Nghiên cứu nuôi cấy tế bào mô sẹo cây mật nhân (eurycoma longifolia)

NGHIÊN CÚL NUÔI CẤY TÉ BÀO MÔ SẸO CÂY MẬT NHÂN (Eurycoma longifolid) NGUYỄN THỊ 'TÉN NHI Khóa luận đệ trinh đẻ đáp ứng yéu cầu cấp Kỹ sư ngành Cóng nghệ Sinh học Giảng viên hướng dần: ThS ĐỎ TIẾN VINH ThS NGUYỀN TRUNG HẬU TRƯÒNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH TRUNG TẰM THÕNG TIN-THƯVIỆN L\JOOI E>9b / Tp.HỒ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Trên thực tê khơng cỏ cóng náo má không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiép hay gián tiếp cua người khác Trong suốt thời gian từ băt đâu học tập giảng dường đại học đến em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý Thầy Có, gia đinh bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gih đến quý Thầy, Cô khoa Nông nghiệp Công nghệ cao Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành với tri thức tâm huyết đế truyền dại •• :n kiến thức q báu cho chúng em suốt thời gian học tập trường Và em xin gửi lời cảm ơn chăn đến Thầy ThS Đồ Tiến Vinh, ThS Nguyễn Trung Hậu, người tận tinh hướng dẫn giúp đỡ cho em suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sac đen ba mẹ, anh chị người nuôi dưỡng, yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt cho thực ước mơ Cảm ơn tất anh/chị bạn, phịng thí nghiệm Cịng nghệ Sinh học Thực vật cùa Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hố Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tơi nhũng lúc khó khăn thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chi Minh, tháng 08 năm 2017 NGUYỄN THỊ YẾN NHI ii TĨM TẮT Đẻ tài “Nghiên cún ni cấy tế bão mó sẹo Mật Nhân (Eurycoma longifolia) ” thực phịng thí nghiệm Cóng nghệ Sinh học Thực vật Trường Đại học Cóng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, địa ch: Nguyễn Văn Bảo phường 4, quận Gị Vấp, Tp Hồ Chí Minh Đề tài thực tù tháng 2017 đến tháng 7/2017 với mục tiêu xác định thành phần chất điều hòa sinh '.rương chất bổ trợ đến khả tạo mô sẹo nhân sinh khối mô sẹo cầy Mật Nhản {Eurycoma longifolia) Thí nghiệm bơ trí theo kiểu hồn toàn ngầu nhiên Nội dung thực gồm: - Khảo sát ảnh hưởng nong độ :r e1 \ thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Mật Nhân - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến kha tạo mô sẹo cùa Mật Nhân - Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2.4-D đẻn khã tạo mô sẹo Mật Nhân - Khảo sát ảnh hường nồng độ NAA kết hợp BA đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân - Khảo sát ảnh hưởng chất bổ trợ đen trình tăng sinh khối mô sẹo Mật Nhân Kết đạt được: - Thời gian 25 phút, nồng độ javel 50%, thích hợp đe tạo mầu cấy Mật Nhân - Nồng độ NAA thích hợp để tạo mơ sẹo Mật Nhàn mg/1 - Nồng độ NAA mg/1 kết hợp với nồng độ BA ỉmg thích hợp để tăng sinh khối tế bào mơ sẹo Mật Nhân - Nồng độ vitamin B1 10 mg/1 thích họp đế tăng sinh khối tế bào mô sẹo Mật Nhân iii MỤC LỤC Trang TRANG TỰA i LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH BÀNG ix MỎ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung thực Chng 1: TƠNG QUAN 1.1 Cây Mặt Nhân 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Phân bố sinh học 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Đặc điểm hình thái 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Công dụng 1.4 Các nghiên cứu nước 1.4.1 Các nghiên cứu nước 1.4.2 Các nghiên cứu nước 1.5 Nuôi cấy mô sẹo 10 1.5.1 Mô sẹo 10 1.5.2 Cảm ứng tạo mò sẹo 11 1.5.3 Ngun tắc ni mị sẹo 11 1.5.4 Đặc điếm cùa q ưình ni cấy mơ sẹo 13 1.5.5 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy mô sẹo 13 iv 1.5.6 ưng (lụng mó sẹo 14 1.5.7 Quá trình ni cấy mó sẹo 14 1.5.8 Các yếu tố ảnh hưởng đen q trinh ni cấy mơ sẹo 15 ỉ 5.8.1 Mầu cấy - nguyên liệu ban đáu 15 1.5.8.2 Điều kiện nuôi cấy 16 1.5.9 Thành phần mơi trường ni cấy mơ sẹo .17 1.5.9.1 Các chất khoáng 18 1.5.9.2 Các vitamin 23 1.5.9.