Nghiên cứu nuôi cấy vi tảo haematococcus pluvialis bằng hệ thống bioreactor và thu nhận astaxanthin

MẪU 14KHCN BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ SƠ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG NĂM 2016 Tên đề tài NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS BẰNG HỆ THỐNG BIOREACTOR VÀ THU NHẬN ASTAXANTHIN Mã số đề tài IUH VSH1617 Chủ nhiệm đề tài Trịnh Ngọc Nam Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Hồ sơ bao gồm Bản tự nhận xét kết quả thực hiện đề tài NCKH cấp Trƣờng Báo cáo tổng kết kết quả thực hiện đề tài NCKH cấp.

BỘ CÔNG THƢƠNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HỒ SƠ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG NĂM 2016 Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS BẰNG HỆ THỐNG BIOREACTOR VÀ THU NHẬN ASTAXANTHIN Mã số đề tài: IUH.VSH16/17 Chủ nhiệm đề tài: Trịnh Ngọc Nam Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Hồ sơ bao gồm: - Bản tự nhận xét kết thực đề tài NCKH cấp Trƣờng - Báo cáo tổng kết kết thực đề tài NCKH cấp Trƣờng - Báo cáo chi tiết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trƣờng - Các phụ lục định phê duyệt đề tài minh chứng Tp Hồ Chí Minh - 2017 BỘ CƠNG THƢƠNG CỘNG H A TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP HCM Đ c Viện Công nghệ sinh học thực phẩm HỘI CHỦ NGH A VIỆT NAM p – Tự Do – H nh Ph c Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 BẢN TỰ NHẬN ÉT VỀ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis hệ thống bioreactor thu nhận astaxanthin Mã số: IUH.VSH16/17 Chủ nhiệm đề tài: Trịnh Ngọc Nam Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Cơng nghệ sinh học thực phẩm Thời gian thực (Bắt đầu – Kết thúc): 6/2016 đến 6/2017 Tổng kinh phí thực đề tài: 53 triệu đồng Trong đó, kinh phí từ NSNN: 50 triệu đồng Nhận xét kết thực Đề tài so với Hợp đồng: 7.1/ Về mức độ hồn thành khối lƣợng cơng việc: - Đã hồn thành đầy đủ nội dung cơng việc đề tài với sản phẩm đăng ký - Sản phẩm dạng 1: bột vi tảo Haematococcus pluvialis khơ (độ ẩm 1,5 % sinh khối khô vi tảo * Mục tiêu cụ thể - Xác định đƣợc thông số phù hợp cho nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis giai đoạn gia tăng sinh khối giai đoạn tích luỹ astaxanthin thể tích ni cấy nhỏ hệ thống bioreactor - Xác định đƣợc phƣơng pháp quy trình để tách chiết dầu từ vi tảo Haematococcus pluvialis chứa astaxanthin phù hợp cho mục đích sử dụng lĩnh vực chế biến thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp xác định môi trƣờng nuôi cấy vi tảo H pluvialis Vi tảo đƣợc nuôi cấy môi trƣờng Bold Basal, OHM, RM môi trƣờng WC điều kiện ni cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml môi trƣờng Mật độ vi tảo bổ sung vào nghiệm thức môi trƣờng ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Bình ni cấy đƣợc đặt điều kiện cƣờng độ chiếu sáng klux, chu kỳ chiếu sáng 16 sáng : tối, nhiệt độ 25±0,5oC, tốc độ sục khí lít/phút Sự sinh trƣởng vi tảo H pluvialis môi trƣờng đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đo OD bƣớc song 680nm phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào buồng đếm vi sinh vật, sau ngày mật độ tảo không tiếp tục tăng trog môi trƣờng nuôi cấy Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng đến sinh trƣởng tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy điều kiện ni cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml môi trƣờng Các nghiệm thức chiếu sáng đƣợc sử dụng bao gồm: klux ánh sáng trắng, klux ánh sáng trắng, klux ánh sáng trắng Thời gian chiếu sáng đƣợc trì 16:8 Sự sinh trƣởng vi tảo đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD680 sau ngày nuôi cấy suốt mẻ nuôi 24 ngày Kết thúc thời gian nuôi cấy, sinh khối vi tảo từ 10 ml dịch nuôi đƣợc thu nhận cách ly tâm phút tốc độ 12.000 rpm Sinh khối vi tảo đƣợc ủ với 1,5 ml dung dịch DMSO 75oC 15 phút Sau thời gian ủ, tế bào dung dịch đƣợc phân tách ly tâm Cặn tế bào đƣợc tiếp tục tách chiết lặp lại với DMSO Hàm lƣợng chlorophyll a, b astaxanthin dịch chiết đƣợc xác định phƣơng pháp OD bƣớc sóng 665, 645, 630 480 nm (Solovchenko cộng sự, 2010) 3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn nitrate đến tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy điều kiện nuôi cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml môi trƣờng đƣợc đặt điều kiện nhiệt độ chế độ chiếu sáng thích hợp Sau 14 ngày nuôi cấy, sinh khối vi tảo đƣợc thu nhận chuyển sang nuôi cấy môi trƣờng đƣợc loại bỏ ½ hồn tồn nguồn nitrate với áp suất thẩm thấu đƣợc trì việc dùng KCl thay cho nguồn dinh dƣỡng chứa nitrate Q trình ni cấy đƣợc trì thời gian 10 ngày Nghiệm thức đối chứng môi trƣờng nuôi