CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitrate đến sự tích luỹ astaxanthin
astaxanthin của vi tảo H. pluvialis
Vi tảo H. pluvialis đƣợc nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy mẻ, trong các bình tam giác 500ml chứa 250 ml mơi trƣờng RM và đƣợc đặt trong điều kiện nhiệt độ và chế độ chiếu sáng thích hợp. Sau 14 ngày ni cấy, sinh khối vi tảo đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm ở tốc độ 8000 rpm trong 5 phút và chuyển sang nuôi cấy trong môi trƣờng RM đƣợc loại bỏ ½ và hồn tồn nguồn nitrate với áp suất thẩm thấu đƣợc duy trì bằng việc dùng KCl thay cho các nguồn dinh dƣỡng chứa nitrate. Q trình ni cấy đƣợc duy trì trong thời gian 10 ngày. Nghiệm thức đối chứng là môi trƣờng nuôi cấy giống nhƣ ban đầu. Sau thời gian này, sinh khối vi tảo từ 10 ml dịch nuôi đƣợc thu nhận bằng cách ly tâm 5 phút ở tốc độ 12.000 rpm. Sinh khối vi tảo đƣợc ủ với 1,5 ml dung dịch DMSO ở 75oC trong 15 phút. Sau thời gian ủ, tế bào và dung dịch đƣợc phân tách bằng ly tâm. Cặn tế bào đƣợc tiếp tục tách chiết lặp lại với DMSO. Hàm lƣợng chlorophyll a, b và astaxanthin trong dịch chiết đƣợc xác định bằng phƣơng pháp do OD tại bƣớc sóng 665, 645, 630 và 480 nm (Solovchenko et al., 2010). Dựa vào kết quả thu đƣợc, xác định hàm lƣợng dinh dƣỡng nitrate phù hợp nhất cho tích luỹ astaxanthin của vi tảo.
2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của tốc đ sục khí CO2 đến sự sinh trƣởng và tích luỹ astaxanthin của vi tảo H. pluvialis trong hệ thống bioreactor
Vi tảo H. pluvialis đƣợc ni cấy trong bình ni cấy có thể tích 3 lít của hệ thống bioreactor chứa 2 lít mơi trƣờng dinh dƣỡng RM với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml. Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng đƣợc duy trì ở mức phù hợp nhất. Mơi trƣờng nuôi đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm. Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng của tốc độ sục khí CO2 đến sự sinh trƣởng của vi tảo H. pluvialis trong hệ thống bioreactor bao gồm: chỉ sục khơng khí, sục khơng khí kết hợp sục khí CO2 với lƣợng 20 ml CO2/phút, 40 ml CO2/phút, 60 ml CO2/phút. Sự sinh trƣởng của vi tảo trong ở các nghiệm thức nuôi cấy khác nhau đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo OD sau mỗi 2 ngày nuôi cấy. Kết thúc mẻ ni 10 ngày, tồn bộ sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô ở nhiệt độ 40o
C trong 48 giờ. Dựa vào kết quả gia tăng mật độ và sinh khối khô, xác định nghiệm thức sục khí CO2 phù hợp nhất cho sự sinh trƣởng của vi tảo trong hệ thống bioreactor.