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực •.Ị: 24 1.5.9.4 Các chất bổ sung vào môi trường câ; mỏ 29 Chuông 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.1 Thời gian, địa điểm vật liệu nghiên cứu 31 2.2 Điều kiện nuôi cay 31 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 31 2.2.2 Điều kiện nuôi cấy 31 2.3 Hóa chất, thiết bị dụng cụ thí nghiệm 31 2.3.1 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 31 2.3.2 Hóa chất 32 2.4 Thiết kế thí nghiệm 32 2.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 33 2.5.1 Sơ đồ nglũên cứu 33 2.5.2 Nội dung nglũên cứu 34 2.5.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hường nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Mật Nhân 34 2.5.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ành hưởng nồng độ NAA đến khả tạo mô sẹo Mật Nhân .34 2.5.2.3 Thí nghiệm 3: Khão sát ảnh hường nồng độ 2,4-D đền khả tạo mô sẹo Mật Nhân 35 2.5.2.4 Thí nghiệm 4: Kháo sát ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp BA đến trình tăng sinh khối mò sẹo cày Mật Nhân 36 V 2.5.2.5 Thí nghiệm 5: Khao sát anh hưởng chất bổ trợ đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân 36 2.6 Phương pháp thu thập -/.ù lý f-,ó liệu 37 2.6.1 Phương pháp thu thập 37 2.6.2 Phương pháp xử lý sổ liệu 37 Chưong 3: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Ket thí nghiệm 1: Khảo sát ãnh hưởng nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Mật Nhãn 38 3.2 Ket thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hướng nồng độ NAA đến khả tạo mô sẹo Mật Nhân 41 3.3 Kết thí nghiệm 3: Khảo sát ánh hướng nồng độ 2,4-D đến khả tạo mô sẹo Mật Nhân 43 3.4 Kết thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA kết hợp BA đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân .45 3.5 Kết thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hường chất bổ trợ đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân 48 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 54 vi DANH SÁCH BẢNG CHỮ VIÉT TẤT BA: - Benzyloadenniopuryna Ctv: Cộng tác vién DNA: Deoxyribo Nucleic Acid ĐC: Đổi chứng ĐHSTTV: Chất điều hịa sính ĩTúcmg thực vật IAA: Indol-3-acetic acid IBA: Indole-3-butỵHc acid MS: Murashige & Skcọg medium, năm 1962 NAA: a - Naphthaleneaoeòc acid RNA: Acid Ribonucleic WPM: Woody Plant Medium 2,4-D: Dicholoro phenoxy acetic acid vu DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình Hình 1.1: Cây Mật Nhân Hình 1.2: Cơng thức hóa học hợp chất quassinoid Hình 1.3: Cơng thức hóa học 3,4-dihydroeur? comalacton, 5,6 dihydroeurycomalacton, 6-hydroxy-5,6-dehydroeurycomalactor„ >hydroxycantin-6-on Hình 1.4: Cơng thức hóa học eurylene •• ĩ teurylene Hình 1.5: Quy trình ni cấy mơ sẹo thực vịt;?? vitro 14 Hình 1.6: cấu trúc phân tử 2,4D(2.4-dichlorophenoxyacetic acid) 26 Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo NAA Alpha-naphthalene acetic acid) 26 Hình 