cấy giống nhƣ ban đầu Sau thời gian này, sinh khối vi tảo từ 10 ml dịch nuôi đƣợc thu nhận cách ly tâm phút tốc độ 12.000 rpm Sinh khối vi tảo đƣợc ủ với 1,5 ml dung dịch DMSO 75oC 15 phút Sau thời gian ủ, tế bào dung dịch đƣợc phân tách ly tâm Cặn tế bào đƣợc tiếp tục tách chiết lặp lại với DMSO Hàm lƣợng chlorophyll a, b astaxanthin dịch chiết đƣợc xác định phƣơng pháp OD bƣớc sóng 665, 645, 630 480 nm (Solovchenko et al., 2010) Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng tốc đ sục khí CO2 đến tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy bình ni cấy tích lít hệ thống bioreactor chứa lít mơi trƣờng dinh dƣỡng với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng đƣợc trì mức phù hợp Môi trƣờng nuôi đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng tốc độ sục khí CO2 đến sinh trƣởng vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor bao gồm: sục khơng khí, sục khơng khí kết hợp sục khí CO2 với lƣợng 20 ml CO2/phút, 40 ml CO2/phút, 60 ml CO2/phút Sự sinh trƣởng vi tảo nghiệm thức nuôi cấy khác đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD sau ngày nuôi cấy Kết thúc mẻ nuôi 10 ngày, toàn sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô nhiệt độ 40oC 48 3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng pH môi trƣờng ni cấy đến tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor Vi tảo H pluvialis đƣợc ni cấy bình ni cấy tích lít hệ thống bioreactor chứa lít môi trƣờng dinh dƣỡng với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng, tốc độ sục khí đƣợc trì mức phù hợp Môi trƣờng nuôi đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor bao gồm: pH4, pH5, pH6, pH7, pH8 Ở nghiệm thức, pH dịch nuôi đƣợc cố định nhờ bổ sung dung dịch HCl 0,1N hay NaOH 0,1N hệ thống bơm nhu động cảm biến tự động hệ thống bioreactor Sự sinh trƣởng vi tảo nghiệm thức nuôi cấy khác đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD sau ngày ni cấy Kết thúc mẻ ni 10 ngày, tồn sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô nhiệt độ 40oC 48 Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo Lipid chứa astaxanthin tế bào vi tảo đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp chiết ƣớt, khô sử dụng loại dung môi hữu không độc hại bao gồm: dimethyl carbonate, dimethyl ether lỏng, dầu đậu nành (có vai trị nhƣ dung mơi) dƣới hỗ trợ sóng siêu âm Sinh khối vi tảo thu nhận từ hệ thống bioreactor đƣợc lọc giấy lọc GF/C Sinh khối vi tảo có độ ẩm khoảng 82-90% đƣợc sử dụng để tách chiết astaxanthin Phƣơng pháp tách chiết dimethyl ether (DME) đƣợc thực theo hƣớng dẫn Boonnoun et al (2014) Sinh khối ƣớt vi tảo đƣợc đặt vào cột tách chiết, bên bên dƣới đƣợc phủ lớp hạt thuỷ tinh có kích thƣớc 0,77-0,99 mm Dòng DME đƣợc bơm qua cột với tốc độ 10 cm3/phút nhiệt độ 20oC áp suất chiết cột đƣợc trì 0,52 MPa Sau qua cột, DME đƣợc cho bay hơi, lipid chứa astaxanthin đƣợc thu hồi Hiệu suất tách chiết lipid đƣợc xác định sau sản phẩm tách chiết đƣợc sấy loại nƣớc 40oC Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin sử dụng dung mơi ethanol : ethyl acetate có hỗ trợ sóng siêu âm đƣợc thực theo mơ tả Zou et al (2013) Sinh khối vi tảo đƣợc hoà vào dung dịch ethanol 48% pha ethyl acetate theo tỉ lệ sinh khối tảo : 20 thể tích dung dịch chiết Hỗn hợp đƣợc đặt nhiệt độ phịng Q trình tách chiết đƣợc thực bể siêu âm có cơng suất 200W, tần số 40 kHz, 41oC 20 phút Sau xử lý siêu âm, hỗn hợp đƣợc ly tâm tốc độ 8500 rpm 10 phút để thu dịch Cặn đƣợc tách chiết lặp lại Hiệu suất tách chiết đƣợc xác định sau hỗn hợp hai lần chiết đƣợc sấy để loại nƣớc Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin dầu đậu nành đƣợc thực theo mô tả Sachindra Mahendrakar (2005) Sinh khối tảo khô đƣợc trộn vào dầu đậu nành với tỉ lệ 1:2 (w/v) đƣợc ủ bể ổn nhiệt 70oC 2,5 Hỗn hợp đƣợc lọc qua vải lọc ly tâm tốc độ 4500 rpm 10 phút để tách cặn Lớp dầu chứa sắc tố dịch đƣợc thu nhận phễu chiết Phƣơng pháp phân tích astaxanthin thu nh n từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor phƣơng pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng cao áp Astaxanthin có lipid thu nhận từ sinh khối vi tảo tách chiết theo phƣơng pháp khác đƣợc định lƣợng phƣơng pháp sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC) phƣơng pháp HPLC Với phƣơng pháp TLC, astaxanthin đƣợc chấm lên sắc ký Merck TLC Plate Dung môi triển khai hexan:chloroform:benzene theo tỉ lệ 10:20:1 (v:v:v) Astaxanthin mẫu đƣợc xác định thông qua so sánh Rf với astaxanthin chuẩn Với phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áo (HPLC) đƣợc thực thiết bị HPLC với cột 150 × 4.5-mm Prontosil RP C-18 (Knauer, Berlin, Đức) trì