Nghiên cứu sự ảnh hưởng của đèn LED lên sự sinh trưởng và tích lũy astaxanthin của Haematococcus pluvialis trên hệ thống nuôi sinh học Twin-layer ở phương nghiêng

NTTU-NCKH-04 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2019 Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis hệ thống nuôi sinh học Twin-layer phương nghiêng Số hợp đồng: 2019.01.53/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: TỊN NỮ THÙY AN Đơn vị cơng tác: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thời gian thực hiện: 04/2019 - 10/2019 TP Hồ Chỉ Minh, ngày tháng năm 2020 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TÓNG QUAN CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Ảnh hưởng loại ánh sáng LED đon sắc đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialis 18 3.2 Ảnh hưởng cúa chế độ phối họp chiếu sáng bang ánh sáng đon sắc 19 3.3 Thí nghiệm khảo sát chu kì sáng tối đèn LED 20 THẢO LUẬN 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 DANH MỤC CÁC BẢNG BIÉU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 1 Ảnh chụp kính hiến vi giai đoạn sống khác H pluvialis (A) tế bào hai roi, (B) tế bào bất động (màu xanh) nang bào tử (màu đỏ) Hình A) Mơ hình tổng qt module hai lớp màng hệ thống quang sinh học; B) Chi tiết thành phần hệ thong quang sinh học hai lớp màng Hình A) Sơ đồ hệ thống cung cấp dinh dưỡng, khơng khí cho buồng ni (chamber); B) Sơ đồ bố trí chamber đèn chiếu sáng hệ thống Hình Sự sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo H pỉuvialỉs chiếu sáng ánh sáng đơn sắc khác sau 10 ngày nuôi cố định 18 Hình Te bào H pỉuvialis chiếu sáng ánh sáng đơn sắc khác sau 10 ngày nuôi cố định (10x): A- LED đỏ; B- LED xanh; C- LED đỏ + xanh .19 Hình 3 Sự sinh trương tỉ lệ astaxanthin tích lũy SKK vi tảo chiếu sáng phối họp đèn LED đơn sắc sau 10 ngày nuôi cố định 20 Hình Tổng SKK tỷ lệ tích lũy astaxanthin vi tảo H phtvialis chiếu sáng chu kỳ sáng tối khác 10 ngày ni cố định 21 TĨM TẢT KẼT QUA NGHIÊN cưu Sản phẩm thực đạt Sản phẩm đăng ký thuyết minh 1- Báo cáo khoảng 30 trang có kết Báo cáo khoảng 30 trang có kết sự ảnh hưởng đèn LED lên sinh ảnh hưởng đèn LED lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin cùa trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis hệ thơng Haematococcus pỉuvialis hệ thông nuôi sinh học Twin-layer phương nuôi sinh học Twin-layer phương nghiêng nghiêng 2- Bài báo NCKH đăng tạp chí nước Thời gian đăng ký : từ ngày 01/04/2019 đến ngày 30/10/2019 Thời gian nộp báo cáo: ngày 08/01/2020 MỎ ĐẦU Lí chọn đề tài Trước môi trường sống ngày bị ô nhiễm, nguồn thực phẩm điều kiện sinh hoạt khơng an tồn, sức khỏe người ngày bị đe dọa gốc tự sản sinh ngày tăng the, gây nên bệnh nguy ung thư, lào hóa Tuy thể người ln có khả tạo chất kháng oxy hóa để chống lại gốc tự do, độ tuổi cao, khả tạo chất kháng oxy hóa người ngày giảm, thể phải chồng chọi với tác động xấu từ môi trường, khiến nguồn kháng oxy hóa nội sinh khơng cung cấp kịp thời khơng cung cấp đủ cho thể Do việc bổ sung thêm chất kháng oxy hóa từ mơi trường vào the người ngày trở nên cần thiết quan trọng, đặc biệt với chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên Các nhà khoa học tìm nhiều chất kháng oxy hóa tự nhiên, astaxanthin ý nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa cao nhùng carotenoid khác Astaxanthin tìm thấy từ nhiều nguồn khác phế liệu giáp xác thủy sản, nấm men số loài vi khuẩn Thực nghiệm cho thấy hàm lượng astaxanthin thu đối tượng thấp, khơng thích hợp cho quy mô lớn sản xuất thương mại Tuy nhiên, đoi với loài tảo lục Haematococcus pỉuvỉalis (H pluvialis) lại cho thấy khả tong họp astaxanthin với suất cao (chiếm 5-6% trọng lượng khô) so với đoi tượng nghiên cứu khác, cho thấy tiềm nuôi cấy sản xuất astaxanthin quy mô lớn Hiện sản xuất astaxanthin tảo H