Đang tải... (xem toàn văn)
Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) từ lâu đã xuất hiện trong các tài liệu dược cổ, các bài thuốc của Trung Quốc. Đông trùng hạ thảo là một loài nấm dược liệu quý hiếm và hiện nay đã được cả thế giới biết đến. Trong số các loài nấm thuộc chi Cordyceps, loài Cordycep militaris chứa các thành phần hóa học có giá trị dinh dưỡng và dược tính như: cordycepin, adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, các sterol và các hoạt chất có tác dụng sinh học khác như acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ...) và nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ...). Có nhiều bằng chứng khoa học xác nhận hiệu quả của Đông trùng hạ thảo Cordycep militaris như: cải thiện hệ miễn dịch, hạ đường huyết, chống lão hóa, chống viêm, hoạt động chống khối u, chống tế bào ung thư, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện và phục hồi chức sinh sản, làm mỹ phẩm...
LỜI CẢM ƠN Để nâng cao kỹ thuật sinh viên ngành Cơng Nghệ sinh học Lâm Nghiệp nói riêng sinh viên đại học Lâm Nghiệp nói chung Được đồng ý lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp giáo viên hướng dẫn em xin tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình ni cấy tạo thể nấm Đơng trùng hạ thảo Cordyceps Militaris” Có kết trước hết em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Th.S Nguyễn Trọng Trí cô giáo T.S Nguyễn Thị Thu Hằng tận tâm hướng dẫn, bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt trình nghiên cứu để em hồn thành đề tài Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm Nghiệp Bộ mơn Vi sinh – Hóa sinh Em xin cảm ơn thầy cô giáo giảng dạy Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp dạy bảo, trang bị cho em kiến thức quý báu suốt năm học vừa qua Bên cạnh em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình toàn cán viên chức Cty TNHH MTV Tinh hoa Việt tạo điều kiện, giúp đỡ cho em để trình nghiên cứu thuận lợi Với kết khả quan em xin tiếp tục nghiên cứu tiếp để đề tài đạt kết tốt Với tinh thần cố gắng, chăm ham học hỏi nhiên với kinh nghiệm cịn hạn chế nên q trình nghiên cứu khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy, cô giáo để đề tài nghiên cứu em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2022 Sinh viên thực MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Lịch sử phát 1.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái 1.1.4 Giá trị dược liệu 1.1.5 Tình trạng phân bố khai thác 1.2 Nghiên cứu nuôi nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps military 1.2.1 Trong nước 1.2.2.Trên giới PHẦN 2: NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu: 2.1.1 Mục tiêu chung 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 2.2 Nội dung 2.3 Vật liệu nghiên cứu, địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu: 2.3.2 Địa điểm điều kiện bố trí thí nghiệm: 2.4 Dụng cụ thí nghiệm: 2.5 Phương pháp nghiên cứu: 2.5.1 Phương pháp xác định ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả tạo khuẩn lạc Đông trùng hạ thảo 2.5.2 Phương pháp xác định loại chất tối ưu 2.5.