11
Hình 2.1. Hệ thống bioreactor sử dụng trong nghiên cứu để nuôi vi tảo H. pluvialis
2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự sinh trƣởng và tích luỹ astaxanthin của vi tảo H. pluvialis trong hệ thống bioreactor
Vi tảo H. pluvialis đƣợc ni cấy trong bình ni cấy có thể tích 3 lít của hệ thống bioreactor chứa 2 lít mơi trƣờng dinh dƣỡng RM với mật độ ban đầu 0,5x106 tế bào/ml. Các điều kiện nhiệt độ, chế độ chiếu sáng, tốc độ sục khí đƣợc duy trì ở mức phù hợp nhất. Môi trƣờng nuôi đƣợc khuấy đảo với tốc độ 120 rpm. Các nghiệm thức thử nghiệm ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến sự sinh trƣởng của vi tảo H. pluvialis trong hệ thống bioreactor bao gồm: pH4, pH5, pH6, pH7, pH8. Ở các nghiệm thức, pH của dịch nuôi đƣợc cố định nhờ sự bổ sung dung dịch HCl 0,1N hay NaOH 0,1N bởi hệ thống bơm nhu động và cảm biến tự động của hệ thống bioreactor. Sự sinh trƣởng của vi tảo trong ở các nghiệm thức nuôi cấy khác nhau đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo OD sau mỗi 2 ngày nuôi cấy. Kết thúc mẻ nuôi 10 ngày, toàn bộ sinh khối tảo đƣợc thu nhận, sấy khô ở nhiệt độ 40oC trong 48 giờ. Dựa vào kết quả gia tăng mật độ và sinh khối khô, xác định nghiệm thức pH môi trƣờng phù hợp nhất cho sự sinh trƣởng của vi tảo trong hệ thống bioreactor.
2.7 Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo
Lipid chứa astaxanthin trong tế bào vi tảo sẽ đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp chiết ƣớt, hoặc khô sử dụng các loại dung môi hữu cơ không độc hại bao gồm: dimethyl carbonate, dimethyl ether lỏng, dầu đậu nành (có vai trị nhƣ một dung mơi) dƣới sự hỗ
12
trợ của sóng siêu âm. Sinh khối vi tảo thu nhận từ hệ thống bioreactor đƣợc lọc bằng giấy lọc GF/C. Sinh khối vi tảo có độ ẩm khoảng 82-90% đƣợc sử dụng để tách chiết astaxanthin. Phƣơng pháp tách chiết bằng dimethyl ether (DME) đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của Boonnoun et al. (2014). Sinh khối ƣớt của vi tảo đƣợc đặt vào giữa cột tách chiết, bên trên và bên dƣới đƣợc phủ bởi lớp hạt thuỷ tinh có kích thƣớc 0,77-0,99 mm. Dịng DME đƣợc bơm qua cột với tốc độ 10 cm3/phút ở nhiệt độ 20oC và áp suất chiết trong cột đƣợc duy trì 0,52 MPa. Sau khi qua cột, DME đƣợc cho bay hơi, lipid chứa astaxanthin đƣợc thu hồi (hình 3). Hiệu suất tách chiết lipid đƣợc xác định sau khi sản phẩm tách chiết đƣợc sấy loại nƣớc ở 40oC.
Hình 2.2. Sơ đồ hệ thống tách chiết astaxanthi bằng dimethyl ether. (1) Bể ổn nhiệt, (2) Bình chứa dimethyl ether lỏng, (3) Cột tách chiết, (4) Lớp hạt thuỷ tinh, (5) nhiệt, (2) Bình chứa dimethyl ether lỏng, (3) Cột tách chiết, (4) Lớp hạt thuỷ tinh, (5)
Sinh khối ƣớt vi tảo, (6) Van hạ áp, (7) Bình chứa sản phẩm
Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin sử dụng dung mơi ethanol : ethyl acetate có hỗ trợ của sóng siêu âm đƣợc thực hiện theo mô tả của Zou et al. (2013). Sinh khối vi tảo đƣợc hoà vào dung dịch ethanol 48% pha trong ethyl acetate theo tỉ lệ 1 sinh khối tảo : 20 thể tích dung dịch chiết. Hỗn hợp đƣợc đặt ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Quá trình tách chiết đƣợc thực hiện trong bể siêu âm có cơng suất 200W, tần số 40 kHz, ở 41oC trong 20 phút. Sau xử lý siêu âm, hỗn hợp đƣợc ly tâm ở tốc độ 8500 rpm trong 10 phút để thu dịch nổi. Cặn đƣợc tách chiết lặp lại. Hiệu suất tách chiết đƣợc xác định sau khi hỗn hợp ở hai lần chiết đƣợc sấy để loại nƣớc.
