Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến cô giáo tôi: PGS TS Phạm Thị Thựy, người hết lũng quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn giúp tơi học hỏi để hồn thành tốt cơng việc suốt q trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Phương Đơng, Văn phịng khoa cơng nghệ sinh học & môi trường Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt khóa luận Xin cảm ơn giúp đỡ, động viên, nhắc nhở gia đình bạn bố Một lần nữa, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất thầy cơ, bạn bè gia đình giúp đỡ ủng hộ tơi để tơi hồn thành tốt khố luận Hà Nội ngày 15 thỏng năm 2010 Sinh viên Trần Thùy Hương Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT MỤC LỤC Trang PHẦN I: MỞ ĐẦU…………………………………………………………1 PHẦN II: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU……………………………… I Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo giới…………3 II Gía trị dược liệu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps………………5 III Công dụng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps…………………….7 IV Nghiên cứu lâm sàng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps…… …9 V Công nghệ sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo………………………….13 VI Nghiên cứu nấm Cordyceps Việt Nam………………………………14 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………………16 I Thời gian địa điểm nghiên cứu…………………………………… 16 II Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… 16 III Nội dung phương pháp nghiên cứu……………………………… 17 Nội dung…………………………………………………………… 17 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………… 18 2.1 Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu…………………………………………… 18 2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến phát triển nấm Cordyceps militaris môi trường tối ưu nhất…………………19 2.3 Xác định giá trị dược liệu thành phần hóa học nấm Cordyceps militaris……………………………………………….20 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………… 21 I Nghiên cứu số môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT để xác định môi trường tối ưu cho nấm phát triển…………………………22 II So sánh khả phát triển nấm Cordyceps militaris hai môi trường PDA MYPS……………………………………….24 III Mô tả số đặc điểm nấm Cordyceps militaris phát triển môi trường MYPS………………………………………….27 IV Nghiên cứu phát triển khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris môi trường MYPS theo thời gian…………………………………… 29 V Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ độ ẩm đến phát triển nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris………………………….36 VI Xác định giá trị dược liệu thành phần hóa học nấm Cordyceps militaris……………………………………………….38 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………40 A Kết luận……………………………………………………………… 40 B Đề nghị……………………………………………………………… 41 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………… 42 Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT PHẦN I MỞ ĐẦU Nấm Đ«ng trïng h tho (ĐTHT) mt loi nm ký sinh trờn cụn trựng, không ch c nhà khoa hc nghiên cu, mà c c xó hi quan tõm n, nấm loại dược liệu quý, tốt cho sức khoẻ người, phù hợp với lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thiếu niên, người già Theo tài liệu ghi chép đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo vị thuốc bồi bổ quý giá, có tác dụng tích cực với bệnh rối loạn tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, có tác dụng tốt trẻ em còi xương chậm lớn Một số nghiên cứu đại gần nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng làm tăng cường cơng tuyến thượng thận, cải thiện chức thận, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư chất phóng xạ [10,11] Trên giới, nấm Đông trùng hạ thảo nhà khoa học nghiên cứu thu nhiều thành tựu có giá trị Với cơng nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước thành công việc nuôi cấy chất Cordyceps phát triển công nghiệp sản xuất Cordyceps Công ty Biofact life (Malaysia) kết hợp công nghệ tiên tiến Nhật nước khác nuôi cấy thành công nấm Cordyceps môi trường nhân tạo để tạo hai hoạt chất Cordycepin Adenosine tạo từ hệ sơi nấm Các nớc nh Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, Malaysia đà sản xuất đợc nm Đông trùng hạ thảo quy mô công nghiệp t nhng nm 1995, th kỷ XX Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo bắt đầu, cịn gặp nhiều khó khăn, sớ vật chất kiến thức Cho đến chưa có tổ chức, quan áp dụng thành công công nghệ sinh học tiên tiến để nuôi cấy sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức cho người Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT Để góp phần vào nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp nấm Đơng trùng hạ thảo Việt Nam, giao thực đề tài: “NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS ” Mục đích yêu cầu ®Ỉt a Mục đích Nghiên cứu mơi trường ni nấm Cordyceps militaris ®Ĩ xác định mơi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris sinh trưởng phát triển tốt Xác định số đặc điểm hình thái sinh trưởng phát triển nấm Cordyceps militaris mơi trường thích hơp Bước đầu xác định giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris b Yêu cầu Xác định thành phần môi trường ni cấy cho nấm Cordyceps militaris ph¸t triĨn tèt Xỏc nh c ảnh hởng yếu tố nhiệt độ Èm ®é ®Õn Èm ®é ®Õn sinh trưởng phát triển nÊm Cordyceps militaris Xác định giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT PHẦN II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I Tình hình nghiên cứu nấm Đơng trùng hạ thảo trªn thÕ giíi 1.