nhiệt độ 25oC detector Waters e2695 DAD (Waters, Milford, MD, USA) Pha động hỗn hợp acetonitrile:nƣớc:ethyl acetate với tỉ lệ 98:2:0 (trong phút), 40:0:60 (trong 10 phút), 0:0:100 C (trong phút) (% thể tích) Tốc độ dịng ml/phút thể tích tiêm 20 μl Sự diện hàm lƣợng astaxanthin đƣợc xác định so sánh peak diện tích peak với astaxanthin chuẩn Phƣơng pháp thu nh n b t tảo Haematococcus pluvialis phƣơng pháp sấy phun Bột vi tảo H pluvialis đƣợc thu nhận phƣơng pháp sấy phun Sinh khối vi tảo H pluvialis thu nhận từ hệ thống nuôi cấy bioreactor đƣợc lọc giấy lọc GF/C Cặn lọc đƣợc rửa nhiều lần nƣớc cất để làm dịch môi trƣờng ni Sinh khối tảo đƣợc hồ vào nƣớc cất chuẩn bị cho trình sấy phun Tiến hành khảo sát thơng số ảnh hƣởng đến q trình sấy phun bao gồm: tỉ lệ pha loãng sinh khối tảo, nhiệt độ đầu vào, áp suất khí nén, tốc độ bơm nhập liệu Từ kết nghiên cứu, xác định thông số phù hợp để thu nhận bột vi tảo qua trình sấy phun Phƣơng pháp khảo sát ho t tính kháng oxy hố astaxanthin thu nh n từ vi tảo H pluviali Hiệu kháng oxy hoá astaxanthin thu nhận vi tảo H pluvialis đƣợc đánh giá thông qua phƣơng pháp xác định lực khử phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH Phƣơng pháp đánh giá lực khử đƣợc thực theo mô tả Yuan et al (2013) Phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH tiến hành theo Sun Lee (2003) Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy vi tảo H pluvialis Mật độ tảo bổ sung vào môi trƣờng nuôi ban đầu đạt 2x105 tế bào/ml Trong môi trƣờng thử nghiệm, môi trƣờng RM Walne, vi tảo H pluvialis đạt hiệu tăng trƣởng cao so với môi trƣờng Bold’s Basal, OHM f/2 Guillard Trên hai môi trƣờng RM Walne, mật độ tảo tăng nhanh ngày đầu mẻ nuôi cấy Sự sinh trƣờng tiếp tục trì đạt cực đại ngày thứ 18, mật độ lần lƣợt 6,97x105 tế bào/ml môi trƣờng RM 6,57x105 tế bào/ml môi trƣờng Walne Sự sinh trƣởng tảo hai môi trƣờng giảm dần sau ngày thứ 20 Ở môi trƣờng Bold’s Basal OHM, tảo tăng chậm trì sinh trƣởng ngày thứ 16 đạt mật độ tƣơng ứng 5,12x105 4,14x105 tế bào/mL Sự sinh trƣởng tảo thấp môi trƣờng f/2 Guillard Mật độ tảo tăng chậm sinh trƣởng trì đến ngày thứ 14 mẻ ni 4.2 Ảnh hƣởng cƣờng đ ánh sáng đến sinh trƣởng tích lũy astaxanthin Dƣới chế độ chiếu sáng khác nhau, có khác biệt sinh trƣởng tích lũy astaxanthin tế bào vi tảo H pluvialis Tảo tiếp tục tăng trƣởng gia tăng số lƣợng tế bào đƣợc đặt cƣờng độ chiếu sáng klux Tuy nhiên, cƣờng độ ánh sáng klux, sinh trƣởng tảo hầu nhƣ không đáng kể Ở hai chế độ chiếu sáng klux cho thấy có gia tăng rõ rệt hàm lƣợng astaxanthin tích lũy tế bào tảo so với chế độ chiếu sáng klux Trong đó, hàm lƣợng astaxanthin tích lũy cao cƣờng độ ánh sáng klux đạt 132±7,8 μg/lít sau 10 ngày ni cấy Hàm lƣợng đạt 105±8,9 μg/lít cƣờng độ ánh sáng klux Ở cƣờng độ klux, có gia tăng nhẹ hàm lƣợng astaxanthin, nhiên, hàm lƣợng suy giảm dần thời gian nuôi cấy kéo dài MỞ ĐẦU Astaxanthin sắc tố thuộc nhóm keto-carotenoid diện nhiều loài thuỷ hải sản vi tảo.Chúng có số hoạt tính sinh học quan trọng bao gồm hoạt tính chống oxi hóa, tăng cƣờng miễn dịch, chống ung thƣ, giúp giảm q trình peroxide hố lipid, bảo vệ cấu trúc màng tế bào, trì trạng thái oxy hoá khử ty thể Hiện nay, Astaxanthin sử dụng đƣợc thu nhận từ nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm loại thuỷ sản (vỏ tôm, cá hồi), nấm men, vi tảo từ tổng hợp hoá học, nhƣng chủ yếu astaxanthin thƣơng mại sản phẩm tổng hợp hóa học Nhu cầu sử dụng sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên ngày đƣợc quan tâm trọng.đồng thời giá thành sản phẩm tổng hợp nhân tạo cao phải nhập nguyên liệu từ nƣớc nên việc tìm nguồn astaxanthin từ tự nhiên đƣợc đặt nhằm giải vấn đề cấp thiết Một sinh vật tích lũy astaxanthin nhiều vi tảo lục Haematococcus pluvialis đƣợc xem đối tƣợng tiềm Đây loại tảo lục, nƣớc ngọt, đơn bào, sinh sản vơ tính cách phân đơi, có khả di động Nghiên cứu sản xuất astaxanthin từ H.pluvialis đƣợc đặc biệt quan tâm astaxanthin tích luỹ sinh khối cao (Aflalo et al., 2007) Sự tổng hợp astaxanthin H pluvialis liên quan đến trình giảm ngừng sinh trƣởng chuyển trạng thái tế bào từ dạng sinh dƣỡng sang dạng bào xác (Tocquin et al., 2012) Mặc dù tính khả thi công nghệ nuôi trồng pha cho sản xuất astaxanthin đƣợc xác định nhƣng quy trình phổ biến đƣợc áp dụng công nghệ nuôi cấy hai pha, tách biệt pha sản xuất sinh khối pha tích lũy astaxanthin (Del Rio et al., 2008) Sự tích lũy astaxanthin đƣợc cảm ứng điều kiện môi trƣờng khác nhau, mật độ vi tảo H pluvialis cao đạt đƣợc cách tối ƣu môi trƣờng điều kiện nuôi cấy Bên cạnh đó, vi tảo H pluvialis có tốc độ sinh trƣởng thấp tế bào sinh dƣỡng dễ dàng chuyển sang dạng