Phƣơng pháp tách chiết astaxanthin bằng dầu đậu nành đƣợc thực hiện theo mô tả của Sachindra và Mahendrakar (2005). Sinh khối tảo khô đƣợc trộn đều vào dầu đậu
13
nành với tỉ lệ 1:2 (w/v) và đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt ở 70oC trong 2,5 giờ. Hỗn hợp đƣợc lọc qua vải lọc và ly tâm ở tốc độ 4500 rpm trong 10 phút để tách cặn. Lớp dầu chứa sắc tố trong dịch nổi đƣợc thu nhận bằng phễu chiết
2.8 Phƣơng pháp phân tích astaxanthin thu nh n từ sinh khối vi tảo H. pluvialis
nuôi cấy trong hệ thống bioreactor bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp
Astaxanthin có trong lipid thu nhận từ sinh khối vi tảo tách chiết theo các phƣơng pháp khác nhau đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC) và phƣơng pháp HPLC. Với phƣơng pháp TLC, astaxanthin đƣợc chấm lên bản sắc ký Merck TLC Plate. Dung môi triển khai là hexan:chloroform:benzene theo tỉ lệ 10:20:1 (v:v:v). Astaxanthin trong các mẫu đƣợc xác định thông qua sự so sánh Rf với astaxanthin chuẩn. Với phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áo (HPLC) đƣợc thực hiện trong thiết bị HPLC với cột 150 × 4.5-mm Prontosil RP C-18 (Knauer, Berlin, Đức) duy trì ở nhiệt độ 25oC và detector Waters e2695 DAD (Waters, Milford, MD, USA). Pha động là hỗn hợp acetonitrile:nƣớc:ethyl acetate với tỉ lệ 98:2:0 (trong 2 phút), 40:0:60 (trong 10 phút), 0:0:100 C (trong 2 phút) (% thể tích). Tốc độ dịng 1 ml/phút và thể tích tiêm 20 μl. Sự hiện diện và hàm lƣợng astaxanthin đƣợc xác định bởi sự so sánh peak và diện tích peak với astaxanthin chuẩn.
Hiệu suất tách chiết astaxanthin từ sinh khối vi tảo H. pluvialis của các phƣơng
pháp kể trên đƣợc so sánh với phƣơng pháp tách chiết astaxanthin phổ biến dùng acetone.
2 9 Phƣơng pháp khảo sát ho t tính kháng oxy hố của astaxanthin thu nh n từ vi tảo H. pluviali
Hiệu quả kháng oxy hoá của astaxanthin thu nhận vi tảo H. pluvialis đƣợc đánh
giá thông qua phƣơng pháp xác định năng lực khử và phƣơng pháp bắt gốc tự do DPPH. Phƣơng pháp đánh giá năng lực khử đƣợc thực hiện theo mô tả bởi Yuan et al. (2013). Dịch chiết astaxanthin (1 ml) đƣợc bổ sung 2,5 ml đệm phosphate 0,2M (pH 6,6) và 1 ml K3[Fe(CN)6] 1% (w/v). Hỗn hợp đƣợc ủ ở 50oC trong 20 phút và đƣợc làm lạnh nhanh. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 2,5 ml trichloroacetic acid 10% (w/v) và đƣợc ly tâm ở tốc độ 3500 rpm trong 10 phút. Sau ly tâm, dịch nổi (2,5 ml) đƣợc thu nhận và đƣợc bổ sung 2,5 ml nƣớc cất và 0,5 ml FeCl3 0,1% (w/v). Hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ trong 10 phút và đƣợc đo độ hấp thu ở bƣớc sóng 700 nm với chất chuẩn là FeSO4.
14
Phƣơng pháp bắt gốc tự do DPPH tiến hành theo Sun và Lee (2003). Dịch chiết astaxanthin (1,5 ml) đƣợc bổ sung 1,5 ml DPPH 0,1 mM pha trong ethanol. Ở dung dịch trắng (mẫu trắng) làm tƣơng tự mẫu nhƣng thay DPPH bằng 1,5 ml cồn tuyệt đối vào từng ống. Mẫu kiểm soát chuẩn bị bằng cách làm giống nhƣ mẫu trắng nhƣng thay dịch chiết bằng DPPH. Giữ các hỗn hợp trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút tiến hành đo ở bƣớc sóng 517nm.