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng thời gian ủ tối kích thích sợi nấm PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả tạo bào tử Đông trùng hạ thảo 3.2 Kết nghiên cứu xác định hàm lượng chất tối ưu 3.3 Kết nghiên ảnh hưởng thời gian ủ tối tới phát triển thể Tài liệu tham khảo Phần 4: Kết luận - tồn - kiến nghị 4.1 Kết luận 4.2 Tồn 4.3 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt CT C militaris C sinensis cs g NC v/p Chữ viết đầy đủ Công thức Cordyceps militaris Cordyceps sinensis Cộng Gam Nghiên cứu Vòng/phút DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Ảnh hưởng tốc độ lắc khác đến khả tạo cầu nấm sau ngày ni cấy Hình 3.2: Ảnh hưởng hàm lượng chất đến phát triển thể Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ủ tối đến phát triển hệ sợi nấm sau 12 ngày chuyển từ nấm tối ni ngồi sáng Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian ủ tối đến phát triển thể nấm sau 65 ngày chuyển từ nấm tối ni ngồi sáng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tốc độ lắc thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Bảng 2.2: Công thức phối trộn hàm lượng chất Bảng 3.1: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả tạo cầu nấm Bảng 3.2: Ảnh hưởng hàm lượng chất đến phát triển thể Bảng 3.3: Ảnh hưởng thời gian ủ tối tới phát triển thể ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) từ lâu xuất tài liệu dược cổ, thuốc Trung Quốc Đông trùng hạ thảo loài nấm dược liệu quý giới biết đến Trong số loài nấm thuộc chi Cordyceps, loài Cordycep militaris chứa thành phần hóa học có giá trị dinh dưỡng dược tính như: cordycepin, adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, sterol hoạt chất có tác dụng sinh học khác acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ) nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ) Có nhiều chứng khoa học xác nhận hiệu Đông trùng hạ thảo Cordycep militaris như: cải thiện hệ miễn dịch, hạ đường huyết, chống lão hóa, chống viêm, hoạt động chống khối u, chống tế bào ung thư, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện phục hồi chức sinh sản, làm mỹ phẩm Hiện nay, bị khai thác mức nên Đông trùng hạ thảo khai thác từ tự nhiên (chủ yếu thuộc loài Cordyceps sinensis) dần trở nên khan điều thúc đẩy nhiều nghiên cứu hướng đến việc nuôi trồng Đông trùng hạ thảo nhân tạo quy mơ lớn Trong đó, lồi Cordyceps militaris nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo thành cơng tạo thể có hàm lượng chất hóa học có dược tính quan trọng tương đương lồi Cordyceps sinensis - Đơng trùng hạ thảo tự nhiên Ở Việt Nam, việc nuôi cấy nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris phổ biến, để tìm quy trình ni cấy tối ưu cho suất thể cao, chất lượng thể tốt cịn tốn khó Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình nuôi cấy tạo thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” thực với mục tiêu xác định số điều kiện thích hợp cho ni cấy nhân tạo nấm Cordyceps militaris đạt suất thể cao, góp phần nâng cao hiệu sản xuất qui trình ni cấy nấm Cordyceps militaris Cơng ty TNHH MTV Tinh hoa Việt Việt Nam Phần TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại Theo hệ thống phân loại, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, Hypocreales, họ Clavicipitaceae, gồm 400 loài khác (Sung J.H cs, 2007) Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Phân ngành: Ascomycotina Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris 1.1.2 Lịch sử phát Những nghiên cứu nấm Cordyceps công bố nhà khoa học Trung Quốc cho thấy: vùng núi cao nguyên Tây Tạng có phân bố lồi nấm thuộc chi Cordyceps C sinensis ký sinh vào ấu trùng loài bướm, sâu non, nhộng sâu trưởng thành số lồi trùng Mùa đơng giống nấm C sinensis ký sinh số loài sâu để sinh trưởng phát triển, tới mùa hè nấm mọc thành thể Quả thể nấm Cordyceps thường có màu vàng nhạt màu da cam (Zheng cs, 2011) Năm 1878, nhà khoa học phát loài C militaris ký sinh ấu trùng lồi trùng thuộc chi Thitarodes (Shih cs, 2007; John Matt, 2008) 1.