bào xác tích lũy astaxanthin điều kiện mơi trƣờng khơng thuận lợi Vì vậy, việc ni cấy vi tảo H pluvialis mật độ cao thách thức lớn Tại Việt Nam, vi tảo lục H pluvialis đối tƣợng nghiên cứu tƣơng đối Chƣa có cơng trình nghiên cứu đầy đủ đối tƣợng Nhƣ vậy, việc “Nghiên cứu nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis hệ thống bioreactor thu nh n astaxanthin” điều kiện nuôi cấy, thu nhận sinh khối tảo H pluvialis kỹ thuật tách chiết astaxanthin hiệu an tồn có tính cấp thiết giá trị ứng dụng lớn Việt Nam Việc sản xuất astaxanthin nƣớc giúp giải vấn đề phụ thuộc nguồn nguyên liệu nhập từ nƣớc ngồi, thúc đẩy ngành cơng nghiệp chế biến sản phẩm thực phẩm dƣợc phẩm có thành phần astaxanthin, giảm giá thành sản phẩm Đề tài đƣợc thực nhằm mục tiêu: * Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis hệ thuống bioreactor tách chiết astaxanthin để thu nhận đƣợc astaxanthin chiếm tỉ lệ >1,5 % sinh khối khô vi tảo * Mục tiêu cụ thể: - Xác định đƣợc thông số phù hợp cho nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis giai đoạn gia tăng sinh khối giai đoạn tích luỹ astaxanthin thể tích ni cấy nhỏ hệ thống bioreactor - Xác định đƣợc phƣơng pháp quy trình để tách chiết dầu từ vi tảo Haematococcus pluvialis chứa astaxanthin phù hợp cho mục đích sử dụng lĩnh vực chế biến thực phẩm thức ăn chăn nuôi Các n i dung thực đề tài bao gồm: - Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy cho sinh trƣởng gia tăng sinh khối vi tảo thể tích ni cấy nhỏ 250 ml - Nghiên cứu ảnh hƣởng cƣờng độ chiếu sáng đến gia tăng sinh khối tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis thể tích ni cấy nhỏ 250 ml - Nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng nitrate môi trƣờng nuôi cấy đến tích luỹ astaxanthin sinh khối vi tảo H pluvialis thể tích ni cấy nhỏ 250 ml - Nghiên cứu ảnh hƣởng tốc độ sục khí CO2 đến sinh trƣởng gia tăng sinh khối vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor - Nghiên cứu ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến gia tăng sinh khối vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor - Nghiên cứu hệ dung môi điều kiện tách chiết chiết dầu từ vi tảo H pluvialis chứa astaxanthin - Phân tích astaxanthin thu nhận từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor phƣơng pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng cao áp - Nghiên cứu thu nhận bột tảo H pluvialis phƣơng pháp sấy phun - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hố astaxanthin thu nhận từ sinh khối tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor - Xử lý số liệu viết báo cáo tổng kết đề tài, viết báo khoa học CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI IỆU 1.1 Tổng quan astaxanthin Astaxanthin sắc tố thuộc nhóm keto-carotenoid diện nhiều loài thuỷ hải sản vi tảo Đƣợc đánh giá nhƣ siêu vitamin E, astaxanthin có hiệu kháng oxy hố gấp 150 lần anthocyanin gấp 1000 lần vitamin E (Sarada et al., 2006; Suh,Joo Lee, 2006) Astaxanthin có hoạt tính mạnh so với loại carotenoid khác trình loại bỏ gốc tự nhƣ HO•, ROO•, ONOO-… giúp giảm q trình peroxide hố lipid, bảo vệ cấu trúc màng tế bào, trì trạng thái oxy hoá khử ty thể Hiệu kháng oxy hoá astaxanthin đặc điểm cấu trúc phân tử với chuỗi 13 liên kết đôi liên hợp, nhóm hydroxyl nhóm keto bên vịng ionone tạo tính phân cực cao cho phân tử (Guerin,Huntley Olaizola, 2003; Tanaka et al., 1995) Trong y học, astaxanthin đƣợc sử dụng để ổn định huyết áp, giảm lipid máu, ngăn ngừa bệnh tim mạch, ngăn chặn làm chậm phát triển ung thƣ, tăng cƣờng hệ thống miễn dịch kích thích sản sinh kháng thể, tăng số lƣợng tế bào bạch cầu T, bảo vệ da mắt khỏi tác động tia UV, làm giảm biến chứng tiểu đƣờng… (Lorenz Cysewski, 2000; Miki, 1991; Ranjbar et al., 2008) Astaxanthin sử dụng đƣợc thu nhận từ nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên, bao gồm loại thuỷ sản (vỏ tôm, cá hồi), nấm men, vi tảo, từ tổng hợp hoá học Trong nguyên liệu tự nhiên, astaxanthin tồn nhiều dạng, gồm 3S-3’S, 3R-3’S 3R-3’R, dạng có hoạt tính sinh học Ở số loại vi tảo, hàm lƣợng astaxanthin chiếm 2-3% trọng lƣợng khô, gấp 5000 lần so với cá hồi, gấp 20-50 lần nấm men, chủ yếu tồn dạng 3S-3’S (Bon,Leathers Jayaswal, 1997; Chumpolkulwong et al., 1997) Astaxanthin chiết xuất từ tảo đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ phụ gia bổ sung vào thực phẩm cho ngƣời nhiều quốc gia nhƣ Mỹ, Nhật, nƣớc châu Âu nhƣ nƣớc châu Á khác (Hata et al., 2001) Tại Việt Nam, astaxanthin đƣợc nhiều công ty dƣợc sử dụng điều chế thành viên nang thực phẩm chức năng, loại mỹ phẩm cao cấp chăm sóc bảo vệ da, chống lão hoá làm phụ gia thực phẩm bổ sung vào thức ăn chăn ni