Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano đồng bằng hệ thống điện sinh học nhằm ức chế vi khuẩn xanthomonas axonopodis và ralstonia solanacearum

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Những nội dung luận văn thực hướng dẫn TS Hồ Tú Cường Mọi tham khảo dùng luận văn tơi trích dẫn nguồn gốc rõ ràng Các kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa ngồi nhóm nghiên cứu cơng bố cơng trình Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Hoa ii LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ khoa học - Chuyên ngành Kỹ thuật Môi trường với đề tài “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano Đồng hệ thống điện sinh học nhằm ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis Ralstonia solanacearum’’ thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, với hướng dẫn TS Hồ Tú Cường Trong suốt q trình thực luận văn, tơi ln nhận quan tâm, động viên, hỗ trợ từ thầy hướng dẫn Bằng tất kính trọng, lịng biết ơn, xin phép gửi tới TS Hồ Tú Cường lời cảm ơn chân thành Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệ -Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Môi trường, thể lãnh đạo, cán bộ, viên chức phịng Vi sinh vật Mơi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành tốt luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, giảng dạy, truyền đạt kiến thức, hướng dẫn tơi hồn thành chương trình học tập thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Trung tâm Khoa học Công nghệ Môi trường, xin cảm ơn gia đình ln bên, động viên, tạo điều kiện thuận lợi tinh thần vật chất cho tơi hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2021 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Việt Tên tiếng Anh AAS Quang phổ hấp thụ nguyên tử BES Hệ thống điện sinh học HN41 Vi khuẩn Shewanella HN41 HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao MFC Pin nhiên liệu vi sinh vật Microbial fuel cell OD Mật độ quang Opical Density SEM Hiển vi điện tử quét SP200 Vi khuẩn Shewanella SP200 TEM Hiển vi điện tử truyền qua XRD Nhiễu xạ tia X Atomic Absorption Spectrometric Bioelectrochemical system Shewanella putrefaciens HN41 High-performance liquid chromatography Scanning electron microscopy Shewanella putrefaciens SP200 Transmittion electron microscopy X-ray diffraction iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vii Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ KIM LOẠI ĐỒNG 1.1.1 Đồng trạng thái tự nhiên………………………… 1.1.2 Hạt nano Đồng………………………………………… 1.1.3 Ô nhiễm Đồng ảnh hưởng người, động vật 10 1.2 HỆ THỐNG ĐIỆN SINH HỌC (BES BIOELECTROCHEMICAL SYSTEM) 14 1.2.1 Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC – Microbial fuel cells) 14 1.2.2 Vi sinh vật ứng dụng hệ thống điện sinh học 16 1.2.3 Ứng dụng hệ thống điện sinh học thu hồi kim loại nặng…………………………… …………………… ………… 18 1.2.4 Vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas axonopodis Ralstonia solanacearum………………………………………… …………………….23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Các dạng hệ thống điện sinh học………………………… 26 v 2.2 PHẠM VI NGHIÊN CỨU 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Thiết kế hệ thống MFC………………………………… 28 2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào………………… 32 2.3.3 Phương pháp phân tích ion kim loại AAS……… 33 2.3.6 Phương pháp