pluvialis biến với mơ hình ni cấy dạng dịch treo tồn nhiều nhược điếm sinh khối thấp (0,05 %-0,06 % lượng dịch nuôi), tốn thu hoạch cần nhiều công lao động Trong mơ hình ni cấy Twin layer đon giản mà lại khắc phục nhược điểm mô hình ni cấy dạng dịch treo lại chưa phổ biến Cịn hệ thống chiếu sáng LED có so diem tối ưu đe chọn hệ thống để thực đề tài Tại Viện Kỳ thuật Cơng nghệ cao NTT trường Nguyễn Tất Thành có áp dụng hệ thống chiếu sáng Natri 250W LED vào q trình ni cố định tảo, từ rút ưu diêm cùa hệ thống LED là: tiết kiệm điện, cung cấp ánh sáng, cung cấp ánh sáng có quang phổ theo mong muốn, không tỏa nhiệt gây ảnh hưởng môi trường nuôi Đồng thời có số nghiên cứu nước ngồi cho thấy việc sử dụng che độ chiếu sáng hệ thống đèn LED mang lại số hiệu tích cực phát triển sản xuất astaxanthin tảo H pluvialis Vì tất lí trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng đèn LED lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis hệ thống nuôi sinh học Twin-layer phương nghiêng” thực hiện, với mong muốn kết hợp mô hình ni cấy Twin layer với hệ thống chiếu sáng LED nhằm mang lại hiệu tối ưu nhất, bước ứng dụng vào quy mô sản xuất astaxanthin thương mại mang hiệu kinh tế cao Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng đèn LED tới tăng sinh khả tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialis hệ thống nuôi sinh học Twin layer Đối tượng nghiên cứu Vi tảo Haematococcus pluvialis Nhiệm vụ nghiên cứu 4.1 Khảo sát ảnh hưởng loại ánh sáng LED đơn sắc 4.2 Khảo sát ảnh hưởng chế độ chiếu sáng 4.3 Khảo sát tăng sinh tích lũy astaxanthin theo thời gian Phạm vi nghiên cứu Đe tài tiến hành khảo sát khả tăng sinh tích lũy vi tảo H pluvialis ảnh hưởng cùa ánh sáng đèn LED hệ thống Twin layer, phạm vi phịng thí nghiệm CHƯƠNG TÓNG QUAN 1.1 Vi tảo Haematococcus pluvialis 1.1.1 Vị trí phân loại phân bo Phân loại: Hệ thống phân loại theo Smith G.M (1950) Giới: Eukaryota Ngành: Chlorophyta Lóp: Chlorophyceae Bộ: Volvocales Họ: Chlamydomonadales Chi: Haematococcus Loài: Haematococcus pluvialis Flotow,1844 H pluviaỉis loài tảo lục đơn bào thường gặp, loài đặc hữu vùng ngập nước tạm thời (Kiperstok, Sebestyén, Podola, & Melkonian, 2017) Cụ the, H pluvialis sống nhiều mơi trường tồn giới như: vũng nước lợ tảng đá bờ biển (Chekanov et al., 2014); ao nuôi vịt, thân cây, thành chậu hoa, H pluvialìs có khả chống chịu tốt điều kiện sống bất lợi, thích nghi với điều kiện môi trường thay đối đột ngột cách hình thành màng dày bao bọc xung quanh tế bào (tế bào dạng cyst) có khả nảy mầm trở lại gặp điều kiện môi trường thuận lợi (W., 1957) 1.1.2 Đặc điếm hình thải H pluvialis vi tảo nước ngọt, đơn bào Hình thái tế bào biến đổi qua giai đoạn khác nhau, chia thành hai dạng tế bào sau: - Te bào sinh dưỡng (Tế bào lông roi): tế bào có màu xanh lục; hình cầu, elip Te bào bao quanh thành suốt, có hai roi có the di động Dạng tồn chủ yếu điều kiện sống thuận lợi, sinh trưởng quang tự dưỡng có ánh sáng dị dường tối Khi đó, tế bào có hàm lượng chlorophyll a, b tiền carotenoid cao - Nang bào tử (tế bào dạng cyst)' Khi điều kiện sống bất lợi (thiếu dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối ) tế bào vi tảo bị tiêu biến lơng roi, khơng cịn khả di chuyển (tế bào bất động) khả phân chia Tuy nhiên, điều kiện sống khắc nghiệt kéo dài, dần đến hoạt động phân chia bị đình chỉ, sè làm cho tế bào bất động chuyên sang trạng thái nang bào tử, với lớp màng dày, tích lũy nhiều astaxanthin, đồng thời giảm hàm lượng chlorophyll tiền carotenoid Tốc độ sinh trưởng giai đoạn chậm lại Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi giai đoạn sống khác H pluvialis (A) tế bào hai roỉ, (B) tế bào bất động (màu xanh) nang bào tử (màu đỏ) (Kiperstok et al., 2017) 1.1.3 Sình trưởng tảo phát triển Thông thường, vi tảo H pluvialis sè sinh sản vơ tính cách nhân đơi tế bào Tuy nhiên, số trường hợp bào tử nảy mầm sau giai đoạn môi trường khắc nghiệt, tế bào tảo sinh sản hữu tính Q trình phát triến cùa tế bào vi tảo H pluvialis trải qua giai đoạn chính: J Giai đoạn (Giai đoạn tể bào sinh dường): có dạng hình dạng elíp, chuyển động hai roi, phân chia tế bào để gia tăng số lượng Các tế bào chứa hàm lượng chlorophyll protein cao hàm lượng carotenoid lại thấp J Giai đoạn (Giai đoạn tạo bào nang non Encyst): giai đoạn này, tế bào sinh dưỡng chuyến sang dạng tế bào nang non có màu nâu, hình cầu, roi Trong suốt giai đoạn nang bào, hàm lượng chlorophyll protein giảm đi, mức độ sinh tống hợp carotenoid protein tăng lên J Giai đoạn (Giai đoạn tế bào cyst hoàn chỉnh): giai đoạn này, tế bào cyst hồn chỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoid cao Trong suốt giai đoạn chín này, q trình tổng hợp carotenoid, chlorophyll protein chậm lại J Giai đoạn (Giai đoạn nảy mầm): giai đoạn xảy tổng hợp chlorophyll protein, xuất phân giải carotenoid Có nảy mầm vi tảo H pluvialis theo hai cách: (1) nảy mầm trực tiếp từ nang bào tử hình cầu, khơng di động thành tế bào sinh dưỡng hình elip, có roi; (2) nảy mầm gián tiếp thông qua pamella (cụm te bào bao bọc lớp màng) Khi màng bao bọc pamella bị vỡ, từ tế bào nang tạo tế bào sinh dưỡng Tỷ lệ hàm lượng carotenoid/chlorophyll thông số quan trọng cho phép phân biệt giai đoạn khác tế bào H pluvialis (Vì chuyển sang giai đoạn tạo nang bào từ, lượng carotenoid tế bào tăng, lượng chlorophyll giảm) Theo nhóm nghiên cứu Kobayashi (1997), tỷ lệ vào khoảng 0,5; 1,0 7,0 tương ứng tế bào sinh dưỡng (màu lục), tế bào cyst non (màu nâu), tế bào cyst hoàn chỉnh (te bào chín, màu đỏ) (Kobayashi, Kurimura, Kakizono, Nishio, & Tsuji, 1997) Dựa giai đoạn phát triển tế bào, việc nuôi vi tảo H pluvỉaỉis với phương pháp khác chia thành hai pha: - Pha sinh dường (pha xanh): tảo nuôi mơi trường có đầy đủ chất dinh dường điều kiện sống cần thiết, nhằm kích thích tăng sinh khối tảo đạt cao - Pha ức chế (pha đỏ): tảo ni mơi trường có điều kiện sống khắc nghiệt, thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, nito, photpho nhằm kích thích tế bào tạo nang bào tử 1.1.4 Giá trị sử dụng Te bào vi tảo H pluvialis chứa nhiều thành phần dinh dưỡng với hàm lượng cao khác giai đoạn phát triển khác nhau: tảo H pluvialis giai đoạn sinh dưỡng có hàm lượng protein cao, dao động từ 29 - 45% SKK; hàm lượng carbohydrate chiếm khoảng 15 - 17% SKK giai đoạn sinh dưỡng tăng lên 36 - 40% tảo giai đoạn cyst Tuy nhiên, H pluvialis ý nghiên cứu với khả cung cap astaxanthin tự nhiên, đặc điếm có hàm lượng carotenoid tong số tăng mạnh, sắc tố astaxanthin chiếm chủ yếu (80 - 99% carotenoid tổng số) Nhiều vi sinh vật nấm, địa y, vi khuẩn, vi tảo khác có khả tổng hợp astaxanthin hàm lượng astaxanthin H pluvialis xem cao (Ambati, Phang, Ravi, & Aswathanarayana, 2014) 1.2 Sơ lược astaxanthin (C40H52O4) 1.2.1 Cấu trúc hóa học Astaxanthin (3,3'-dihydroxy-(3,(3'-carotene-4,4'-dione ) carotenoid có màu đỏ cam, tạo thành chất có màu sắc khác tự nhiên có chức sinh học thiết yếu động vật Astaxanthin tổng hợp nhân tạo tìm thấy từ nhiều lồi sinh vật tự nhiên loài hải sản (cá hồi, tôm, cua ), nấm, địa y, vi khuấn, số lồi vi tảo đơi số lồi chim Các lồi động vật khơng có khả tự tạo astaxanthin mà bổ sung khấu phần ăn So với loại carotenoid khác, astaxanthin dễ dàng hấp thụ tích luỳ (Ambati et al., 2014) 1.2.2 Đặc tỉnh kháng oxy hóa Astaxanthin chất có khả kháng oxy hóa mạnh cách loại bỏ gốc tự (chúng phản ứng với gốc để tạo họp chất không độc khác) dập tắt phản ứng oxy hố Astaxanthin có hoạt tính chống oxy hố cao gấp 10 lần so với carotenoid khác zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, (3 - carotene cao 100 lần so với a tocopherol nên gọi “supper vitamin E” (Ambati et