Nghiên cứu nuôi cấy hệ sợi đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris cm34) trên môi trường hữu cơ

TRƯỜSIG ĐẠI HộC NGOTẳĩí TẤT THANH HĨOA NỒNG SGHIỆP CỔNG NGHỆ CAO VÃ CƠSG ỈĨOĨĨỆ SỈĨSỈỈ HỘC SVTH í PHẠM NGUYỄN THANH THỬY NGẰNH : CỐNG NGHỆ SÍNH HỌC KHĨA : 2013 • 2017 GVHD : ThS MAI THỊ PHƠƠNG HOA ThS, NGUYỄN TRUNG HẬƠ yễn Tất Thành in - Thư viện 538 Í34 117 »1589 ĩ Hồ CHÍ MINH - NĂM 2017 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY HỆ SỢI ĐỎNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps mỉlitaris CM34) TRÉN MÒI TRƯỜNG HỮU PHẠM NGƯYẺN THANH THÙY Khóa luận đệ rrình đế đáp ứng yêu cầu cấp bàng Kỹ sư ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: ThS Mai Thị Phương Hoa ThS Nguyễn Trung Hậu / TRƯỞNG ĐH NGUYÊN TẤT THÀNH TRUNG TÀM THÕNG TIN-ĨHƯ VIỆN LÌỠ3I559 to Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năni 2017 LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời càm ơn chán thành đến Thầy ThS Nguyễn Trung Hậu, Cô ThS Mai Thị Phương Hoa người diu da* truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu, giúp đỡ cho em trình học tập vả thục đề tài Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến quý Thay cỏ khoa Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành tận tình truyền đạt kiến thức thời gian qua Với vốn kiến thức tiếp thu trinh học không tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang qui háu để em bước vào đời cách vững tự tin Cảm ơn bạn bè bạn, Anh Chị phòng thí nghiệm, nhiệt tình giúp đỡ, động viên tơi lúc khó khăn thời gian thực đe tài Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ người nuôi dường, yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt cho thực ước mơ Tơi xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 Sinh x iên Phạm Nguyễn Thanh Thùy TĨM TÁT Đê tài: ’Nghiên cứu ni cấy tạo hệ sợi Cordyceps militaris CM34 môi trường hfru CO’' Được thực trường Đại học Cóng nghiệp TPHCM từ tháng 01/2017 đến 07/2017 Thi nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên Nội dung đề tài: Gồm thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hường ±arh phần dinh dưỡng khống vơ đến khả nhân sinh khôi hệ sợi Cordyceps militaris C3-C'- trẽn mỏi trường thạch agar - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hường cùa ĩhãnh phẩn dinh dưỡng khoáng vô đến khả nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps md.-.ãris CM34 mơi trường lỏng tĩnh - Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hướng cửa thành phẩn dinh dưỡng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trẽn môi trường thạch agar - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng thành phẩn dinh dưỡng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 frên mòi trường lòng tữih - Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hường pH môi trường đến khả sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 môi trường lỏng tĩnh - Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 môi trường hạt Kết đạt được: - Mơi trường có thành phần dinh dưỡng khống vơ Cữ thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 môi trường thạch agar PSA + glucose 10 g4 + peptone 15 g/1 + KH2PO4 0,5 g/1 + K2HPO4 0,5 g/1 + MgSO4.7H2O 0,5 g/1 - Mơi trường có thành phần dinh dưỡng khống vơ thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 điều kiện lỏng tĩnh PS - glucose 10 gi + peptone 15 g/1 + KH2PO4 0,5 g/1 + K2HPO4 0.5 g/1 + M0SO4.7H2O 0.5 g/1 - Mơi trường có thành phần dinh dường hữu thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 mòi trường thạch agar PSA + dịch chiết thịt bò 100 g/1 iii - Mơi trường có thành phần dinh dường hữu thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi nám Cordyceps militcưis CM34 trén trương lỏng tĩnh PS + dịch chiết thịt bị 100 g/1 - Mơi trường pH 6,5 thích hợp để Cordyceps militaris CM34 sinh trưởng môi trường hữu lỏng tĩnh - Môi trường có thành phần dinh dưỡng hữu úũch hợp để Cordyceps militaris CM34 sinh trường, phát triển môi trường thạch hạt PS - gạo -ức 100 g/1 + nhộng tằm 100 g/1 iv MỤC LỰC TRANG TRANG TựA • * i1 LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC V DANH SÁCH CHỮ VIÉT TÁT ix DANH SÁCH HÌNH DANH SÁCH BẢNG xi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài .2 Chuông 1: TÔNG QUAN 1.1 Cordyceps militaris 1.1.1 Nguồn gốc, thể loại 1.1.2 Sự phân bố 1.1.3 Cơ chế lây nhiễm 1.1.4 Giá trị dược liệu .5 1.1.4.1 Cordycepin 1.1.4.2 Adenosin 1.1.4.3 Acid cordycepic 1.1.4.4 Superoxide Dismutase., 