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái Nẩm Cordyceps militaris ký sinh bướm ấu trùng (sâu bướm), có màu cam, chiều dài - 10 cm Đầu nấm có hình dạng giọt nước (đầu chùy), phần đầu có đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng nhộng Nang bào tử dài 300 - 510 µm, rộng µm Các bào tử nang hình sợi, khơng màu phân đoạn, kích thước 3,5 - x – 1,5 µm Bào tử nang điều kiện nghèo dinh dưỡng đứt nảy chổi tạo bào tử thứ cấp Vào mùa Đơng nấm xâm nhiễm, kí sinh vào thể trùng làm trùng chết, sau nấm tiếp tục tồn thể côn trùng dạng hệ sợi dược gọi giai đoạn vơ tính Đến mùa Hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, hệ sợi nấm vơ tính tiến hành giao phối chuyển sang giai đoạn hữu tính, từ bắt đầu hình thành nấm (chất đệm) - quan chứa bào tử vơ tính - dần nhú lên khỏi mặt đất gốc nấm dính liền vào thân trùng Chính mà nấm đặt tên nấm Đông trùng hạ thảo (Phạm Quang Thu cs, 2013) 1.1.4 Giá trị dược liệu Hai loài Đông trùng hạ thảo chi Cordyceps nghiên cứu sử dụng làm dược liệu nhiều C sinensis C militaris Đông trùng hạ thảo C militaris lồi nấm ký sinh trùng có giá trị dược liệu quan trọng tự nấm Cordyceps sinensis sử dụng nhiều y học cổ truyền Các hợp chất dược liệu loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng điều trị bệnh nâng cao sức khỏe người, lồi nấm có giá trị kinh tế cao Nhiều chứng nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris có nhiều hoạt chất hóa học cho dược tính cao như: Cordycepin, dẫn xuất adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, sterol hoạt chất có tác dụng sinh học khác acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ) nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ) Cordyceps militaris cho thấy kết khả quan việc làm giảm tác dụng phụ thuốc áp dụng phương pháp hóa trị liệu để điều trị ung thư Các ứng dụng lâm sàng nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis sử dụng rộng rãi Cordyceps militaris, nhiên ứng dụng lâm sàng hai loài nấm tương tự Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris sử dụng trường hợp suy giảm chức phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Daset cs, 2010) 1.1.5 Tình trạng phân bố khai thác Nấm Đơng trùng hạ thảo tự nhiên thường phát vào mùa hè số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển, vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam (Nguyễn Mậu Tuấn cs, 2013) Ngoài ra, nấm phân bố vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan Hiện nay, khoảng 400 loài thuộc chi Cordyceps phát hiện, đó, có khoảng 90 loài phát Trung Quốc (Zhou X cs, 2009) Tại Việt Nam, Đông trùng hạ thảo phát nhiều địa điểm khác Năm 2009, Phạm Quang Thu cộng phát loài Cordyceps nutans Pat khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động – Bắc Giang, Cordyceps gunni Berk vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc, Cordyceps militaris Link vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai Năm 2009, Đái Duy Ban cộng công bố phát lồi đơng trùng hạ thảo lần tìm thấy Việt Nam lồi đơng trùng hạ thảo có tên Isaria cerambycidae Mặc dù nấm Cordyceps militaris phân bố rộng: Bắc Mỹ, châu Âu châu Á (Paul cs, 2008), nhiên, bị khai thác mức nên nấm Cordyceps militaris khan tự nhiên Do đó, việc sản xuất quy mơ lớn để chiết xuất dược liệu từ nấm phục vụ nghiên cứu điều trị bệnh từ Cordyceps militaris vấn đề quan tâm 1.2 Nghiên cứu nuôi nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps military 