thử tính kháng khuẩn vật liệu nano Đồng 37 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 SỰ BIẾN ĐỘNG CÁC THÔNG SỐ TRONG KHOANG ANOT 39 3.1.1 Sự thay đổi mật độ tế bào khoang Anot …………………….39 3.1.2 Tốc độ tiêu thụ lactate khoang anot…………… 40 3.2 SỰ BIẾN ĐỘNG CÁC THÔNG SỐ TRONG KHOANG CATOT 43 3.2.1 Sự suy giảm nồng độ ion Cu2+ dung dịch catot 43 3.3.1 Hiệu ức chế nano Đồng đến vi khuẩn Xanthomonas axonopodis…………………………………………………… 50 3.3.2 Hiệu ức chế nano Đồng đến vi khuẩn Ralstonia solanacearum………………………………………………… 52 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Khả thu hồi kim loại nặng MFC 20 Bảng 2.1 Thành phần môi trường LB 30 Bảng 2.2 Các dung dịch khoáng gốc dùng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn khoang anot 30 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch khống vi lượng để chuẩn bị mơi trường ni cấy vi khuẩn khoang Anot 31 Bảng 2.4 Thành phần môi trường lỏng dùng khoang Anot 32 Bảng 3.1 Kích thước vịng kháng nano đồng vi khuẩn Ralstonia solanacearum 53 Bảng 3.2 Bảng giá trị IC50 57 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Xả thải ô nhiễm môi trường nước 11 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo MFC đơn giản 15 Hình 2.1 Vi khuẩn thuộc chủng Shewanella putrefacien [25] 27 Hình 2.2 Hệ thống điện sinh học khơng mạch ngồi có điện cực dương 28 Hình 3.1 Sự biến động mật độ tế bào vi khuẩn Shewanella 39 Hình 3.2 Sự biến động hàm lượng lactate khoang anot 41 Hình 3.3 Sự biến động pH môi trường khoang anot 43 Hình 3.4 Sự biến động hàm lượng ion Cu2+ khoang catot 44 Hình 3.5 Ảnh hiển vi điện tử quét (A,B) vật liệu bề mặt than chì hệ cấy chủng SP200 ảnh hiển vi điện tử quét (C,D) vật liệu bề mặt than chì có chủng HN41 46 Hình 3.6 Ảnh ESD vật liệu bề mặt điện cực than chì hệ cấy với chủng SP200 48 Hình 3.7 Ảnh ESD vật liệu bề mặt điện cực than chì hệ cấy với chủng HN41 48 Hình 3.8 Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) vật liệu nano đồng thu 49 Hình 3.9 Đĩa thạch thử tính kháng khuẩn nano đồng vi khuẩn Xanthomonas axonopodis 50 Hình 3.10 Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xanthomonas axonopodis sau 24h 51 Hình 3.11 Đĩa thạch thử tính kháng khuẩn nano đồng vi khuẩn Ralstonia solanacearum 52 Hình 3.12 Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Ralstonia solanacearum 54 Hình 3.13 Tốc độ sinh trưởng vi khuẩn Ralstonia solanacearum sau 48h 56 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, môi trường ô nhiễm môi trường vấn đề thời giới quan tâm Cùng với phát triển kinh tế xã hội, gia tăng hoạt động công nghiệp việc sản sinh chất thải nguy hại, tác động tiêu cực trực tiếp đến sức khỏe người hệ sinh thái Đồng kim loại độc hại, đồng hợp chất với hàm lượng cao lên đến hàng nghìn miligam nước thải có liên quan trực tiếp đến biến đổi gen, ung thư ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Chính vậy, việc thu hồi tái sử dụng đồng dạng nano hướng xử lý ô nhiễm cần thiết Đồng dạng vật liệu nano lại thể đặc tính ưu việt so với hạt có kích thước lớn có nhiều ứng dụng lĩnh vực khác đời sống Trong khoa học vật liệu người ta thường sử dụng hạt nano đồng việc chế tạo cảm biến quang ( photo-detectors), vật liệu có tính chất quang phi tuyến ( nonlinear optical materials) vô số thiết bị phát quang (luminescence devices), quang hóa xúc tác (photochemical catalysis), máy dò (detectors) tia laser hồng ngoại,[1] Cùng với phát triển xã hội, công nghệ nano ứng dụng nhiều y học, thuốc bổ sung bào chế dạng nano dần chứng minh hiệu tuyệt vời khả cải thiện kết trị liệu tăng tính an toàn sản phẩm so với dạng bào chế qua ước Trên thị trường dược phẩm giới xuất nhiều sản phẩm nano sử dụng phòng điều trị bệnh viêm nhiễm nặng, ung thư liên quan đến liệu pháp gen Tiểu phân nano với kích thước siêu nhỏ (1-1.000nm) có cấu tạo lõi thân nước thân dầu bao quanh bề mặt thân nước, dễ dàng phân tán vào môi trường sinh lý bên thể Kích thước tiểu phân nano nhỏ nhiều so với kích thước tế bào (kích thước tế bào bình thường khoảng 10-100μm), tế bào ung thư đạt kích thước đến vài mm Chính thế, tiểu phân nano thiết kế phù hợp với đường thuốc bên thể có khả giúp vận chuyển thuốc đến vị trí cần giải phóng hoạt chất đích sinh học (mô bệnh, tế bào bệnh bào quan bên tế bào bệnh) cải thiện vượt trội tính an toàn hiệu trị liệu thuốc Hạt nano đồng tổng hợp theo nhiều phương pháp như: Phương pháp hóa nhiệt (thermal evaporation)[2], phương pháp lắng đọng hóa học (chemical vapor deposition)[3], q trình tổng hợp dung mơi nhiệt (solvothermal)[4], q trình tổng hợp thủy nhiệt (hydrothermal) Tuy nhiên, phương pháp độc hại khó tùy chỉnh kích thước mong muốn Phương pháp sinh học sử dụng lượng điện tạo từ hệ thống điện sinh học (Bioelectrochemical system – BES) pin nhiên liệu sinh học (MFC) để tổng hợp vật liệu nano biết đến phương pháp an tồn thân thiện với mơi trường Chính vậy, học viên lựa chọn đề tài ‘‘Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano Đồng hệ thống điện sinh học nhằm ức chế vi khuẩn Xanthomonas axonopodis Ralstonia solanacearum” Mục đích nghiên cứu - Chế tạo hệ pin nhiên liệu vi sinh vật nhằm tái thu hồi kim loại đồng có nước thải dạng vật liệu nano - Đánh giá đặc trưng hình thái, cấu trúc vật liệu nano đồng thu - Đánh giá khả kháng vi khuẩn vật liệu nano đồng hai chủng vi sinh vật gây bệnh cho Xanthomonas axonopodis Ralstonia solanacearum 3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Các dạng hệ thống điện sinh học chủng vi khuẩn Shewanella sử dụng hệ thống điện sinh học mơi trường nước có ion đồng tự tạo - Phạm vi nghiên cứu: Môi trường nhân tạo quy mơ phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Vật liệu nano lĩnh vực nghiên cứu quan tâm thời gian gần đặc biệt nano đồng Nhờ vào đặc tính kháng khuẩn cao mà vật liệu nano đồng ứng dụng sản xuất rộng rãi Có nhiều phương pháp để tổng hợp nano đồng hầu hết phương pháp độc hại tốn kém, phương pháp sinh học sử dụng lượng điện tạo từ hệ thống điện sinh học (Bioelectrochemical system) để tổng hợp vật liệu nano biết đến phương pháp an toàn, hiệu Chính vậy, việc ứng dụng cơng nghệ pin nhiên liệu vi sinh vật để tái thu hồi kim loại đồng từ nước thải dạng vật liệu nano biện pháp xử lý nguồn nước thải ô nhiễm kim loại nặng hiệu Nghiên cứu sử dụng nước chứa đồng nhân tạo để tổng hợp vật liệu nano đồng bước nghiên cứu tạo tiền đề cho việc xử lý nước thải ô nhiễm kim loại đồng nói chung kim loại nặng độc hại nói riêng Hơn nữa, nano đồng thu hồi cịn ứng dụng diệt loại vi khuẩn gây bệnh cây, xem loại thuốc bảo vệ thực vật an toàn hữu hiệu 51 cho thấy ảnh hưởng nước etylen glycol đến trình phát triển vi khuẩn cho thấy không ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn, không