1.1.4.5 Polysaccharide 10 1.1.4.6 Chất manitol 11 1.1.4.7 Sterol ' 11 1.1.4.8 Acid béo nguyên tổ kim loại 11 1.1.4.9 Protein amino acid 12 V 1.1.5 Cõng dụng nấm Cordycep: militaris 12 1.1.5.1 Các hợp chất chống ung thư 12 1.1.5.2 Giải độc cho thận 13 1.1.5.3 Tăng số lượng tinh trùng 13 1.1.5.4 Hạn chế virut cúm 13 1.1.5.5 Đối với hệ thống miễn dịch 13 1.1.5.6 Đối với hệ thống tuàn hoàn tim não 14 1.1.5.7 Đối với hệ thống nội tiết 14 1.1.6 Các nghiên cứu nấm Cordyceps mìỉiiaris 14 1.1.6.1 Các nghiên cửu giới 14 1.1.6.2 Ở Việt Nam 16 1.2 Q trình ni trồng nhân tạo nấm Cordyceps militaris 17 1.3 Các yếu tố ảnh hường đến q trình ni nhân tạo nấm Cordyceps militaris 1.3.1 18 Ảnh hưởng cùa điều kiện môi trường 18 1.3.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 19 1.3.1.2 Ảnh hưởng cùa yếu tố ánh sáng 20 1.3.1.3 Ảnh hưởng độ thống khí dộ ẩm 20 1.3.1.4 Ảnh hưởng cùa pH 20 1.3.2 Ảnh hưởng cùa dinh dưỡng môi trường nuôi cầy 20 1.3.2.1 Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng 20 1.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng từ hợp chất hữu tự nhiên 20 1.3.2.3 Các chất bổ sung 22 Chuông 2: VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP 23 2.1 Thời gian, vật liệu địa điểm thực đề tài .23 2.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 23 vi 2.2.2.1 Phòng chuẩn bị mẫu 23 2.2.2.2 Phòng cấy 23 2.2.2.3 Điêu kiện nuôi cấy 24 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 24 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sắt ảnh hưởng cùa mõi trường dinhdưỡng thạch đến khả nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps ’rdỉiĩaris CM34 25 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởũg mỏi trường dinh dưỡng lỏng đến khả nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps rrdlữarís CM34 25 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng mỏi trường hữu cơthạchđến khà nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps milỉtarỉs CM34 26 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hường mơi trường hữu lòng đến khả nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 21 2.3.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng cùa pH môi trường đen khả nhàn sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 28 2.3.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng môi trường hữu hạt đen khả nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 29 2.3.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 30 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 Chuông 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thành phần dinh dường khống vơ đến khả nhân sinh khối hệ sợi cordyceps mìlừaris CM34 môi trường thạch agar 31 3.2 Kết thí nghiệm 2: Khào sát ành hường thành phần dinh dường khống vơ đến khả nhân sinh khối hệ sợi cordyceps mìlitaris CM34 ữên mơi trường lỏng tĩnh 35 vii 3.3 Kêĩ quà thi nghiệm 3: Khảo sát ảnh hường thành phẩn dinh dưỡng khoáng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi cordycepĩ militaris CM34 môi trường thạch agar 38 3.4 Kèt thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hường cùa thánh phân dinh dưỡng khoáng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi cordyceps militaris CM34 trér mói tnràig lóng tĩnh 41 3.5 Kêt thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hương cua pH môi trường đến khả sinh trưởng hệ sợi cordyceps militaris CM3- rrèn mỏi trường lòng tĩnh 44 3.6 Kết thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng cùa thành phần dinh dưỡng hữu đến khả sinh trưởng hệ sợi cordyceps ìrddĩaris CM34 môi trường hạt 47 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận 49 Kiến nghị .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO : 5O Tài liệu nước 50 Tài liệu nước 50 PHỤ LỤC 52 viii DANH SÁCH CHƠ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATP Adenosin triphosphat AMP Adezonin monophosphate APS Acidic polysaccharide CM34 Cordyceps milizcris 34 ĐTHT Đông Trùng Hạ Tr ảo HPLC High Performace Liquid Chromatography HEAA Hydroxy - ethyl - adenosine - analogs SOD Superoxide Dismutase PSA Khoai tây 200 g/1 - Saccharose 20 g/l+ agar 20 g/1 PS Khoai tây 200 g/1 T Saccharose 20 g/1 uv Ultra violet ix Sinh khôi khô (g/100ml) 14 ngáy The l-.iiG'/t- Procedure Class Level Information Class Levels T Values Ml M2 M3 N4 Number of Observable*s Reas 12 Number of Observations used 12 The ANOVA Procec_-e Sum of Source Model DF Squares “e=* Square F Value Pr > F 3.12889167 1.34296389 