1.2.1 Trong nước 10 gồm (20g/l Glucose + gồm (20g/l Glucose + gồm (20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton + nấm men + 5g/l Pepton + nấm men + 5g/l Pepton + 0,1g Vitamin B1) 0,1g Vitamin B1) 0,1g Vitamin B1) 2.4.3 Xác định ảnh hưởng thời gian ủ tối kích thích sợi nấm Thời gian ủ tối điều kiện môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng vi sinh vật Bố trí thí nghiệm tiến hành tiến hành với 36 hộp nuôi cấy cho cơng thức, thí nghiệm lặp lại lần Đem hộp nuôi cấy nấm ủ tối thang thời gian khác từ ngày, ngày ngày Tiến hành quan sát ăn lan hệ sợi nấm thang thời gian khác nhau, hộp đảm bảo nuôi trồng điều kiện độ ẩm nhiệt độ Xác định sinh trưởng hệ sợi thông qua màu sắc hệ sợi nấm sau ngày, ngày ngày tương đương với công thức UT1-UT3 Quan sát, so sánh ghi lại kết sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm C militaris nhằm xác định thời gian ủ tối thích hợp cho q trình sinh trưởng phát triển thể Đánh giá đặc điểm hình thái thể sau ủ tối, tiến hành đo kích thước thể số lượng thể /hộp công thức 2.4.4 Phương pháp thu thập xử lý số liệu Sử dụng dụng cụ thước đo để xác định kích thước, đếm số lượng thể Mỗi công thức nhắc lại lần 17 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới khả tạo cầu nấm Trong nghiên cứu sử dụng môi trường nuôi cấy giống cấp II (mơi trường lỏng) có thành phần gồm pepton, cao nấm nem, glucose, vitamin B1 với hàm lượng: 20g/l glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l pepton, 0,1g vitamin B1, pH = 6,5 Bình mơi trường 500 (ml) bọc kín, hấp khử trùng nhiệt độ 126ºC 45 phút, để nguội tiến hành dùng que cấy lấy giống cấp I mơi trường thạch nghiêng ống nghiệm, kích thước miếng thạch chứa sợi nấm (5 x mm) chuyển sang mơi trường lỏng chuẩn bị Thí nghiệm bố trí điều kiện nhiệt độ, độ ẩm tốc độ lắc thay đổi 100, 150 200 vịng/phút tương ứng với cơng thức CT1, CT2 CT3 Theo dõi hình thành phát triển cầu nấm cơng thức thí nghiệm, ghi lại đặc điểm cầu nấm, kết nghiên cứu thể Bảng 3.1 Hình 3.1 Bảng 3.1: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả tạo cầu nấm Thời gian Cơng thức Tốc Đường kính bắt đầu Mật độ độ lắc cầu nấm xuất cầu (v/p) (mm) cầu nấm nấm Hình thái cầu nấm (giờ) Cầu nấm kích CT1 100 3,0 ± 0,1 36 ± 2,0 Trung thước khơng đồng bình đều, có tượng kết dính Cầu nấm có kích CT2 150 1,5 ± 0,5 24 ± 1,5 Cao thước đồng đều, màu sáng CT3 200 1,0 ± 0,2 24 ± 0,5 18 Cao Cầu nấm có kích thước nhỏ đồng đều, có màu sáng Kết Bảng 3.1 ra: Trong số mẫu công thức cho thấy đặc điểm chung cầu nấm sinh trưởng phát triển tốt tốc độ lắc 150 vòng/phút Ở tốc độ lắc 100 vịng/phút mật độ cầu nấm trung bình cầu nấm phát triển chậm, kích thước cầu nấm lớn Ngun nhân giải thích tốc độ lắc chậm nên cầu nấm dễ bị kết dính lại với tập trung đáy bình Với tốc độ lắc 200 vịng/phút cầu nấm có màu trắng phát triển nhanh, mật độ cầu nấm cao, có kích thước tương đối nhỏ Ngun nhân cầu nấm có kích thước nhỏ tốc độ lắc nhanh nên cầu nấm khó phát triển sợi nấm cầu nấm Tốc độ lắc 150 vòng/phút cầu nấm có màu trắng phát triển nhanh có mật độ cầu nấm cao, kích thước cầu nấm đồng Từ kết Bảng 3.1 Hình 3.1 kết luận tốc độ lắc thích hợp cho cầu nấm trắng, đồng thích hợp cho ni cấy tốc độ lắc 150 vịng/phút Thực tế sản xuất sử dụng dịch giống chứa mật độ cầu nấm cao, có cầu nấm to gây khó khăn việc cấy giống ni trồng 100 vịng/phút 150 vịng/phút 200 vịng/phút Hình 3.1: Ảnh hưởng tốc độ lắc khác đến khả tạo cầu nấm sau ngày nuôi cấy 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng chất tới khả