1.8: cấu trúc phân tử BA (Benzylaminopurine) 28 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33 Hình 3.1: Vơ trùng mầu cấy Mật Nhân sừ dụng javel nồng độ khác 40 Hình 3.2: Mơ sẹo hình thành từ mẫu cấy Mật Nhân 43 Hình 3.3: Mơ sẹo hình thành từ mẫu cấy Mật Nhân 45 Hình 3.4: Mơ sẹo tăng sinh mơi trường có NAA lmg/1 BA mg l .47 Hình 3.5: Mơ sẹo Mật Nhân ni cấy mơi trường có bổ sung thêm vitamin B1 10mg/l 49 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần nồng độ khoáng vi lượng 22 Bảng 1.2: Nồng độ tên vitamin thường sư dụng nuôi cấy tế bào thực vật 24 Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng nóng đỊ;a- vá thời gian khử trùng đến khả nâng tạo mẫu cấy Mật Nhân 34 Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA dển tạo mô sẹo Mật Nhân .35 Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2.4-D dẻn tạo mô sẹo Mật Nhân 36 Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng nồng đi: NAA kết hợp BA đến trinh tãng sinh khối mô sẹo Mật Nhân .36 Bảng 2.5: Khảo sát ảnh hưởng chải bỏ trợ đen q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân .37 Bảng 3.1: Kết khảo sát ảnh hường nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy Mật Nhân 39 Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả tạo mô sẹo Mật Nhân 41 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ 2.4-D đến khà tạo mô sẹo Mật Nhân 44 Bảng 3.4: Kết khảo sát ảnh hường nồng độ NAA kết hợp BA đến trình tăng sinh khối mô sẹo Mật Nhân 46 Bảng 3.5: Kết khảo sát ảnh hưởng chất bố trợ đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân 48 ix MỞ ĐẢL Đặt vấn đề Trong năm gan việc sứ dụng phương pháp y học đại, thuôc tây y đê chữa bệnh người có xu hướng dụng nhiều sản phâm, thực phâm dược phâm cõ nguỏn gốc tự nhiên để châm sóc sức khỏe chừa bệnh Cây Mật Nhân hay cảy Mật Nhơn có tên khoa học Eurycoma longifolia Jack loại thuốc dược liệu quý có khả chữa bách bệnh nhân gian Hầu hết phận cua Mật Nhân tác dụng trị bệnh Chính gọi Bá Bệnh hay Bách Bệnh Cây Mật Nhân phân bố chủ yếu Đông Nam Á Indonesia Campuchia, Lào Việt Nam , số quổc gia khác Theo nghiên cứu khoa học cho thay, ơong Mật Nhàn có chứa nhiều họp chất diterpenoids, triterpene, alkaloid quassinoid, (Narihiko Fukamiya, 2004) Trong đó, alkaloid quassinoid đóng vai trị quan ưọng hoạt lực chủ yếu Mật Nhân Các chất có cày Mật Nhân nỏ có tác dụng giúp nam giới tăng cường chức sinh lý sức khòe sinh sàn bồ sung lượng cho thể, giúp giảm stress, tăng cường hệ miễn dịch ngãn ngừa khối u phịng lão hóa, hoạt tính chống oxi hóa, làm thuốc tẩy giun sán trị sốt rét kiết lỵ, ngộ độc, đầy bụng, giải say rượu, giải độc điều hịa huyết ápchữa khí hư, huyết kém, ăn uống khơng ngon miệng, (Đỗ Tất Lợi 1999) Vì việc sừ dụng Mật Nhân khuyến khích phương pháp bào vệ sức khòe cộng đồng Tuy nhiên, hàm lượng quassinoid, alkaloid cày Mặt Nhàn thấp phát ưiển cày chậm nên việc khai thác thu nhận chất cịn gặp nhiều khó khăn Việt Nam, với phát triền mạnh mẽ cơng nghiệp hóa đại hóa, tốc độ thị hóa diễn cách nhanh chóng, săn lùng khai thác mức, không chọn lựa khiến diện tích trồng cày Mặt Nhân ngày bị thu hẹp, số lượng trồng ưong V iệc không sư (lụng BA nghiệm thức 4.1 cho khối lượng mô sẹo khô thấp 0,09 g, điêu dược nói ráng mơi trường chì bổ sung NAA với nồng độ thích hợp mâu ni cày phát tríén mơ sẹo rât thắp Nhưng ta tiến hành kết hợp auxin cytokinin với nóng độ thích hợp cho kết tỷ lệ mô sẹo tăng lên cao nông độ NAA Img/i, dũng BA với nồng độ 0,5 mg/l (nghiệm thức 2) cho khôi lượng khô mô sẹo 0,29 g thấp khí sư dụng nồng độ BA mg/l (nghiệm thức 3) (khôi lượng khô mô sẹo lớn nhát la 6“ g I Điêu chứng tỏ với nồng độ tỳ lệ BA NAA thích hợp tỵ lệ nhin Sinh khối tế bào mơ sẹo cao tăng hoạt tính enzyme kích thích tế báo phản chia q trình nhân sinh khối diễn cách mạnh mẽ Khi ta tiếp tục táng nông độ BA lên mg/l - mg/l phát triển khối lượng mô sẹo giám dan \ ới khối lượng khô mơ sẹo chì đạt 0,39 g 0,28 g Mơ sẹo khơng cịn hình dạng giơng ban đâu mà chuyến sang màu nâu đen mô sẹo phát triển chậm lại không phát ĩrién chết dần cho thấy tăng nồng độ BA cao ức chế q ưình phát triển cùa mị sẹo Hình 3.4: Mơ sẹo tăng sinh mơi trường có NAA mg/I BA mg/1: Mô sẹo sau 04 tuần ni cấy (A); mị sẹo sau 08 tuần ni cấy (B) Kết thúc thí nghiệm chúng tơi xác định mơi trường có bồ sung NAA nồng độ mg/1 kết hợp nồng độ BA mg/l thích hợp cho q trình nhân sinh khối mơ sẹo Mật Nhân nồng độ sử dụng thí nghiệm tiêp theo 47 3.5 Kêí thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng chất bổ trợ đến q trình tăng sinh khối mó sẹo cấy Mật Nhân Từ kết cùa thí nghiệm giúp chúng tơi xác định thành phan mơi trường khống ban vã nóng độ chất điều hịa sinh trưởng thích hợp cho qua trinh nhan sinh khoi mo sẹo Mật Nhân Tuy nhiên, trone q trinh ni cay mơ thực vật ngồi việc sử dụng chát điêu hòa sinh trường để tăng khả nhân sinh khôi mô sẹo, chât bỏ trợ nêu dùng dẽ giúp nâng cao hiệu cua qua trinh tăng sinh Các chát bị trợ thường sử dụng nuôi cấy mô là: nước côt cà chua, dịch chiêt khoai nghiền, dịch chiết mạch nha, dịch chiết nâm men (yeast extract), Trong thí nghiệm sừ dụng chắt bổ trợ nước dừa, vitamin B1 glycine Trong nước dừa thường chứa acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN DNA Đặc biệt nước dừa cịn có chứa hợp chất quan trọng cho nuôi cay mô như: myoinoxitol, hợp chất có hoạt tính auxin, gluxit cytokinin Vitamin Bl không thè thiếu sử dụng hẩu hết môi trường nuôi cay mô tế bào thực vật lả vitamin cần thiết cho tâng trường tất tế bào Glycine bổ sung vào môi trường đề kích thích sinh trưởng tế bào ni cay protoplast đè hình thành dịng te bào Bảng 3.5: Kết khảo sát ảnh hưởng chất bổ ơợ đến q trình tăng sinh khối mơ sẹo Mật Nhân Nghiệm thúc Nồng độ chất bổ trợ Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g) 5.1 Nước dừa 10% 6,30b 0,73b 5.2 Vitamin Bl 10 mg/1 7,74’ 0,94’ 5.3 Glycine 10 mg/1 0.33c 0,06c 4,12 5,86 cv (%) Các ký tự theo giá trị trung bình cột thè khác biệt giữ nghiệm thức với mức ý nghĩa p< 0.0 ỉ trắc nghiệm phàn hạng LSD Kết bàng 3.5 cho thầy, sử dụng chất bổ ượ khác tăng sinh khối mơ sẹo có tha) đồi rị rệt Với việc bồ sung thêm vitamin Bl nghiệm thức 5.2 cho thấy khối lượng mô sẹo khô tăng cao 0,94 g so với việc sử dụng nước dừa 10% 48 khoi lượng mo SCO khó lã 0.73 g cao 0,21 lần cịn với glycine 10 mg/1 khối lượng mơ sẹo 0,06 g cao 0,88 g Nước dừa xác định la giãu hợp chất hừu cơ, chất khống chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996) Nước dừa sử dụng để kích thích phân hóa nhân nhanh chói nhiều lồi in vitro Nước dừa thừ nghiệm trình nhân sinh tế báo mỏ sẹo đối tượng Mật Nhân, nồng độ nước dừa 10% bổ sung vào mỏi trương nuôi cấy cho tỳ lệ khối lượng khô thu cao 0,73 g Ở mơi trường có bổ sung vitamin Bỉ nghiệm thức 5.2, khối lượng khô mô sẹo thu cao 0,94 g Nguyên nhàn \ :tamin B1 giúp xúc tác trình biến dường khác mơ, làm mơ sinh trưởng tót Điểu chứng tỏ rang vitamin Bl có tác dụng làm tăng tỷ lệ nhân sinh khối mỏ sẹo Mô sẹo mểm xốp trang, sau chuyên sang vàng, phát triển nhanh Còn sứ dụng glycine, khối lượng mô sẹo tăng sinh thấp, gần không đáng kể (sau 04 tuần, khối lượng khơ 0,06 g), q trình ni cấy, mơi trường có chứa glycine mơ sẹo chun sang màu nảu chêt dân Hình 3.5: Mơ sẹo cày Mật Nhàn nuôi cấy trèn môi trường cỏ bổ sung vitamin B1 10 mg/l: Mô sẹo sau 04 tuần nuôi cẩy (A); mô sẹo sau 08 tuần nuôi cấy (B) Kết thúc thi nghiệm chủng xác định mơi trường có bổ sung NAA nồng độ mg/1 kết hợp nồng độ BA mg/1 cộng với vitamin Bl 10 mg/1 thích hợp cho trình nhàn sinh khói mị sẹo Mật Nhân 49 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ Kết luận Qua trình thực hiện, đề tải thu nhịn số kết quà sau: - Thời gian 25 phút, nông độ javeả 50° c thích hợp để tạo mẫu cấy Mật Nhân với tỳ lệ mẫu sống đạt 94,45% tý :ẻ mầu võ trùng 99,51% - Nơng độ NAA mg/1 thích hợp cho q trình tạo mơ sẹo Mật Nhân với tỷ lệ tạo mô sẹo 83,56% - Nồng độ NAA mg/1 kết hợp với nồng độ BA mg/1 nồng độ thích hợp để nhân sinh khối tế bào mô sẹo Mật Nhân với khối lượng khỏ mỏ sẹo 0,67 (g) - Nồng độ vitamin B1 10 mg/1 thích hợp để nhân sinh khối tế bào mô sẹo Mật Nhân với khối lượng khô mô sẹo 0.94 (g) Kiến nghị Qua trình nghiên cứu, đề tài xin đưa so kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu tạo nhân sinh mò sẹo Mật Nhàn ưong môi trường khác nhau: môi trường bán rắn, mơi trường lóng lắc hay cỏ bồ sung nông độ chất ĐHSTTV chất bổ trợ khác nhàm tìm mịi trường tối ưu - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng hợp chất có ưong thành phan tế bào Mật Nhân đến khả điều trị bệnh cho người hay xã hội 50 TÁI LIỆC THAM KHẢO TIÉNG VIỆT Bui Minh Nhuẹ, 2012 Nghiên cứzi 'nành phân hóa học cày Khổ sâm mềm (Brucea mollis wall, ex kurz) NXB Trường Đại học Khoa học Tự nhiên dại cương phần II-phát triển NXB Đại học Bùi Trang Việt, 2000 Sinh lí thự: - Quốc gia TP HCM Đồ Tất Lợi, 1999 Những cảy '.-.Uữc vá vị thuốc Việt Nam NXB Y học Hà Nội, ưang 412 - 413 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng 2006 Giảo trình sinh lý thực vật NXB Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Lê Trần Đức, 1997 Cây thuốc Việt nam NXB Nông Nghiệp, trang 516 Mai Xuân Lương, 2005 Cóng nghệ sinh học thực vật NXB Trường Đại Học Đà Lạt Ngơ Xn Bình, 2009 Ni cấy mơ tế bào thực vật NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 18 Nguyền Đức Lượng, 2002 Công nghệ tế bào NXB Trường Đại Học Quốc Gia Tp.HCM Phạm Thị Như Hồng, 2006 Khảo sát thành phần hóa học bá bệnh Eurycoma Longifolia, họ thất (Simarubaceae) Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, trang 75 - 79 10 Trần Anh Tuấn ctv, 2007 Nghiên cứu thành phần hóa học bá bệnh Eurycoma Longifolia Jack Tạp chi dược học số 378, ưang 12 - 16 11 Trần Văn Minh 2013 Giáo ưình cao học - nghiên cứu sinh Cơng nghệ sinh học Thực vật Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia 12 Võ Châu Tuần Trần Quang Dần, 2013 Nghiên cứu khà tái sinh chồi in vitro Mật Nhổn (Eurycoma longifolia Jack) NXB Trường Đại Học Đà Nằng 51 13 Võ Vân Chi, 2003 Tú thực vặ, ,hóng dụng tập , NXB Học Và Thuật, trang I 39, TIẾNG ANH 14 Chan KL, Lee s, Sam TW, Han BH ,1989 A quassinoid glycoside from the roots of Eurycoma longifolia Phytochemistry, 28:2857 - 15 H