Việt Nam có nguồn tài nguyên tảo vi tảo phong phú với 2000 lồi, có 651 lồi vi tảo đƣợc xác định Một số nghiên cứu nuôi trồng vi tảo có khả tổn hợp astaxanthin đƣợc tiến hành Việt Nam nhƣng dừng lại mức khảo sát vòng đời vi tảo, ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng đến tổng hợp astaxanthin (Đặng Diễm Hồng et al., 2010; Đặng Diễm Hồng et al., 2012; Đinh Đức Hoàng et al., 2011; Lê Thị Thơm et al., 2013) Chƣa có nghiên cứu đề xuất quy trình ni vi tảo tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo phục vụ cho nhu cầu sản xuất Nguồn astaxanthin sử dụng Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập với giá thành cao (2.000, 2.500 7.000 USD/kg astaxanthin có nguồn gốc tƣơng ứng từ tổng hợp hoá học, nấm men từ sinh khối vi tảo) 1.2 Tổng quan sản xuất astaxanthin từ vi tảo Haematococcus pluvialis Nhiều loài vi tảo đƣợc đánh giá có khả sản xuất astaxanthin nhƣ Haematococcus pluvialis, Chlorella zofingiensis, Chlorella sorokiniana, Galdieria sulphuraria, Tetraselmis sp… Trong số đó, vi tảo lục H pluvialis đƣợc xem đối tƣợng tiềm Đây loại tảo lục, nƣớc ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính cách phân đơi, có khả di động Nghiên cứu sản xuất astaxanthin từ H pluvialis đƣợc đặc biệt quan tâm hàm lƣợng astaxanthin tích luỹ sinh khối cao (Aflalo et al., 2007) Tuy nhiên, việc sản xuất astaxanthin hiệu từ loài vi tảo cịn gặp nhiều khó khăn chúng có tốc độ sinh trƣởng thấp, chu kỳ sống phức tạp nhạy cảm với thay đổi điều kiện nuôi cấy Hầu hết tế bào vi tảo trì trạng thái sinh dƣỡng, tích lũy khơng tích lũy astaxanthin ni điều kiện thích hợp Tuy nhiên, dƣới điều kiện stress, tế bào chuyển sang dạng bào nang không chuyển động đƣợc kích thích phù hợp tế bào tảo tích lũy lƣợng lớn astaxanthin (Harker,Tsavalos Young, 1996; Hata et al., 2001; Tocquin,Fratamico Franck, 2012) Vì vậy, điều kiện cho tế bào sinh trƣởng tổng hợp astaxanthin khác Hình 1.1 Vịng đời vi tảo lục Haematococcus pluvialis (a) Động bào tử, (b) Dạng tế bào hạt xanh, (c) tế bào hạt xanh với giọt lipid chứa sắc tố đỏ, (d) bào nang, (e) Sinh sản hữu tính kiểu đẳng giao (Chekanov et al., 2014) Mặc dù tính khả thi cơng nghệ ni trồng pha cho sản xuất astaxanthin đƣợc xác định nhƣng quy trình phổ biến đƣợc áp dụng công nghệ nuôi cấy hai pha, tách biệt pha sản xuất sinh khối pha tích lũy astaxanthin (Del Río et al., 2008) Trong quy trình pha, mật độ tế bào vi tảo thu nhận đƣợc thấp Quy trình ni cấy hai pha, pha đầu tảo đƣợc ni cấy điều kiện tối ƣu để đạt đƣợc mật độ tế bào cực đại, sau chuyển tảo vào pha sau với điều kiện thuận lợi cho tích luỹ astaxanthin đƣợc chứng minh hiệu phù hợp để xản xuất astaxanthin quy mô thƣơng mại (Hata et al., 2001) Việc tăng mật độ tế bào vi tảo pha đầu góp phần quan trọng việc nâng cao hiệu sản xuất astaxanthin từ H pluvialis (Suh,Joo Lee, 2006) Sự tích lũy astaxanthin đƣợc cảm ứng điều kiện nhƣ thiếu hụt dinh dƣỡng, photpho, dƣ thừa acetate, cƣờng độ ánh sáng cao bổ sung tiền chất carotenoid khác (Sarada et al., 2006; Wang et al., 2003) Nhƣ vậy, việc xác định rõ ràng pha sinh trƣởng tế bào pha tổng hợp astaxanthin nhƣ điều kiện nuôi cấy pha cần thiết để đạt đƣợc mật độ tế bào hàm lƣợng astaxanthin cao Hình 1.2 Tế bào vi tảo Haematococcus pluvialis giai đoạn sinh trƣởng giai đoạn bào nang tích luỹ astaxanthin (Solovchenko et al., 2010) 1.3 Tổng quan tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo Astaxanthin sử dụng rộng rãi có nguồn gốc chủ yếu từ tổng hợp hoá học từ nguyên liệu tự nhiên Mặc dù chiếm tỉ lệ lớn, astaxanthin tổng hợp hoá học gần bị hạn chế sử dụng sản phẩm thực phẩm thuốc hoạt tính sinh học thấp tính an tồn (Seabra Pedrosa, 2010) Vì vậy, astaxanthin tách chiết từ nguyên liệu tự nhiên ngày đƣợc ý Một thách thức trình tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo, có chất lƣợng phù hợp cho mục làm phụ gia thực phẩm, tế bào vi tảo có vách polysaccharide dầy khó phá vỡ, astaxanthin hợp chất màu không tan nƣớc Nhiều phƣơng pháp tách chiết đƣợc áp dụng tác giả nƣớc ngồi để thu đƣợc astaxanthin dùng cho nhiều mục đích khác Sarada et al (2006) tách chiết astaxanthin từ tế bào vi tảo H pluvialis với nhiều loại dung môi khác tiền xử lý vi tảo với nhiều loại acid hữu vô nhiệt độ 70oC Kết cho thấy tiền xử lý với acid HCl giúp tăng hiệu suất tách chiết đến 8694% Kobayashi et al (1992) tiền xử lý tế bào vi tảo H pluvialis với aceton 40% (v/v) thời gian phút 80oC sau thuỷ giải enzyme thu đƣợc astaxanthin với hiệu suất 70% Kang Sim (2008) tách chiết astaxantin từ vi tảo H pluvialis dầu thực vật thu đƣợc astaxanthin với hiệu suất 88% Dong et al (2014) áp dụng phƣơng pháp tách chiết khác nhau, gồm