tạo thể 19 Lượng chất bổ sung vào môi trường ni cấy có khả ảnh hưởng đến suất, chất lượng hình dạng thể hàm lượng dược tính thể Do vậy, việc xác định hàm lượng chất phù hợp mang lại hiệu suất cao thu hoạch thể sở cho tính tốn để tiết kiệm chi phí sản xuất Nghiên cứu tiến hành loại chất gạo lức tương ứng với công thức khác bổ sung hàm lượng chất khác thể tích dịch dinh dưỡng phối trộn chất gạo lức khác Các yếu tố khác lượng giống (20ml) bơm cho cơng thức nhau, điều kiện chăm sóc Mục tiêu nghiên cứu chọn hàm lượng chất thích hợp cho phát triển thể mà lại tiết kiệm chi phí nguyên liệu cho sản xuất Sau nuôi cấy công thức môi trường tương ứng với loại hàm lượng chất khác nhau, đặc điểm sinh trưởng, phát triển tạo thể nấm C militaris thống kê Bảng 3.2 hình ảnh thu thập trình nghiên cứu trình bày Hình 3.2 Bảng 3.2: Ảnh hưởng hàm lượng chất đến phát triển thể Thời Công thức môi trường gian Thời Kích thước hệ sợi gian thể trung nấm xuất ăn lan kín giá thể thể (ngày) (ngày) Sinh Đặc điểm thể bình khối thể (g/hộp) Chiều Đường dài kính (mm) (mm) 20 Sau 30 Sau 45 Quả GT1 GT2 15 20 25 ± 35 ± 1,0 ± 0,3 3,0 0,3 40 ± 40 ± 1,5 ± 0,3 1,5 0,3 nấm 20 thể phát nấm mảnh, triển nhanh cao vừa mọc thưa, phải, màu màu vàng vàng Quả thể Quả thể nấm mọc nấm to, thưa, cao vừa tương đối phải, mọc chậm phát dày, màu triển, màu vàng cam vàng cam Quả thể Quả thể mọc GT3 thể Quả dày, nấm to vừa 41 ± 45 ± 1,8 ± tương đối phải, mọc 0,2 2,0 0,2 chậm phát dày, triển, màu màu vàng vàng cam cam Dựa vào Hình 3.2 kết nghiên cứu Bảng 3.2 cho thấy cơng thức tối ưu thí nghiệm công thứ GT3 với 60g gạo lức cho sinh khối thể tươi đạt 41,2g/hộp, cơng thức GT2 với 40g gạo lức cho sinh khối thể tươi 40,3g/hộp Cuối công thức GT1 với hàm lượng 20g gạo lức cho thể phát triển với 25,3g/hộp Giải thích cho điều hàm lượng chất dịch dinh dưỡng nên đủ cho thể phát triển nhanh vào thời gian đầu (Hình 3.2 A) hệ sợi dễ dàng ăn lan kín bề mặt giá thể với thời gian ngắn nhất, sau hàm lượng chất dinh dưỡng nên tốc độ phát triển thể chậm lại phát triển thêm chiều cao nên thể cơng thức GT1 có chiều cao đường kính lại phát triển công thức GT2 GT3 21 Cơng thức GT2 GT3 có thời gian hệ sợi ăn lan kín hộp mơi trường xuất thể, suất gần Thời gian đầu cơng thức GT2 GT3 có thời gian hệ sợi ăn lan kín mơi trường muộn, hàm lượng chất cao khiến hệ sợi thời gian ăn lan kín khơng nhanh công thức GT1, ngược lại thể cơng thức phát triển dày, thể có kích thước lớn tương đối lớn màu đẹp Nguyên nhân hàm lượng chất dịch dinh dưỡng bổ sung vào mơi trường ảnh hưởng tới kích thước thể suất Quả thể phát triển so với cơng thức GT1 hàm lượng chất dịch dinh dưỡng nhiều nên đủ cung cấp cho thể phát triển đến thu hoạch Vì cần lựa chọn cơng thức hàm lượng chất thích hợp cho thể đẹp, suất tốt, mà lại giảm chi phí ngun liệu đầu vào Từ công thức trên, nhận thấy cơng thức GT2 thích hợp đưa vào sản xuất thực tế thích hợp tiết kiệm chi phí nguyên liệu mà sản lượng lại không công thức GT3 A B 22 C D E F Hình 3.2: Ảnh hưởng hàm lượng chất đến phát triển thể A, B: Sự phát triển thể nấm nuôi cấy môi trường GT1 sau 25 ngày (A) 45 ngày (B) C, D: Sự phát triển thể nấm nuôi cấy môi trường GT2 sau 25 ngày (C) 45 ngày (D) E, F: Sự phát triển thể nấm nuôi cấy môi trường GT3 sau 25 ngày (E) 45 ngày (F) 3.3 Ảnh hưởng thời gian ủ tối tới phát triển thể Nghiên cứu sử dụng loại chất chủ yếu 40g gạo lức + 40 ml dịch dinh dưỡng (gồm 5g pepton, 5g cao nấm men, 0,1g Vitamin B1, 1g MgSO4, 0,5g KH2PO4, 30g glucose) tỷ lệ tối ưu nghiên cứu thí nghiệm xác định