al., 2014) 1.2.3 ủng dụng Cơ thể người sản sinh chất chống oxy hoá super oxide dismutase (SOD), catalase, peroxidase de chong lại oxy thành phần tế bào gốc tự do, trường hợp hàm lượng gốc tự cao dẫn đến tình trạng nguy hiểm Tuy nhiên, nhiều trường họp, họp chất lại không đủ đế chống lại oxy hóa Do đó, Astaxanthin ngày đóng vai trò quan trọng việc bổ sung vào thực phẩm, đe giúp người chống lại đe dọa cùa q trình oxy hóa (Ambati et al., 2014) Ngoài ra, chất màu tự nhiên astaxanthin với hoạt tính chong oxy hóa cao ứng dụng nhiều lình vực thuốc điều trị y học, thức ăn bổ sung nuôi trồng thủy sản gia cầm Nghiên cứu để chế tiết astaxanthin thành sản phẩm màu tự nhiên trọng 1.3 Sơ lược số hệ thống nuôi tảo Haeniatococcus pluvialìs 1.3.1 Hệ thong ni tảo dạng dịch treo H pluvialis thường ni theo mơ hình bước: bước (còn gọi pha xanh hay pha tăng trưởng) với tham số nuôi cấy tối ưu hóa cho hoạt động tăng trưởng để đạt mật độ tế bào dày đặc Khi trì tăng trưởng tế bào dạng dịch treo ánh sáng tối đa 150 pmol photon.mAs'1 đủ, đồng thời phải theo dõi cấn thận tham số môi trường khác dinh dưỡng, nhiệt độ, CƠ2, pH (Lorenz & Cysewski, tối) X lần/ngày nhằm khảo sát tăng trưởng tích lũy astaxanthin cùa vi tảo - pH điều chỉnh phù hợp cho vi tảo từ 6,5 - 8,0, độ dần môi trường BG-11 từ 1600 - 2000 Nhiệt độ buồng nuôi (chamber) đảm bảo tối ưu cho sinh trưởng vi tảo dao động từ 24,5 - 25 °C Nhìn chung, thời gian chiếu sáng tăng tống SKK thu tăng, tưong tự kết thí nghiệm trước Tổng SKK chu kì sáng tối (11:1) X đạt cao 80,95 g.m’2 cao hon có ý nghĩa thống kê so với chu kì sáng cịn lại (p>0,05) Trong đó, với tổng thời gian chiếu sáng 22 chu kì sáng tối (7:5) X (8:4) X lại cho lượng sinh khối khô sau 10 ngày ni thấp hon đáng kể Hình Tổng SKK tỷ lệ tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialỉs chiếu sáng chu kỳ sáng tối khác 10 ngày nuôi cố định Ket đo OD để xác định tỉ lệ astaxanthin tích lũy SKK cùa vi tảo phân tích cho thấy khác cho thấy tỉ lệ astaxanthin đạt cao 2,4 % chiếu sáng nghiệm thức (10:2) X 2, thấp chu kì sáng tối (11:1) X đạt tỷ lệ trung bình khoảng 1,39% Như vậy, dựa theo kết tổng lượng SKK tỉ lệ astaxanthin thu mặt lượng dùng cho chiếu sáng chế độ chiếu sáng 10 sáng: tối (lặp lại) cho khả tăng sinh tích lũy astaxanthin ồn định hiệu Khi tăng thời gian chiếu sáng sinh khối chu kì (11:1) X đạt cao tỷ lệ tích lũy astaxanthin nghiệm thức giảm mạnh, tế bào lúc chuyển từ dạng bào tử tích lũy astaxanthin sang giai đoạn phân chia tế bào 21 THẢO LUẬN Các nghiên cứu trước sử dụng nguồn sáng đơn sắc từ LED cho thấy hiệu mặt lượng kích thích sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo lục H pluvialis Trong đó, ánh sáng LED đỏ có vai trị việc kích thích sinh trưởng đe tăng so lượng tế bào lại khơng kích thích tích lũy astaxanthin nên suất astaxanthin đạt thường thấp Cịn ánh sáng LED xanh có tác dụng kích thích vi tảo tích lũy astaxanthin khơng hiệu việc tăng tổng lượng sinh khối khô Do đó, việc kết hợp hai loại ánh sáng đơn sắc có ý nghĩa vừa kích thích tăng sinh khối vừa kích thích tế bào chuyển pha tích lũy astaxanthin (Katsuda et al., 2006; Tran, Lee, & Hong, 2015; Xi et al., 2016) Ket cùa nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cửu trước dù phương thức ni cố định vi tảo có nhiều khác biệt so với phương thức nuôi huyền phù Điều cho thấy đèn LED nguồn sáng có nhiều tiềm việc nuôi tảo cố định màng sinh học Với phương thức nuôi tảo H pỉuvialis dinh dưỡng theo kiêu tự dường nguồn ánh sáng hiệu đóng vai trị quan trọng Ánh sáng LED với hai loại ánh sáng đỏ (bước sóng khoảng 630 - 670 nm) ánh sáng xanh xanh (bước sóng khoảng 400 - 500 nm) ánh sáng hấp thụ quang hệ thống I II quang hợp Nên kết thí nghiệm cho thấy với việc cung cấp ánh sáng liên tục giúp đạt suất sinh khối khô cao 80g.nr2, tỉ lệ astaxanthin đạt