kết hợp HCl acetone, hỗn hợp hexan : isopropanol có tỉ lệ 4:6, tách chiết lần lƣợt methanol sau đến acetone, tách chiết dầu thực vật Kết cho thấy việc kết hợp HCl acetone cho hiệu suất tách chiết cao Machmudah et al (2006) tách chiết astaxanthin dùng CO2 siêu tới hạn kết hợp với bổ sung ethanol giúp thu đƣợc astaxanthin với hiệu suất 80,6% Với việc dùng CO2 siêu tới hạn, astaxanthin thu nhận đƣợc an tồn, sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt lĩnh vực thực phẩm, nhiêu chi phí phƣơng pháp lại cao so với phƣơng pháp dùng dung môi tách chiết Tại Việt Nam, chƣa có nhiều nghiên cứu việc tách chiết astaxanthin từ vi tảo H pluvialis cho mục đích thƣơng mại, ngoại trừ vài nghiên cứu tác giả Đặng Diễm Hồng et al (2010); Đặng Diễm Hồng et al (2012); Đinh Đức Hoàng et al (2011); Lê Thị Thơm et al (2013) sử dụng dung môi để tách chiết định lƣợng astaxanthin trình nghiên cứu sinh trƣởng vi tảo H pluvialis CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 V t liệu nghiên cứu Chủng tảo nƣớc Haematococcus pluvialis sử dụng nghiên cứu đƣợc cung cấp Viện nghiên cứu ni trồng thuỷ sản (Tp Hồ Chí Minh) Chủng tảo đƣợc nuôi cấy tăng sinh bình tam giác 500ml chứa 200ml mơi trƣờng Bold’s Basal nhiệt độ 25±2oC, cƣờng độ ánh sáng klux với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày, sục khí liên tục với lƣu lƣợng 1,8 lít/phút máy thổi khí AirMac DB8 (AirMac, Đài Loan) Sinh khối vi tảo đƣợc thu nhận sau 10 ngày nuôi cấy tăng sinh cách ly tâm tốc độ 8000 rpm phút sử dụng cho nghiên cứu sau 2.2 Phƣơng pháp xác định môi trƣờng nuôi cấy vi tảo H pluvialis Vi tảo đƣợc nuôi cấy môi trƣờng Bold Basal, OHM, RM môi trƣờng WC điều kiện ni cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml môi trƣờng Mật độ vi tảo bổ sung vào nghiệm thức môi trƣờng ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Bình ni cấy đƣợc đặt điều kiện cƣờng độ chiếu sáng klux, chu kỳ chiếu sáng 16 sáng : tối, nhiệt độ 25±0,5oC, tốc độ sục khí lít/phút Sự sinh trƣởng vi tảo H pluvialis môi trƣờng đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp đo OD bƣớc song 680nm phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào buồng đếm vi sinh vật, sau ngày mật độ tảo không tiếp tục tăng trog môi trƣờng nuôi cấy Dựa vào đƣờng cong sinh trƣởng vi tảo H pluvialis, xác định môi trƣờng phù hợp môi trƣờng thử nghiệm cho sinh trƣởng gia tăng sinh khối vi tảo 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng đến sinh trƣởng tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy điều kiện nuôi cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml mơi trƣờng RM Các nghiệm thức chiếu sáng đƣợc sử dụng bao gồm: klux ánh sáng trắng, klux ánh sáng trắng, klux ánh sáng trắng Thời gian chiếu sáng đƣợc trì 16:8 Sự sinh trƣởng vi tảo đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD680 sau ngày nuôi cấy suốt mẻ nuôi 24 ngày Kết thúc thời gian nuôi cấy, sinh khối vi tảo từ 10 ml dịch nuôi đƣợc thu nhận cách ly tâm phút tốc độ 12.000 rpm Sinh khối vi tảo đƣợc ủ với 1,5 ml dung dịch DMSO 75oC 15 phút Sau thời gian ủ, tế bào dung dịch đƣợc phân tách ly tâm Cặn tế bào đƣợc tiếp tục tách chiết lặp lại với DMSO Hàm lƣợng chlorophyll a, b astaxanthin dịch chiết đƣợc xác định phƣơng pháp OD bƣớc sóng 665, 645, 630 480 nm (Solovchenko et al., 2010) Dựa vào kết thu đƣợc, xác định điều kiện chiếu sáng phù hợp cho sinh trƣởng tích luỹ astaxanthin vi tảo 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn nitrate đến tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy điều kiện ni cấy mẻ, bình tam giác 500ml chứa 250 ml môi trƣờng RM đƣợc đặt điều kiện nhiệt độ chế độ chiếu sáng thích hợp Sau 14 ngày nuôi cấy, sinh khối vi tảo đƣợc thu nhận cách ly tâm tốc độ 8000 rpm phút chuyển sang nuôi cấy mơi trƣờng RM đƣợc loại bỏ ½ hồn tồn nguồn nitrate với áp suất thẩm thấu đƣợc trì việc dùng KCl thay cho nguồn dinh dƣỡng chứa nitrate Q trình ni cấy đƣợc trì thời gian 10 ngày Nghiệm thức đối chứng môi trƣờng nuôi cấy giống nhƣ ban đầu Sau thời gian này, sinh khối vi tảo từ 10 ml dịch nuôi đƣợc thu nhận cách ly tâm phút tốc độ 12.000 rpm Sinh khối vi tảo đƣợc ủ với 1,5 ml dung dịch DMSO 75oC 15 phút Sau thời gian ủ, tế bào dung dịch đƣợc phân tách ly tâm Cặn tế bào đƣợc tiếp tục tách chiết lặp lại với DMSO Hàm lƣợng chlorophyll a, b astaxanthin dịch chiết đƣợc xác định phƣơng pháp OD bƣớc sóng 665, 645, 630 480 nm (Solovchenko et al., 2010) Dựa vào kết thu đƣợc, xác định hàm lƣợng dinh dƣỡng nitrate phù hợp cho tích luỹ astaxanthin vi tảo 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng tốc đ sục khí CO2 đến sinh trƣởng tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor Vi tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy bình ni cấy tích lít hệ thống bioreactor chứa lít mơi trƣờng dinh dƣỡng RM với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng đƣợc trì mức phù hợp Môi trƣờng nuôi đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng tốc độ sục khí CO2 đến sinh trƣởng vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor bao gồm: sục khơng khí, sục khơng khí kết hợp sục khí CO2 với lƣợng 20 ml CO2/phút, 40 ml CO2/phút, 60 ml CO2/phút Sự sinh trƣởng vi tảo nghiệm thức nuôi cấy khác đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD sau ngày nuôi cấy Kết thúc mẻ nuôi 10 ngày, toàn sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô nhiệt độ 40oC 48 Dựa vào kết gia tăng mật độ sinh khối khơ, xác định nghiệm thức sục khí CO2 phù hợp cho sinh trƣởng vi tảo hệ thống bioreactor 10 Hình 2.1 Hệ thống bioreactor sử dụng nghiên cứu để nuôi vi tảo H pluvialis 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng pH môi trƣờng ni cấy đến sinh trƣởng tích luỹ astaxanthin vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor Vi tảo H pluvialis đƣợc ni cấy bình ni cấy tích lít hệ thống bioreactor chứa lít mơi trƣờng dinh dƣỡng RM với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng, tốc độ sục khí đƣợc trì mức phù hợp Mơi trƣờng ni đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng vi tảo H pluvialis hệ thống bioreactor bao gồm: pH4, pH5, pH6, pH7, pH8 Ở nghiệm thức, pH dịch nuôi đƣợc cố định nhờ bổ sung dung dịch HCl 0,1N hay NaOH 0,1N hệ thống bơm nhu động cảm biến tự động hệ thống bioreactor Sự sinh trƣởng vi tảo nghiệm thức nuôi cấy khác đƣợc xác định phƣơng pháp đo OD sau ngày nuôi cấy Kết thúc mẻ nuôi 10 ngày, toàn sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô nhiệt độ 40oC 48 Dựa vào kết gia tăng mật độ sinh khối khô, xác định nghiệm thức pH môi trƣờng phù hợp cho sinh trƣởng vi tảo hệ thống bioreactor 2.7 Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo Lipid chứa astaxanthin tế bào vi tảo đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp chiết ƣớt, khô sử dụng loại dung môi hữu không độc hại bao gồm: dimethyl carbonate, dimethyl ether lỏng, dầu đậu nành (có vai trị nhƣ dung mơi) dƣới hỗ 11 trợ sóng siêu âm Sinh khối vi tảo thu nhận từ hệ thống bioreactor đƣợc lọc giấy lọc GF/C Sinh khối vi tảo có độ ẩm khoảng 82-90% đƣợc sử dụng để tách chiết astaxanthin Phƣơng pháp tách chiết dimethyl ether (DME) đƣợc thực theo hƣớng dẫn Boonnoun et al (2014) Sinh khối ƣớt vi tảo đƣợc đặt vào cột tách chiết, bên bên dƣới đƣợc phủ lớp hạt thuỷ tinh có kích thƣớc 0,77-0,99 mm Dịng DME đƣợc bơm qua cột với tốc độ 10 cm3/phút nhiệt độ 20oC áp suất chiết cột đƣợc trì 0,52 MPa Sau qua cột, DME đƣợc cho bay hơi, lipid chứa astaxanthin đƣợc thu hồi (hình 3) Hiệu suất tách chiết lipid đƣợc xác định sau sản phẩm tách chiết đƣợc sấy loại nƣớc 40oC Hình 2.2 Sơ đồ hệ thống tách chiết astaxanthi dimethyl ether (1) Bể ổn nhiệt, (2) Bình chứa dimethyl ether lỏng, (3) Cột tách chiết, (4) Lớp hạt thuỷ tinh, (5) Sinh khối ƣớt vi tảo, (6) Van hạ áp, (7) Bình chứa sản phẩm Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin sử dụng dung môi ethanol : ethyl acetate có hỗ trợ sóng siêu âm đƣợc thực theo mô tả Zou et al (2013) Sinh khối vi tảo đƣợc hoà vào dung dịch ethanol 48% pha ethyl acetate theo tỉ lệ sinh khối tảo : 20 thể tích dung dịch chiết Hỗn hợp đƣợc đặt nhiệt độ phòng Quá trình tách chiết đƣợc thực bể siêu âm có cơng suất 200W, tần số 40 kHz, 41oC 20 phút Sau xử lý siêu âm, hỗn hợp đƣợc ly tâm tốc độ 8500 rpm 10 phút để thu dịch Cặn đƣợc tách chiết lặp lại Hiệu suất tách chiết đƣợc xác định sau hỗn hợp hai lần chiết đƣợc sấy để loại nƣớc Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin dầu đậu nành đƣợc thực theo mô tả Sachindra Mahendrakar (2005) Sinh khối tảo khô đƣợc trộn vào dầu đậu 12 nành với tỉ lệ 1:2 (w/v) đƣợc ủ bể ổn nhiệt 70oC 2,5 Hỗn hợp đƣợc lọc qua vải lọc ly tâm tốc độ 4500 rpm 10 phút để tách cặn Lớp dầu chứa sắc tố dịch đƣợc thu nhận phễu chiết 2.8 Phƣơng pháp phân tích astaxanthin thu nh n từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ thống bioreactor phƣơng pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng cao áp Astaxanthin có lipid thu nhận từ sinh khối vi tảo tách chiết theo phƣơng pháp khác đƣợc định lƣợng phƣơng pháp sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC) phƣơng pháp HPLC Với phƣơng pháp TLC, astaxanthin đƣợc chấm lên sắc ký Merck TLC Plate Dung môi triển khai hexan:chloroform:benzene theo tỉ lệ 10:20:1 (v:v:v) Astaxanthin mẫu đƣợc xác định thông qua so sánh Rf với astaxanthin