ảnh hưởng hàm lượng chất Sau bọc kín hộp đưa tiến hành hấp khử trùng 45 phút với 121ºC, để nguội tự nhiên tiến hành cấy 15ml dịch 23 giống Đưa tiến hành ủ tối khoảng thời gian khác điều kiện nhiệt độ 20ºC, độ ẩm khoảng 75-80%, từ xác định thời gian ủ tối thích hợp kích thích sợi nấm phát triển, ăn lan bề mặt giá thể tốt Bảng 3.3: Ảnh hưởng thời gian ủ tối tới phát triển thể Công thức Thời gian bắt đầu xuất hệ sợi (ngày) Thời gian bắt đầu xuất thể (ngày) Sinh khối thể (g/hộp) UT1 UT2 UT3 20 15 12 30 ± 26 50 ± 51 ± Hệ sợi phát triển mảnh, ăn lan Sau 12 ngày kín bề mặt có màu vàng, bề mặt hệ sợi Đặc không xốp Hệ sợi ngừng Hệ sợi ngừng phát triển, bề phát triển có mặt hệ sợi màu vàng, bề bơng xốp có mặt hệ sợi màu vàng, bắt xốp nhẹ đầu hình thành thể điểm hệ sợi Sau 24 ngày Quả thể bắt đầu Quả thể bắt Quả thể bắt đầu hình thành đầu phát triển phát triển Quả thể nấm Quả thể nấm Quả thể nấm to mảnh, thấp, màu mảnh, cao, vừa phải , cao, vàng cam màu vàng cam màu vàng cam thể Sau 65 ngày Kết nghiên cứu trình bày Bảng 3.3 Hình 3.3, Hình 3.4 cho thấy: Thời gian ủ tối thích hợp ngày (cơng thức UT3) thời gian hệ sợi ăn lan kín, có màu trắng hệ sợi có độ xốp quan sát bẳng cảm quan mắt hệ sợi nấm phát triển khỏe (Hình 3.3) Bằng chứng 24 sau 65 ngày kể từ đưa hộp ni cấy kích sáng thể nấm mọc dày, có chiều dài, kích thước tương đối (Hình 3.4) Ủ tối ngày sau chuyển sang kích sáng (cơng thức UT1) thể nấm có kích thước ngắn thể mảnh; giải thích cho lý thể phát triển ủ tối ngày hệ sợi nấm yếu, hệ sợi chưa bắt đầu ăn lan kín bề mặt nên chuyển hộp ni cấy kích sáng xảy tượng thể phát triển Đối với thời gian ủ tối ngày (cơng thức UT2) hệ sợi có ăn lan kín song hệ sợi chưa ăn lan kín hết bề mặt giá thể, bề mặt hệ sợi bắt đầu có độ xốp, thời gian chưa phù hợp chuyển sang giai đoạn kích sáng, nên sau 65 ngày thể công thức UT2 có phần phát triển cơng thức UT3 Vì cơng thức ủ tối thích hợp cho sản xuất công thức UT3 với thời gian ủ tối ngày cho thể mọc dày, màu đẹp, suất tốt trung bình 50,3g/hộp Ủ tối ngày Ủ tối ngày Ủ tối ngày Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian ủ tối đến phát triển hệ sợi nấm sau 12 ngày chuyển từ nấm tối ni ngồi sáng 25 Ủ tối ngày Ủ tối ngày Ủ tối ngày Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian ủ tối đến phát triển thể nấm sau 65 ngày chuyển từ nấm tối ni ngồi sáng 26 Phần KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu nghiên cứu tối ưu quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris rút số kết luận sau: - Tốc độ lắc kích thích tạo cầu nấm thích hợp giai đoạn nhân giống cấp II ni lắc 150 vịng/phút, cho mật độ cầu nấm cao, cầu nấm trắng, kích thước cầu nấm đồng thích hợp để ni cấy - Mơi trường chất gạo lức có hàm lượng phù hợp 40g gạo lức + 40 ml dịch dinh dưỡng + 20ml dịch giống, cho thể mọc dày, màu đẹp, suất tốt trung bình 40,3 g/hộp - Thời gian ủ tối thích hợp sau ngày, hệ sợi nấm trắng khỏe, bề mặt hệ sợi xốp, hệ sợi nấm ăn lan Quả thể thu hoạch cho suất tốt trung bình 50,3g/hộp 4.2 Tồn - Chưa tiến hành nghiên cứu thiết kế thí nghiệm nhiều loại chất khác - Thời gian cấy chuyển lưu giữ giống vi sinh vật 30-45 ngày nên chưa thực nghiên cứu phân lập, hóa giống thích nghi mơi trường 4.3 Kiến nghị - Nhà trường Viện tạo điều kiện để nghiên cứu tiếp tục thực hoàn thiện đề tài nghiên cứu thời gian tới 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lưu Tham Mưu (2009), Đông trùng hạ thảo, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trương Phi Hùng, Lê Thị Thơ, Nguyễn Kim Chi (2013) Một số kết nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Lâm Đồng Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghệ phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, 51-55 Phạm Quang Thu (2015) Nghiên cứu xây dựng quy trình ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L :Fr.) Link có giá trị dược liệu thương mại cao Báo cáo kết nghiên cứu Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, 45-48 Phạm Quang Thu, 2009 Điều tra phát nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat Phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nông thôn, số 4, 91-94 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni Berk vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, số 6, 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2009) Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link Kết nghiên cứu khoa học công nghệ Lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010, 400-408 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009) Phát nấm Nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn số 9, 67-70 Phạm Thị Thuỳ (2010) Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức cho người Báo cáo Hội thảo Quốc gia bệnh hại thực vật Việt Nam Nxb Nông nghiệp, 224-231 28 Tài liệu Tiếng Anh Das S.K (2009) Production of anti-cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militaris, A Dissertation of Doctor of Engineering, University of Fukui, Japan Effect of freeze drying and hot air drying methods on quality of cordycepin production Faculty of Science, Department of Chemistry and Applied Chemistry, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 192, 03001 (2018) Ying Chang, Kee-Ching Jeng, Kuei-Fen Huang, Ying-Chung Lee, ChienWei Hou, Kuan-Hao Chen, Fu-Yen Cheng, Jiunn-Wang Liao and Yuh-Shuen Chen (2008) Effect of Cordyceps Militaris Supplementation on Sperm Production, Sperm Motility and Hormones in Sprague-Dawley Rats The American Journal of Chinese Medicine, Vol 36, No 05, pp 849-859 Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochemical Engineering Journal, 33, pp 193–201 Sung J.H., Jones N.L.H., Sung J.M., Luangsa-ard J.J., Shrestha B., Spatafora J.W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi, Studies in Mcology, 57, pp.5–59 Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A., (2008) Dictionary of the Fungi; CABI PHỤ LỤC 29 Phụ lục 1: Sinh khối tươi 108 mẫu NC hàm lượng chất GT1 Số lần lặp lại 10 11 12 13 14 15 16 17 Tổng 108 GTTB M (gam) 29 29.3 29.5 31 31.3 30.9 30.5 30 30,26 Phụ lục 2: Sinh khối tươi 108 mẫu NC hàm lượng chất GT2 Số lần lặp lại 10 11 12 13 14 15 16 17 Tổng 108 GTTB M (gam) 50.4 51 50 49,8 50.6 50.2 50.5 50.1 50,3 Phụ lục 3: Sinh khối tươi 108 mẫu NC hàm lượng chất GT3 Số lần lặp lại 10 11 12 13 14 15 16 17 Tổng 108 GTTB M (gam) 50 52 52.2 51.5 51.3 50.7 51.3 51 51,2 30 ... việc nuôi cấy nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris phổ biến, để tìm quy trình ni cấy tối ưu cho suất thể cao, chất lượng thể tốt cịn tốn khó Vì vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu tối ưu hóa. .. tối ưu hóa q trình ni cấy tạo thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris? ?? thực với mục tiêu xác định số điều kiện thích hợp cho ni cấy nhân tạo nấm Cordyceps militaris đạt suất thể cao, góp... từ nấm phục vụ nghiên cứu điều trị bệnh từ Cordyceps militaris vấn đề quan tâm 1.2 Nghiên cứu nuôi nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps military 1.2.1 Trong nước 10 Ở Việt Nam, việc nghiên