trung bình 2.4 % với 10 ngày nuôi Các nghiên cứu nuôi H pluvialis co định giới cho suất lớn đạt khoảng 3,7 - 10,6 g.m'2.ngày', hàm lượng astaxanthin vi tảo khoảng 1,3 - 3,5 % sau 12 ngày, nguồn ánh sáng đèn Natri công suất cao (Kiperstok et al., 2017; Wan et al., 2014; Zhang, Wang, Wang, & Liu, 2014) Hệ thống nuôi cố định vi tảo thực tế hệ thống hở nên việc rút ngắn thời gian nuôi để hạn chế nhiễm điều quan trọng Với việc chiếu sáng liên tục LED thử nghiệm theo dõi tăng sinh cùa vi tảo qua thời gian Tổng sinh khối khô vi tảo qua thời gian tăng dần kết tương đồng với kêt nghiên cứu Kiperstok et al., 2017 Tuy nhiên, sau ngày thứ 10, tình trạng nhiễm gây ảnh hưởng đến chất lượng tảo thu nên thời gian nuôi tối đa 10 ngày phù hợp 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Ket luận Từ kết nghiên cứu cho thấy: - Sự kết hợp ánh sáng LED đỏ + xanh cường độ sáng 80 - 100 pmol photon.m’Ls'1 cho kết tăng SKK tích lũy astaxanthin cao - Tảo nuôi chế độ chiếu sáng 10 sáng: tối (lặp lại) cho khả tăng sinh tích lũy astaxanthin cao - Tảo nuôi hệ thống hai lớp màng cần thu hoạch vào ngày thứ 10 sau cố định lên màng Kiến nghị - Nghiên cứu thêm ảnh hưởng nguồn Carbon đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo - Tìm hiểu chế ảnh hưởng ánh sáng LED đến sinh trưởng tích lũy axtaxanthin H pluvialis ni cố định 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Acien, G., Fernandez-Sevilla, J M., & Molina-Grima, E (2013) Photobioreactors for the production of microalgae (Vol 12) Aflalo, c., Meshulam, Y., Zarka, A., & Boussiba, s (2007) On the relative efficiency of two- vs one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis Biotechnol Bioeng, 95(1), 300-305 doi: 10.1002/bit.21391 Ambati, R R., Phang, s M., Ravi, s., & Aswathanarayana, R G (2014) Astaxanthin: sources, extraction, stability, biological activities and its commercial applications-a review Mar Drugs, 72(1), 128-152 doi:10.3390/mdl2010128 Brennan, L., & Owende, p (2010) Biofuels from microalgae—A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co­ products Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14(2), 557-577 doi:https://doi.org/l 0.1016/j.rser.2009.10.009 Chekanov, K., Lobakova, E., Selyakh, I., Semenova, L., Sidorov, R., & Solovchenko, A (2014) Accumulation of astaxanthin by a new Haematococcus pluvialis strain BM1 from the white sea coastal rocks (Russia) Mar Drugs, 12(8), 4504-4520 doi:10.3390/mdl2084504 Đặng, D H., Đinh, Đ FL, Nguyễn, T T., & Hồng, T.-L A (2010) Lựa chọn mơi trường tối ưu đe nuôi trồng vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin Tạp Sinh học, 32(2), 43-53 Đặng, D H., Đinh, T.-N M., Bùi, Đ L., Lưu, T T., Nguyền, T.-T T., Nguyễn, c H., Ngô, T.-H T (2012) Ảnh hưởng kết hợp nong độ nitrate chế độ chiếu ánh sáng lên sinh trưởng vi tảo Haematococcus pỉuvialỉs Tạp Sinh học, 34(4), 493-499 Giuseppe, o., Piero, s., & Antonio, M (2014) Advances in photobioreactors for intensive microalgal production: configurations, operating strategies and applications Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 89(2), 178-195 doi.doi: 10.1002/jctb.4218 Gross, M., Henry, w., Michael, c., & Wen, z (2013) Development of a rotating algal biofilm growth system for attached microalgae growth with in situ biomass harvest Bioresource Technology, doi:https://doi.org/l 0.1016/j.biortech.2013.10.016 24 150, 195-201 Ho, Y.-H., Ho Man, L., Ying Yuen, s., Shing Ng, K., Sing Li, T., Ming Yuen, L., & Wong, Y.