Yusuf, Mustofa, M Agus Wijayanti, R Asmah Susidarti, p Budi Setia Asih, Suryawati and Sofia, 2013 A New Quassinoid of Four Isolated Compounds fromExtract Eurycoma Icmgjfotia Jack Roots and Theừ In-VitroAntimalarial Activity International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, ISSN: 2229 - 370 L 16 Kardono LBS, Angerhoter CK ĩsauri s, Padmawinata K, Pezzuto LM, Kinghom ADJ, 1991 “Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia” J Nat Prod, 54: 1360 - 17 Luthfi aziz mahmud siregar, 2009 Effects of medium constituents on growth and canthinone accumulation in cell suspension cultures of Eurycoma longifolia jack Hayati journal of biosciences ISSN: 1978 - 3019 18 Nor Hasnida Hassan, 2012 Micropropagation and production of eurycomanone, 9Methoxycanthin-6-one and canthin-6-one in roots of Eurycoma longifolia plantlets African Journal ofBiotechnology Vol 11(26), trang 6818 - 6825 19 Narihiko Fukamiya, Kuo-Hsiung Lee, Ilias Muhammad, Chihiro Murakami, Masayohis Okano, Isabelle Harvey, Jerry' Pelletier, 2004 Structure-activity relationships of quassinoid for eukaryotic protein synthesis Cancer Letters 220 (2005 - 4) 278 20 Sobri Hussein, Anna Pick Kiong Ling, Tze Hann Ng, Rusli Ibrahim And Kee Yoe Up Paek, 2012 Adventitious roots induction of recalcitrant tropical woody plant, Eurycoma longifolia University of Bucharest Romanian Biotechnological Letters 21 Sobri Hussein, Rusli Ibrahim, Anna Ling Pick Kiong, Nor’aini Mohd Fadzillah and Siti Khalijah Daud, 2006 Micropropagation of Eurycoma longifolia Jack, via formation of somatic embryogenesis Asian Journal Of Plant Sciences (5): 472 - 485 52 22 Wan Rasidah K, Rosazlin A and Rozita A, 2010 Growth of tongkat all (Eurycoma longjfolia) on a sandy beach ridges soil in Malaysia, World Congress of Soil Science, Soil Solutions fora Changing World TÀI LIỆU INTERNET 22 Cây Mật Nhân 23 Công nghệ nuôi cấy mô vả tế bảo thực vật - nhân giống in vitro 24 Lê Thanh Bình “Nghiên cứu đặc điềm thực vật thành phần hóa học Bá Bệnh” 25 Lê Thị Mỹ Thảo” Luận văn Khảo sát số tác dụng dược lý công thức phổi hợp dược liệu Thiên niên kiện i Homalomena occulta) Bách bệnh (Eurycoma longifolia) chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino)” 27 Nghiên cửu Bá Bệnh 53 PHỤ LỤC Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ javel thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu cấy cáy Mật \'hán Tỷ lệ mẫu sống Source The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T VI V2 V3 V4 V5 V6 Numoer- of Observations Read 18 Number of Observations Used 18 The ANOVA Procedur'e Sum of OF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7505.85613 1501.17123 4.02 0225 Error Corrected Total R-Square 0.625903 Source 4486.18147 373.84846 11992.03760 N Mean Coeff Var Root MSE 2.860372 19.33516 67.59667 F Value Mean Square OF Anova ss 12 17 Pr > F T 7505.856133 1501.171227 0225 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N 0.01 Alpha 12 Error Degrees of Freedom 373.8485 Error Mean Square 3.05454 Critical Value of t Significant Difference 48.222 Least N T t Grouping Mean V3 A 94.45 V4 83.34 V5 c 74.08 V6 c 70.38 D V2 D 50.00 VI E 33.39 54 4.02 F 0.1617 Corrected Total R-Square 0.446485 Source N Mean 79.32000 DF Anova ss Mean Square F Value 4843.480333 968.696067 1.94 Pr > F T 0.1617 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N 0.01 Alpha 12 Error