485.10 F F 1.02982588 8.34327500 15.20 0.8011 Error Corrected Total Source T 0.18866667 11 1.21849167 0.02258333 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.850749 9.167922 8.150278 1.639167 DF Anova ss Mean Square F Value Pr > F 1.02982500 0.34327588 15.28 0.0011 Alpha 0-01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 8.022583 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 8.4117 t Grouping Mean N T A 1.9900 N2 A 1.8067 N3 c 1.5500 N4 c 1.2100 N1 59 ' Chiều dài tơ lan (cm) The AíiCVA Procedure Class Level Information /aloes Levels Class T Hl M2 N3 N4 Number of Observations pead 12 Number of Observations Used 12 Source DF Model The ANOVA -*x>cedure S-nt of Squares Mean Square 2.03963333 Error Corrected Total Source T F Value 17.54 5.67987778 Ĩ.31513333 11 2.34976667 Coeff Var Root MSE N Mean 0.868015 5.426528 0.196893 3.628333 Anova ss F Value Mean Square 2.03963333 17.54 0.67987778 Alpha 0.01 Error Degrees of Freedom Error Mean Square a.038767 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.5394 Mean N T A 4.2300 N2 B A 3.7667 N3 B c 3.3700 N4 c 3.1467 N1 Grouping 60 0.0007 0.03876667 R-Square DF Pr > F Pr > F 0.0007 Chiêu dài tơ lan (cm) 14 The A.’iC'/A Procedure Class Level Indorsation Levels Class T Values W1 N2 N3 N4 Number of Observations Read 12 Number of Observations Used 12 The ANCVA Procedure Source Model DF Squares Sub of “ear Square F Value Pr > F 4.39302500 1.46434167 62.16 F Sinh khối tươi (g/100ml) ngày The AMGVA ^-ocec.-e Class Level Z'-crraxion Class Levels T Zalues Ml M2 N3 N4 Number c>f Observations Read 12 Number of Obse-.iTic-s Used 12 Source DF The ANOVA Procedure Sum of Sc_="=s Mean Square 4.53776667 Model 0.32040000 11 4.85816667 Error Corrected Total Source T 1.51258889 F Value Pr > F 37.77 F F 1.09975556 39.95 F F Value 1.09975556 39.95 Sinh khôi khô (g/1 OOml) Procedure The Class Level Information Class Levels T values «1 M2 N3 N4 Number of Observations read 12 Number of Observatit'S used 12 The ANOVA =-::eture Source DF Model Error Corrected Total T Mean Square 1.82 0.00151944 0.00455833 s 8.28566667 11 8.81122500 F Value Pr > F 0.2209 0.00083333 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.406088 4.713063 0.028868 0.612500 F Value Pr > F 0.00151944 1.82 0.00455833 0.01 Alpha Error Degrees of Freedom .000833 Error Mean Square Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.0791 N T Mean t Grouping 0.2209 DF Source Sum of Squares Anova ss Mean Square A 0.63333 N2 A 0.61667 N3 A 0.60667 N1 A 0.58333 N4 64 Sinh khôi khô (g/100ml) 14 ngây The UKNb Procedure Class Level Irtfc'-ation Class Levels T /allies Ki M2 M3 N4 Number of Observations ?ead 12 Number of Observations used 12 The ANOVA Procedure Source DF Model Sum of Squares 0.03980666 Error Corrected Total Mean Square F Value 0.61326667 12.25 s.66856667 11 3.64846667 Pr > F 0.0023 0.00108333 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.821183 2.396653 0.032914 1.373333 Source DF T Anova ss 0.03980000 Mean Square F Value 0.01326667 12.25 0.01 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.001083 Critical Value of t 3.35539 Least Significant Difference 0.0902 t Grouping Mean N T A 1.45000 N2 B A 1.40333 N3 B c 1.34000 N1 c ìũữũũ N4 65 Pr > F 0.0023 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hường pỉí mói trường đến khả sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trẽn mói trướng lóng tĩnh > Sinh khối tươi (g/100ml) ngày The ANOVA Procedure Class Level Irformation Class Values Levels T N2 N3 N4 NS N6 N7 Number of Obse.'vcTio'S Read 21 Number of Observarior.s Used 21 The ANOVA Procedure Source DF Model Sum of Squares Error 14 1.21086667 Corrected Total 20 46.08060000 0.973723 Source T DF 3.492787 Anova ss F F Value Mean Square N Mean 8.420000 0.294093 Mean Square F Value Pr > F 44.86973333 7.47828889 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 86.46 0.01 14 0.08649 2.97684 0.7148 F 73.2880952- 12.21468254 137.60 < 0001 Error 14 1.2X280000 Corrected Total 20 74.53889524 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.983325 1.677575 0.297945 17.76048 Anova ss DF Source T 08877143 73.28809524 Mean Square 12.21468254 F Value 137.60 Alpha 0.01 Error Degrees of freedom 14 Error Mean Square 0.088771 Critical Value of t 2.97684 Least Significant Difference 0.7242 Mean Grouping N T A 19.6400 N4 B A 19.0800 N5 B A 18.9433 N3 B 18.5900 N6 c 17.4600 N2 c 16.8733 N7 D 13.7367 N1 67 Pr > F F F Value F