-K (2018) Maximization of Astaxanthin Production from Green Microalga Haematococcus pluvialis Using Internally-Illuminated Photobioreactor (Vol 6) Katsuda, T., Shimahara, K., Shiraishi, H., Yamagami, K., Ranjbar, R., & Katoh, s (2006) Effect of flashing light from blue light emitting diodes on cell growth and astaxanthin production of Haematococcus pluvialis J Biosci Bioeng, 102(5), 442-446 doi: 10.1263/jbb 102.442 Kiperstok, A c., Sebestyén, p., Podola, B., & Melkonian, M (2017) Biofilm cultivation of Haematococcus pluvialis enables a highly productive one-phase process for astaxanthin production using high light intensities Algal Research, 21, 213-222 doi:https://doi.org/l0.1016/j.algal.2016.10.025 Kobayashi, M., Kurimura, Y., Kakizono, T., Nishio, N., & Tsuji, Y (1997) Morphological changes in the life cycle of the green alga Haematococcus pluvialis Journal of Fermentation and Bioengineering, 84(\), 94-97 doi:https://doi.org/l 0.1016/S0922-338X(97)82794-8 Lababpour, A., Shimahara, K., Hada, K., Kyoui, Y., Katsuda, T., & Katoh, s (2005) Fed-batch culture under illumination with blue light emitting diodes (LEDs) for astaxanthin production by Haematococcus pluvialis J Biosci Bioeng, 100(3), 339-342 doi: 10.1263/jbb 100.339 Lorenz, R T., & Cysewski, G R (2000) Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin Trends in Biotechnology, 18(A), 160-167 doi:https://doi.org/10.1016/SO167-7799(00)01433-5 Lưu, T T., Đinh, Đ H., Đinh, T.-N M., Ngô, T.-H T., Hoàng, T.-L A., & Đặng, D H (2012) Nghiên cứu ảnh hưởng nong độ muối lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis làm sở bước đầu cho quy trình nuôi cấy pha Tạp Sinh học, 34(2), 213-223 Lưu, T T., Lê, T T., Nguyền, c H., Ngô, T.-H T., Lê, H T., & Đặng, D H (2015) Nhân tố giới hạn cho q trình tích lũy astaxanthin pha vi tảo lục Haematococcus pluvialis điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Tập 13(số 4), trang 1-7 25 Naumann, T., Ọebi, z., Podola, B., & Melkonian, M (2013) Growing microalgae as aquaculture feeds on twin-layers: a novel solid-state photobioreactor Journal of Applied Phycology’, 25(5), 1413-1420 doi: 10.1007/sl0811-012-9962-6 Olaizola, M., & Huntley, M (2003) Recent advances in commercial production of astaxanthin from microalgae Suh, I s., Joo, H N., & Lee, c G (2006) A novel double-layered photobioreactor for simultaneous Haematococcus pluvialis cell growth and astaxanthin accumulation JBiotechnol, 125(4), 540-546 doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.03.027 Tran, H.-L., Lee, K.-H., & Hong, C.-H (2015) Effects of LED irradiation on the growth and Astaxanthin Production of Haematococcus lacustris (Vol 12) Trịnh, N N., Truong, N.-B T., Huỳnh, T H., Nguyễn, T.-D H., & Trần, T.-B L (2017) Nghiên cứu nâng cao tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện stress môi trường nuôi cay Paper presented at the Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam w., p V (1957) Some Controlling Factors in the Distribution of Haematococcus Pluvialis Ecology, 38(3), 457-462 doi:doi: 10.2307/1929890 Wan, M., Hou, D., Li, Y., Fan, J., Huang, J., Liang, s., Li, s (2014) The effective photoinduction of Haematococcus pluvialis for accumulating astaxanthin with attached cultivation Bioresour Technol, 163, 26-32 doi: 10.1016/j.biortech.2014.04.017 Xi, T., Kim, D G., Roh, s w., Choi, J s., & Choi, Y E (2016) Enhancement of astaxanthin production using Haematococcus pluvialis with novel LED wavelength shift strategy Appl Microbiol Biotechnol, /ớớ(14), 6231-6238 doi: 10.1007/S00253-016-7301 -6 Zhang, w., Wang, J., Wang, J., & Liu, T (2014) Attached cultivation of Haematococcus pluvialis for astaxanthin production Bioresour Technol, 158, 329-335 doi: 10.1016/j.biortech.2014.02.044 26 ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG LED (LIGHT EMITTING DIODE) LÊN SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA Haematococcus pluvỉalis ĐƯỢC NI TRÊN HỆ THỐNG QUANG SINH HỌC HAI LỚP MÀNG Ton Nu Thuy An1, Tran Hoang Dung', Do Thanh Tri2, Lại Thị Lan Anh2 Nguyen-Tat-Thanh University, Faculty of Biotechnology, 298A-300A Nguyen-TatThanh