Degrees of Freedom 500.3791 Error Mean Square 3.05454 Critical Value of t 55.789 Least Significant Difference T N Mean t Grouping V6 100.00 A V3 99.51 A V5 85.19 B V4 85.18 B V2 68.51 c VI 55.56 D 55 í hí nghiẹm 2: Khao sái ánh hirởng nông độ NAA đên khả tạo mô seo Mật Nhân Source The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T VI V2 V3 V4 VS Number of Obser/ations Read 15 Number of Cbser/ations Used 15 The A.’ZTVA Procedure Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 13224.37353 3306.09338 9.96 0.0016 Error Corrected Total R-Square 0.799320 Source 332Ỗ.15580 332.01558 16544.52933 Coe— /ar Root MSE N Mean 4.691668 18 22129 44.53333 DF Anova ss Mean Square F Value 10 14 Pr > F T 13224.37353 3306.09338 0.0016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 332.0156 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 33.149 t Grouping Mean N T A 83.56 V3 B 61.34 V4 c 55.18 V5 D 22.17 V2 E 0.00 VI 56 9.96 Thí nghiệm 3: Khảo sát ánh hưõng nồng độ 2,4-D đến khả tạo mô sẹo Mật Nhân Source Thí: P.VjJf Procedure Class Level Information Class Levels Values T VI V2 V3 V4 V5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 Tre ANOVA Procedure Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3776.600107 944.150027 8.50 0.0029 Error Corrected Total 18 14 R-Square 0.772725 Source '218.777867 111.077787 4887.377973 Coeff Var Root MSE N Mean 4.517766 10.53934 23.; Ĩ2867 F Value DF Anova ss Mean Square Pr > F T 3776.600187 944.150027 0.0029 The AJiOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0-05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 111.3778 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 19.174 t Grouping Mean N A 45.737 V4 B 34.887 V5 c 27.673 V3 D 11.257 V2 E 0.830 VI 57 8.50 Thí nghiêm 4: Kháo sát ảnh hưởng nồng độ NAA kết họp BA đến trình tăng sinh khối mô sẹo Mật Nhân Khối lượng tưoi Source The ANG'/A Procedure Class Level Information Class Levels Values T VI V2 V3 V4 V5 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 The ANOVA Procedure Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 29.78590667 288.03 7.44647667 F T 58 ❖ Khối lirọìig khó Source The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values T VI V2 V3 V4 V5 Number of Observations Read 15 15 Number of Observations Used Tre A'.OVA Procedure Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 8.31884000 0.07951000 198.77 < 0001 18 Error Corrected Total R-Square 0.987579 Source 8.88400000 0.00040000 14 0.32204000 Coe— /ar Root MSE N Mean 6.024896 0.020000 0.332000 OF A.nova ss Mean Square F Value Pr > F T 8.31804000 0.07951000 F Model 52.59468889 46.25234444 1183.93 < 0001 Error Corrected Total R-Square 0.997472 Source 9.23440000 0.03906667 52.73908889 Coeff Var Root MSE N Mean 4.125468 0.197653 4.791111 Dr Anova ss Mean Square F Value Pr > F T 92.50468889 46.25234444 < 0001 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0-05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.039067 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.3949 t Grouping Mean N T A 7.7367 V2 B 6.3033 VI c 0.3333 V3 60 1183.93 ❖ Khối lượng khô Source Pr > F The ANŨVA Procedure Class Level Information Class Levels Values VI V2 V3 Number of Otser/atiors Read Number of Observations Used The A?/".A Procedure Sum of DF Squares Mean Square Model Error Corrected Total 87075556 F T Ỗ.87875556 0.43537778