2 10 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Tất cả các thí nghiệm trong nghiên cứu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại. Số liệu trình bày là trung bình cộng các lần lặp lại và SD. Số liệu thu nhận đƣợc từ nghiên cứu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.
15
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát môi trƣờng nuôi cấy vi tảo H. pluvialis
Mật độ tảo bổ sung vào các môi trƣờng nuôi ban đầu đạt 2x105 tế bào/ml. Đƣờng cong sinh trƣởng của vi tảo trên các mơi trƣờng ni cấy đƣợc thể hiện qua hình 3.1. Trong các môi trƣờng thử nghiệm, ở môi trƣờng RM và Walne, vi tảo H. pluvialis đạt
hiệu quả tăng trƣởng cao hơn so với các môi trƣờng Bold’s Basal, OHM và f/2 Guillard. Trên hai môi trƣờng RM và Walne, mật độ tảo tăng nhanh trong 8 ngày đầu của mẻ ni cấy. Sự sinh trƣờng tiếp tục duy trì và đạt cực đại ở ngày thứ 18, mật độ lần lƣợt là 6,97x105 tế bào/ml ở môi trƣờng RM và 6,57x105 tế bào/ml ở môi trƣờng Walne. Sự sinh trƣởng của tảo ở hai môi trƣờng này giảm dần sau ngày thứ 20. Ở môi trƣờng Bold’s Basal và OHM, tảo tăng chậm và duy trì sự sinh trƣởng cho đến ngày thứ 16 và đạt mật độ tƣơng ứng là 5,12x105 và 4,14x105 tế bào/mL. Sự sinh trƣởng của tảo thấp nhất trên môi trƣờng f/2 Guillard. Mật độ tảo tăng chậm và sự sinh trƣởng chỉ duy trì đến ngày thứ 14 của mẻ nuôi. Nghiên cứu của Imamoglu,Sukan và Dalay (2007). đối với sự sinh trƣởng của H. pluvialis trên các môi trƣờng RM, BG11, OHM và Bold’s
Basal cũng nhƣ nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng et al. (2010) trên các môi trƣờng RM, OHM, C và BG11 đều cho thấy sự sinh trƣởng tốt nhất xảy ra trên môi trƣờng RM. Mật độ tế bào H. pluvialis đạt từ 3,8 x105
đến 9,5 x105 tế bào/ml (Đặng Diễm Hồng et al., 2010; Imamoglu,Sukan và Dalay, 2007).
Có sự khác biệt về kích thƣớc của tế bào vi tảo trên các mơi trƣờng ni cấy (hình 3.2). Trên mơi trƣờng RM và mơi trƣờng Walne, tế bào tảo có kích thƣớc lớn, đạt trung bình lần lƣợt là 27,6±2,7 μm và 25,4±3,5 μm. Trên môi trƣờng Bold’s Basal, tế bào tảo cũng có kích thƣớc khá lớn, đạt trung bình 21,8 μm, tuy nhiên nội chất của tế bào vi tảo trên mơi trƣờng này ít đậm đặc hơn so với mơi trƣờng RM và Walne, thể hiện thông qua khối lƣợng khô của sinh khối vi tảo tích lũy thấp hơn sau 22 ngày ni cấy (bảng 3.1). Ở môi trƣờng OHM và f/2 Guillard, kích thƣớc tế bào tảo nhỏ, trung bình lần lƣợt là 16,3±2,2 μm và 15,6±3,9 μm. Cũng trên hai mơi trƣờng này, qua các thế hệ, kích thƣớc tế bào tảo có xu hƣớng giảm dần. Nhƣ vậy, trong các môi trƣờng khảo sát, môi trƣờng RM đƣợc đánh giá là phù hợp cho sự sinh trƣởng của vi tảo H. pluvialis so với các môi trƣờng nuôi cấy khác.