Street, District 04, Hochiminh City, 72820, Vietnam, email: ongbinhnguyen (tfgmail com (B-N.O) and thdung(ẫ),ntt edu (H-D.T); Ho Chi Minh city University of Education - Faculty of Biology, 280 An Duong Vuong street, District 5, Ho Chi Minh city, phone:+84962720643, email: tridtffhcmue.edu (T-T.D); Correspondence: HDT Email: thdung@ntt.edu.vn, Tel +84-772-999-537 Received: date; Revised: date; Accepted: date TÓM TẮT Vi tảo Haematococcus pluvialis nuôi đê thu astaxanthin tự nhiên theo hai phương thức nuôi huyền phù co định Hệ thong twin-layer porous substrate photobioreactor quy mô nhỏ sử dụng đê nuôi co định H pluvialis với chiếu sảng bang Light Emitting Diode đơn sắc màu đỏ lam Sự kết hợp ảnh sảng LED đỏ lam cường độ sáng 80 - ỉ00 pmol photon m~2.s~' cho kết tăng sinh khối khô tích lũy astaxanthin cao nhất, với chế độ chiếu sáng 24 sảng o toi cho kết sinh khối khơ vi tảo đạt 111,55 g.m'2 tích lũy astaxanthin 1,3% sau 10 ngày nuôi EFFECTS OF LIGHT EMITTING DIODE ON GROWTH AND ASTAXANTHIN OF Haematococcus pluvialis IN AN ANGLED TWIN-LAYER POROUS SUBSTRATE PHOTOBIOREACTOR Keywords: Astaxanthin, Haematococcus pluvialis, Horizontal (low-angled) TwinLayer photobioreactor, Light emitting diode, Porous substrate photobioreactor Giới thiệu Astaxanthin ý nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa cao hon hẳn carotenoid khác Astaxanthin tìm thấy từ nhiều nguồn khác phế liệu giáp xác thủy sản, nấm men số loài vi khuẩn Thực nghiệm cho thấy hàm lượng astaxanthin thu đôi tượng thâp, khơng thích họp cho quy mơ lớn sản xuất thương mạị Tuy nhiên, loài tảo lục Haematococcus pluvialis (H pluvialis) lại cho thây khả tông họp astaxanthin với suât cao (chiêm 5-6% sinh khôi khô (SKK)) so với đôi tượng nghiên cứu khác, cho thấy tiềm nuôi cấy sản xuất astaxanthin quy mô lớn Hiện sản xuât astaxanthin tảo H pluvialỉs phô biên với mơ hình ni cấy dạng dịch treo cịn tồn nhiều nhược diem sinh khối thấp (0,05 %-0,06 % lượng dịch nuôi), tốn thu hoạch cần nhiều cơng lao động Trong mơ hình nuôi cay Biofilm Photobioreactor đơn giản mà lại khắc phục nhược điểm mơ hình ni cấy dạng dịch treo lại chưa biến Còn hệ thống chiếu sáng LED có số điểm tối ưu để chọn hệ thống để thực đề tài Tại Viện Khoa học - Công nghệ cao trường Nguyền Tất Thành có áp dụng hệ thống chiêu sáng Natri 250W LED vào trình ni định tảo, từ chúng tơi rút 27 ưu điếm hệ thống LED là: tiết kiệm điện, cung cấp ánh sáng, cung cấp ánh sáng có quang phố theo mong muốn, khơng tỏa nhiệt gây ảnh hưởng môi trường nuôi Đông thời có sơ nghiên cứu nước ngồi cho thây việc sử dụng chê độ chiêu sáng hệ thông đèn LED mang lại sơ hiệu tích cực vê phát triên sản xuât astaxanthin tảo H pluvialis Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm kết họp mơ hình ni cấy Biofilm Photobioreactor với hệ thống chiếu sáng LED nhằm mang lại hiệu toi ưu nhất, bước ứng dụng vào quy mô sản xuất astaxanthin thưong mại mang hiệu kinh tê cao Vật liệu phương pháp 2.1 Dịng tảo ni cay huyền phù trước co định vi tảo: Dòng vi tảo H pluvialis CCAC 0125 cung câp sưu tập tảo Đại học Cologne (Culture Collection of Algae at the University of Cologne), Đức Môi trường BG-11 sử dụng đê ni hun phù vi tảo bình tam giác 500 mL, L túi PE 10 L, 25 ± °C chiếu sáng đèn huỳnh quang với cường độ ánh sáng 40 - 60 pmol photon.m‘2.s-1 Đôi với nuôi cô định vi tảo hệ thông quang sinh học hai lớp màng theo phương nghiêng, lượng thê tích mơi trường BG-11 lớn chn bị bơn nhựa 40L 2.2 Thiết kế thí nghiệm Các nghiên cứu tiến hành hệ thống quang sinh học hai lóp màng quy mơ 0,5 m2 theo mơ tả hệ thơng Trân Hồng Dũng cs (Tran et al, 2019) Các thí nghiệm thực gôm: a Khảo sát ảnh hưởng loại ảnh sảng LED đơn sắc: Tiên hành thí nghiệm gồm nghiệm thức NT1: Chỉ ánh sáng đỏ, NT2: Chỉ ánh sáng xanh NT3: Ánh sáng đỏ + xanh, chế độ sáng 14:10 (14 chiếu