệp cộng (2014) thí nghiệm tạo trực tiếp từ chồi bên dứa mà không qua tạo mô sẹo hai giống dứa kiểng Thơm Son (Ananas bracteatus) Long Phụng (Ananas cotnosusỴ Ket thu thí nghiệm này, dứa Thơm Son, mơi trường thích họp để tạo rễ mơi trường MS có bổ sung NAA mg/1 Đối với dứa Long Phụng, mơi trường thích hợp để tạo rề mơi trường MS có bơ sung NAA mg/1 Sở dĩ có khác biệt nguồn vật liệu cấy ban đầu thí nghiệm khác nên thu kết khác 23 Chương 3: Kết thảo luận Hình 3.3 Rễ thân dứa MD2 nuôi cấy MT MS bổ sung IAA IBA NAA IB A mg/1 (Ai A2); NAA 0,25 mg/1 (B1B2); IAA mg/1 (C,C2) 24 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ Ket luận Đe tài đáp ứng mục tiêu việc xác định thành phần khoáng chất điều hịa sinh trưởng thích hợp để nhân giống dứa MD2 (Ananas comosus) in vitro - Môi trường khống thích hợp đế ni cấy dứa MD2 in vitro môi trường MS - Môi trường thích hợp để tạo chồi dứa MD2 in vitro : Môi trường MS bổ sung BA nồng độ mg/1, đường 30 g/1 agar g/1 - Mơi trường thích hợp để tạo rề dứa MD2 in vitro là: Môi trường MS bổ sung IAA nồng độ mg/1, đường 30 g/1 agar g/1 Đe nghị Từ kết nghiên cứu đạt đưa số kiến nghị sau đây: Tiếp tục nghiên cứu hồn chỉnh hình thành rễ dứa MD2 in vitro chuyển vườn đế hồn thiện quy trình nhân giống dứa MD2 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO Vân Lam Kỳ thuật chăm sóc dứa MD Sở Khoa Học Và Nông Nghiệp Thành Phổ Hồ Chỉ Minh 2019 Lê Thị Khánh, Hồng Phạm Lê Giáo trình Cây ăn 2016 Vũ Kim Dung, Phan Thị Hòa, Nhung Nguyễn Thị Hồng Nghiên cứu sản xuất nước ép dứa (Ananas comosus) - Bí đao (Benincasa hispida) đóng chai Khoa học Kỹ thuật Công nghệ 2020;59-64 Bác Sĩ Hồng Xn Đại Cơng dụng tuyết vời dứa Diễn đàn dân trí Việt Nam 2014 Theo Vụ Thị trường châu Âu Xuất khâu dứa tưoi vào châu Âu Trung tâm xúc tiến Thương mại Đầu tư An Giang 2018 Trung tâm Khuyến nông Lâm Đồng Triển vọng phát trien giống dứa MD2 Lâm Đồng Cục Kinh Tê Và Phát Triền Nông Thôn 2019 Hoàng Thị Kim Hoa Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỳ thuật nhân giống Dứa in vitro giai đoạn vườm ưom 2000 Nguyễn Thị Điệp Nghiên cứu quy trình nhân giong in vitro hai giống dứa kiểng Thơm Son (Annas Bracteatus) Long Phụng (Ananas comosus) Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM 2014 Wakasa Kyo, Koga Yoshiaki, Kudo Masaaki Differentiation from in vitro culture of Ananas comosus Japanese Journal of Breeding 1978;28(2): 113-121 10 SJ Taussig J Szekerczes, Batkin s Inhibition of tumour growth in vitro by bromelain, an extract of the pineapple plant (Ananas comosus) 1985;538-539 11 Escalona M, Lorenzo JC, Gonzalez B, al et Pineapple (Ananas comosus L Merr) micropropagation in temporary immersion systems 1999 12 Soneji Jaya R, Rao PS, Mhatre Minal Journal of Plant Biochemistry, Biotechnology In vitro Regeneration from Leaf Explants of Pineapple (Ananas comosus L, Merr) 2002; 11 (2): 117-119 13 Macedo Cristiane Elizabeth Costa de, Silva Marcela Gomes da, Nóbrega Fabiana Silva da, Martins Camila Pimentel, Barroso Paulo Augusto Vianna, Alloufa Magdy Ahmed Ibrahim The effect of ANA and BAP concentrations on the micropropagation and hydroponic cultures of pineapple Revista Brasileira de Fruticultura 2003;25(3):501-504 14 Amin MN, Rahman MM, Rahman KW, Ahmed R, Hossain MS, Ahmed MB International journal of botany Large scale plant regeneration in vitro from leafderived callus cultures of pineapple (Ananas comosus L Merr cv Giant Kew) 2005;l(2):128-132 15 Be L.v, PC Debergh Tiềm vi nhân giá rẻ Dứa Tạp Thực vật học Nam Phi 2006;\9ì -194 26 16 Abdelhamid M Hamad, Taha Rosna Mat Effect of sequential subcultures on in vitro proliferation capacity and shoot formations pattern of pineapple {Ananas comosus L Merr) over different incubation periods 2008;329-334 17 Al-Saif Adel M, Hossain ABM Sharif, Taha Rosna Mat African Journal of Biotechnology Effects of benzylaminopurine and naphthalene acetic acid on proliferation and shoot growth of pineapple {Ananas comosus L Merr) in vitro 2011;10(27):5291-5295? 27 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Mơi trường khống MS: NH4NO3 1,65 g/1 KNO3 1,9 g/1 MgSO4.7H20 0,37 g/1 KH2PO4 0,17 g/1 CaCl2 0,33 g/1 Mơi trường khống LV: NH4NO3 1,65 g/1 KNO3 1,9 g/1 MgSO4.7H20 1,85 g/1 KH2PO4 0,34 g/1 CaCI2.2H2O 0,22 g/1 MgO InoSiton g/1 Môi trường B5 KNO3 2,5 g/1 CaCl2.2H2O 0,15 g/1 MgSO4.7H2O 0,25 g/1 (NH4)2SO4 0,134 g/1 NaHPO4.H2O 0,15 g/11 Môi trường WPM NH4NO3 0,4 g/1 K2SO4 0,99 g/1 Ca(NO3)2.4H2O 0,556 g/1 MgSO4.7H2O 0,37 g/1 CaCỈ2 0,0725 g/1 KH2PO4 0,17 g/1 28 Phụ lục 2: Thi nghiêm l,than The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels T Values VI V2 V3 V4 Number of Observations Read Number of Observations Used 12 12 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 69.88 F 1.96529167 0.65509722 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.009375 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.2653 69.88 F 44.08 0.01 0.011958 3.35539 0.2996 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N T A 5.43333 V4 B B B 4.97333 V3 4.74333 V2 c 4.58677 VI 30 Pr > F F F 7.48091667 1.06870238 57.82 F Model 9.48742917 1.35534702 46.28 F 9.48742917 1.35534702 46.28 F Model 5.20376250 0.74339464 77.74 F 5.20376250 0.74339464 77.74