chuẩn Với phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áo (HPLC) đƣợc thực thiết bị HPLC với cột 150 × 4.5-mm Prontosil RP C-18 (Knauer, Berlin, Đức) trì nhiệt độ 25oC detector Waters e2695 DAD (Waters, Milford, MD, USA) Pha động hỗn hợp acetonitrile:nƣớc:ethyl acetate với tỉ lệ 98:2:0 (trong phút), 40:0:60 (trong 10 phút), 0:0:100 C (trong phút) (% thể tích) Tốc độ dịng ml/phút thể tích tiêm 20 μl Sự diện hàm lƣợng astaxanthin đƣợc xác định so sánh peak diện tích peak với astaxanthin chuẩn Hiệu suất tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H pluvialis phƣơng pháp kể đƣợc so sánh với phƣơng pháp tách chiết astaxanthin phổ biến dùng acetone Phƣơng pháp khảo sát ho t tính kháng oxy hoá astaxanthin thu nh n từ vi tảo H pluviali Hiệu kháng oxy hoá astaxanthin thu nhận vi tảo H pluvialis đƣợc đánh giá thông qua phƣơng pháp xác định lực khử phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH Phƣơng pháp đánh giá lực khử đƣợc thực theo mô tả Yuan et al (2013) Dịch chiết astaxanthin (1 ml) đƣợc bổ sung 2,5 ml đệm phosphate 0,2M (pH 6,6) ml K3[Fe(CN)6] 1% (w/v) Hỗn hợp đƣợc ủ 50oC 20 phút đƣợc làm lạnh nhanh Hỗn hợp đƣợc bổ sung 2,5 ml trichloroacetic acid 10% (w/v) đƣợc ly tâm tốc độ 3500 rpm 10 phút Sau ly tâm, dịch (2,5 ml) đƣợc thu nhận đƣợc bổ sung 2,5 ml nƣớc cất 0,5 ml FeCl3 0,1% (w/v) Hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ 10 phút đƣợc đo độ hấp thu bƣớc sóng 700 nm với chất chuẩn FeSO4 13 Phƣơng pháp bắt gốc tự DPPH tiến hành theo Sun Lee (2003) Dịch chiết astaxanthin (1,5 ml) đƣợc bổ sung 1,5 ml DPPH 0,1 mM pha ethanol Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tƣơng tự mẫu nhƣng thay DPPH 1,5 ml cồn tuyệt đối vào ống Mẫu kiểm soát chuẩn bị cách làm giống nhƣ mẫu trắng nhƣng thay dịch chiết DPPH Giữ hỗn hợp tối nhiệt độ phòng Sau 30 phút tiến hành đo bƣớc sóng 517nm 10 Phƣơng pháp xử lý số liệu Tất thí nghiệm nghiên cứu đƣợc tiến hành lần lặp lại Số liệu trình bày trung bình cộng lần lặp lại SD Số liệu thu nhận đƣợc từ nghiên cứu đƣợc xử lý thống kê phần mềm Microsoft Excel 2013 14 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy vi tảo H pluvialis Mật độ tảo bổ sung vào môi trƣờng nuôi ban đầu đạt 2x105 tế bào/ml Đƣờng cong sinh trƣởng vi tảo môi trƣờng nuôi cấy đƣợc thể qua hình 3.1 Trong mơi trƣờng thử nghiệm, mơi trƣờng RM Walne, vi tảo H pluvialis đạt hiệu tăng trƣởng cao so với môi trƣờng Bold’s Basal, OHM f/2 Guillard Trên hai môi trƣờng RM Walne, mật độ tảo tăng nhanh ngày đầu mẻ nuôi cấy Sự sinh trƣờng tiếp tục trì đạt cực đại ngày thứ 18, mật độ lần lƣợt 6,97x105 tế bào/ml môi trƣờng RM 6,57x105 tế bào/ml môi trƣờng Walne Sự sinh trƣởng tảo hai môi trƣờng giảm dần sau ngày thứ 20 Ở môi trƣờng Bold’s Basal OHM, tảo tăng chậm trì sinh trƣởng ngày thứ 16 đạt mật độ tƣơng ứng 5,12x105 4,14x105 tế bào/mL Sự sinh trƣởng tảo thấp môi trƣờng f/2 Guillard Mật độ tảo tăng chậm sinh trƣởng trì đến ngày thứ 14 mẻ nuôi Nghiên cứu Imamoglu,Sukan Dalay (2007) sinh trƣởng H pluvialis môi trƣờng RM, BG11, OHM Bold’s Basal nhƣ nghiên cứu Đặng Diễm Hồng et al (2010) môi trƣờng RM, OHM, C BG11 cho thấy sinh trƣởng tốt xảy môi trƣờng RM Mật độ tế bào H pluvialis đạt từ 3,8 x105 đến 9,5 x105 tế bào/ml (Đặng Diễm Hồng et al., 2010; Imamoglu,Sukan Dalay, 2007) Có khác biệt kích thƣớc tế bào vi tảo mơi trƣờng ni cấy (hình 3.2) Trên mơi trƣờng RM mơi trƣờng Walne, tế bào tảo có kích thƣớc lớn, đạt trung bình lần lƣợt 27,6±2,7 μm 25,4±3,5 μm Trên môi trƣờng Bold’s Basal, tế bào tảo có kích thƣớc lớn, đạt trung bình 21,8 μm, nhiên nội chất tế bào vi tảo mơi trƣờng đậm đặc so với mơi trƣờng RM Walne, thể thông qua khối lƣợng khơ sinh khối vi tảo tích lũy thấp sau 22 ngày nuôi cấy (bảng 3.1) Ở môi trƣờng OHM f/2 Guillard, kích thƣớc tế bào tảo nhỏ, trung bình lần lƣợt 16,3±2,2 μm 15,6±3,9 μm Cũng hai môi trƣờng này, qua hệ, kích thƣớc tế bào tảo có xu hƣớng giảm dần Nhƣ vậy, môi trƣờng khảo sát, môi trƣờng RM đƣợc đánh giá phù hợp cho sinh trƣởng vi tảo H pluvialis so với môi trƣờng nuôi cấy khác 15 ... trình nghiên cứu đầy đủ đối tƣợng Nhƣ vậy, vi? ??c ? ?Nghiên cứu nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis hệ thống bioreactor thu nh n astaxanthin? ?? điều kiện nuôi cấy, thu nhận sinh khối tảo H pluvialis. .. TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG NĂM 2016 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS BẰNG HỆ THỐNG BIOREACTOR VÀ THU NHẬN ASTAXANTHIN. .. pluvialis hệ thống bioreactor - Nghiên cứu hệ dung môi điều kiện tách chiết chiết dầu từ vi tảo H pluvialis chứa astaxanthin - Phân tích astaxanthin thu nhận từ sinh khối vi tảo H pluvialis nuôi cấy hệ