sáng: 10 tối), mật độ cấy 7,5g skk/m2 Bố trí tồn thí nghiệm champer, chia champer thành 40 ô vuông Thu mầu vào ngày 10 sau tách chiết sắc tố xử lí số liệu b Khảo sát ánh hưởng chế độ chiếu sảng: Tiến hành thí nghiệm chế độ chiếu sáng khác theo hướng tăng thời gian chiêu sáng đê mạnh quang họp sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialis thời gian ngăn (10 ngày) Thí nghiệm chế độ ánh sáng có nghiệm thức: (12 sáng: 12 toi), (16 sáng:8 tôi), (20 sáng:4 tôi) (24 sáng:0 tôi) Mật độ tảo ban đầu thí nghiệm 7,5g skk/m2 Thu mầu vào ngày ngày 10 sau tách chiết sắc tố xử lí số liệu 2.3 Co định tảo lên màng sinh học Phương pháp thu dịch tảo cô đặc đế cố định thành biofilm: Tảo H pluvialis ni bình erlen lít Tảo pha logarit (tỉ lệ tê bào giai đoạn sinh dưỡng, có màu xanh có hai roi 80 % kiếm tra kính hiển vi) li tâm với tốc độ 800 X g phút, bỏ dịch nôi thu dịch tảo đặc bên Xác định sinh khối khô tảo dịch cô đặc sau li tâm: Hút ml dịch tảo đặc lên giấy lọc (đã sấy khô cân khối lượng mi), sấy 105°C Giấy lọc tảo sây đê nguội bình hút âm 30 phút, cân khơi lượng lặp lại trình sây 28 khối lượng không đổi, thu m2 Tỉnh khối lượng sinh khối H pluvialỉs ml dịch tảo theo công thức: m (g/ml) = m2 - rm Thực với mâu đê tính khơi lượng trung bình Tính lượng dịch tảo đặc đê quét lên phiên theo cơng thức: V (ml) — — Trong đó: V: thê tích dịch tảo đặc cân đê tạo biofilm 0,05 m2; m: Khơi lượng sinh khối khơ trung bình ml dịch tảo đặc; M: Khối lượng SKK cần cho phiến 0.05 m2 Điều kiện nuôi vi táo sau cố định: Thời gian nuôi cố định màng 10 ngày, ngày đâu môi trường BG-11,3 ngày cuôi thay băng môi trường thiêu N p Mơi trường sục khơng khí có bô sung CƠ2 1% đê cung câp CO2 cho quang hợp điêu chỉnh pH Các điêu kiện môi trường cân kiêm sốt gơm pH 6,5 - 8, nhiệt độ 26 °C, EC khoảng 1800 - 2000 pS.cnr2 Những điêu kiện khác thí nghiệm đảm bảo giống nghiệm thức 2.4 Thu xác định sinh khối khô vi tảo biofilm sau nuôi Sau 10 ngày nuôi tảo giàn, ta tiến hành thu tảo Cân khối lượng túi trữ mẫu (mi) Dùng thước nhựa dẻo cạo phần sinh khối tảo phiến cho vào túi trừ mầu Sau thu xong mang mầu sẩy 105 °C Sau mang cân, ta tong khối lượng túi sinh khối tảo khô (m2) Lấy khối lượng trừ khối lượng túi ban đâu ta m (g) khôi lượng khô thu hoạch được, công thức: m (g) = m2 - mi 2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng astaxanthin Cân 0,001 g SKK ống eppendorft mL, thêm 0,5 mL acetone 90%, nghiền kì băng chày thủy tinh Thêm mL acetone 90% rơi đem li tâm 4000 vịng/phút 30s, thu phần dịch nối Tiếp tục thêm 0,5 mL acetone 90% lặp lại quy trình cho đen khi phân dịch thu không màu Thêm acetone 90% đê thu thê tích sau 3,5 mL ống falcon đậy nắp kín Quy trình thực tối ánh sáng khuếch tán yếu đe tránh phân giải astaxanthin Phần dịch chiết sắc tố đo quang phố bước sóng 530 nm Nồng độ astaxanthin xác định dựa theo phương trình đường chuân dựng băng astaxanthin chuân (Sigma-Aldrich) Phương trình đường chn: y= 0,053 lx+0,0481, y giá trị đo OD, X nông độ astaxanthin (pg.mL' ') (Tran et ai, 2019) 2.6 Phương pháp xác định hình thải kích thước tế bào Mầu tế bào biofilm thu nhận sau 10 ngày nuôi, huyền phù dung dịch đắng trương, co định bang formol 2% quan sát hỉnh thái với kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Nhật Bản) 2.7 Phân tích liệu Các số liệu xử lý phần mem Microsoft Excel 2016 Các phân tích thống kê, biêu đô thực băng phân mêm R phiên 3.4.2 Các giá trị trình bày dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuân (SD) nhât lân lặp lại nghiệm thức Kết thảo luận 3.1 Anh hưởng loại ánh sáng LED đơn sắc đến sình trưởng tích lũy 29 astaxanthin cửa vi tảo H pluvialìs a Ket tăng SKK Tong SKK nghiệm thức kết họp ánh sáng đỏ + lam đạt 63,15 g.m’2 cao hẳn hai nghiệm thức dùng loại ánh sáng đơn săc đỏ xanh lam Sự khác biệt có ý nghía thơng kê (p