thấy xuất vòng kháng Đối với lỗ thạch nhỏ dung dịch nano đồng tương tự không thấy xất vòng kháng, điều chứng tỏ vi khuẩn Xanthomonas axonopodis nano đồng khơng thể tính kháng Hình 0.12 Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xanthomonas axonopodis sau 24h Hơn nữa, ảnh chụp SEM cho thấy tế bào vi khuẩn Xanthomonas axonopodis không bị phá vỡ nano đồng cho dù nồng độ nào, tế bào vi khuẩn nguyên vẹn, vi khuẩn hình que thấy rõ màng tế bào (Hình 3.10) Vỏ tế bào tuyến phòng thủ vi khuẩn tác nhân kháng Thông thường, bước ban đầu định kết nhiễm khuẩn hệ thống miễn dịch phụ thuộc vào cấu trúc thành phần bề mặt tế bào vi khuẩn Một phân tử bề mặt vi khuẩn nghiên cứu glycolipid gọi lipopolysaccharide (LPS), tạo hầu hết vi khuẩn gram âm, LPS tạo hàng rào thấm bề mặt tế bào thành phần 52 liên quan đến khả đề kháng bẩm sinh mà vi khuẩn gram âm thể chống lại nhiều loại kháng sinh Vi khuẩn Xanthomonas axonopodis với cấu trúc LPS ưu việt vi khuẩn gram âm khác nên dung dịch nano đồng khơng có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn 3.3.2 Hiệu ức chế nano Đồng đến vi khuẩn Ralstonia solanacearum Đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum hiệu ức chế nano đồng thể rõ rệt, nồng độ đồng cao đường kính vịng kháng lớn rõ (Hình 3.11 Bảng 3.1) Hình 0.13 Đĩa thạch thử tính kháng khuẩn nano đồng vi khuẩn Ralstonia solanacearum 53 Bảng 0.5 Kích thước vịng kháng nano đồng vi khuẩn Ralstonia solanacearum Nồng độ Nano Đồng (ppm) Đường kính trung bình vịng kháng (cm) 10 0,1 25 0,2 50 0,4 100 0,6 200 Có thể nhận thấy sau 24h thí nghiệm nano đồng thể tính kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum việc xuất vòng kháng xung quanh lỗ thử Ở nồng độ đồng 10ppm đường kính vịng kháng 0,1 cm tính đồng độ 100ppm đường kính vịng kháng tăng lên gấp lần cao 1cm nồng độ nano đồng 200ppm Như dung dịch nano đồng thể tính kháng khuẩn mạnh, ức chế sinh trưởng phát triển vi khuẩn, nồng độ đồng cao tính kháng thể mạnh Khi chụp ảnh SEM, tế bào vi khuẩn bị phá hủy dung dịch hạt nano đồng (Hình 3.12) Đồng liên kết với protein chuyên biệt số aminoacid tự công nhận chế để ngăn ngừa ảnh hưởng oxy hóa [22] Tuy nhiên, áp lực oxy hóa, tích tụ loại oxy phản ứng, điều kiện ion đồng liên kết giải phóng khỏi protein trở thành hoạt động oxy hóa khử phá vỡ cấu trúc màng tế bào vi khuẩn 54 Hình 0.14 Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Ralstonia solanacearum Màng tế bào vi khuẩn bị vỡ với tồn hạt nano Với tỷ lệ bề mặt thể tích lớn, hạt quy mô nano dễ dàng tương tác với màng vi khuẩn Hạt nano hấp thụ màng tế bào, dẫn đến khử cực Sau đó, thành tế bào thay đổi thành điện tích âm, trở nên dễ dàng bị phá vỡ, hạt nano hấp thụ màng tế bào, dẫn đến khử cực trở nên dễ dàng bị phá vỡ Nghiên cứu khác báo cáo rõ ràng chế đồng công màng tế bào Cation đồng tương tác với lipid gây q trình oxy hóa trước mở lỗ chân lơng tế bào màng, dẫn đến ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn tế bào vi khuẩn Đồng kim loại có lực lớn với amino, photphat, nhóm cacboxyl sulthydryl Do đó, phospholipid có phản ứng với kim loại nhóm photphoryl đơi nhóm cacboxyl vùng ưa nước chúng có sẵn để liên kết cation kim loại [42] Dựa dựa kết phân tích hình thái hạt nano đồng trên, giả định hạt lớn (> µm) xâm nhập vào tế bào, chúng giải phóng hạt nhỏ (