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo nhà khoa học Trung Quốc xác đinh đầu xuất từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu thực chất tượng ấu trùng loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh Năm 1878 nhà khoa học phát nấm ký sinh sâu non (ấu trùng) lồi trùng thuộc chi Thitarodes Thường dễ gặp sâu non loài Thitarodes baimaensis Thitarodes armoricanus, ngồi cịn 46 lồi khác thuộc chi Thitarodes bị Cordyceps sinensis ký sinh Vào cuối mùa thu chất da sâu non họ ngài đêm (Noctuidae) tương tác với bào tử nấm tạo sợi nấm, sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng chất dinh dưỡng để phát triển Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh gây chết sâu, sau chúng hình thành chồi, phát triển chui khỏi mặt đất, gốc dính vào đầu sâu Do nhiều người gọi nấm Đơng trùng hạ thảo mùa đơng nấm sống thể trùng, mùa hè nấm phát triển ngồi thể giống cỏ (hình 1) [8, 9] Đầu kỷ XVIII, người truyền giáo Châu Âu đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, họ coi nước Pháp nước có y học đại Đến nhiều nước nghiên cứu, điều tra thu thập nấm Đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris ngồi tự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức phục vụ cho người [10] Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT Hình 1: Nhộng Đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris ( nguồn http://thucphamchucnang.files.won ) 1.2 Sù ph©n bố nấm Đơng trùng hạ thảo Theo tài liệu báo điện tử [8, 9] nấm Đơng trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy vào mùa hè, vùng núi cao 4.000 m cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc Vân Nam, Theo nhà khoa học chi nấm Cordyceps có tới 400 lồi khác nhau, tính riêng Trung Quốc tìm thấy khoảng 60 lồi Đơng trùng hạ thảo Tuy nhiên người ta nghiên cứu lồi nấm Cordyceps sinensis Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với người Vị thuốc thực chất tượng ký sinh thể ấu trùng lồi bướm có tên khoa học Thitarodes thuộc chi Cordyceps, chđ u lµ Thitarodes baimaensis Thitarodes armoricanus Loài nấm phân bố rộng châu Á với trung tâm đa dạng vùng Đông Á Châu Úc 1.3 Cơ chế lây nhiễm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps vào thể côn trùng Theo Bách khoa tồn thư [8] lồi nấm Cordyceps lây nhiễm vào thể s©u hại đến chưa rõ nguyên nhân Những sâu ăn phải bào tử nấm chúng mặc bệnh nấm ký sinh từ lỗ thở Đến sợi nấm Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào mơ vật chủ, sử dụng hồn tồn chất dinh dưỡng thể sâu Đến giai đọan định, nấm phát triển thành dạng (hình dạng giống thực vật) phát tán bào tử Nấm Đơng trùng hạ thảo cịn sống, người ta trơng rõ hình sâu, với cành nhỏ, mọc Khi sấy khơ, có mùi cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng - 11cm sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngồi có màu vàng xẫm nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía gần đầu nhỏ Phần đầu có màu nâu đỏ, giống tằm, có tất cặp chân, đôi rõ Chất đệm nấm hình que cong mọc từ sâu non, dài sâu non chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên căng đầy, màu trắng vàng; chất đệm nấm dai bên ruột rỗng, có màu trắng ngà [11, 12] II Giá trị dược liệu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps: Năm 1993, Đông trùng hạ thảo làm giới kinh ngạc qua kiện thể thao quốc tế Một nữ vận động viên người Trung Quốc liên tục phá kỷ lục giới nội dung chạy cự ly 1000 m, 3000 m 10000 m Thành công người nữ vận động viên phần nhờ vào dùng Đông trùng hạ thảo bữa ăn hàng ngày Tập đồn Dược phẩm Tasly nhân giống Đơng trùng hạ thảo vùng đầm lầy cao nguyên có độ cao 4000 m Nhờ đó, Tasly phân lập chiết xuất hết hoạt động sinh học có giá trị dược liệu Đơng trùng hạ thảo, tạo nên viên nang Tasly Hoàng trùng thảo với hàm lượng Polissaccharid cao Hướng cho Trung Quốc có thương hiệu Đơng trùng hạ thảo xuất vi tồn cầu Nấm §THT có chất dược liệu quý ch yếu l ẩm độ đến Cordycepin Adenosine, nhiều chất khác có tác dụng tèt cho ngêi nh: Protein, Acid amin, Vitamin, Lipit, Polysaccharide,và khoáng chất, … Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT Phân tích hoá học cho thấy sinh khối (biomass) ĐTHT có 17 acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na ) Quan trọng sinh khối ĐTHT có nhiều chất hoạt động sinh học mà nhà khoa học phát nhờ tiến ngành hoá học hợp chất tự nhiên Trong phải kể đến chất Cordiceptic acid, Cordycepin, Adenosine, Hydroxyethyl-adenosine Đáng ý nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl-Adenosine- Analogs) Ngoµi cịn có chứa nhiều loại Vitamin (trong 100g ĐTHT có 0,12 g, vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg, vitamin C, cịn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K ) [11] Sau giá trị dược liệu quan trọng số chất: 2.1 Chất Cordycepin ( 3- deoxyadenosine ) có nấm ĐTHT với hàm lượng 0.006 mg/g, lµ dạng analoge Adenosine, chất có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn chặn ung thư, ung thư vòm họng, bệnh lao (tuberculosis bird-type) người … 2.2 Chất acid Cordycepic ( dạng D-mannitol ) cđa §THT thiên nhiên có hàm lượng 30.05 mg/g Chất Acid Cordycepic có tác dụng giảm ho hen suyễn, giảm đường huyết kháng vi khuẩn 2.3 Chất SOD, chất chống oxi hóa ( Superoxide Dismutase ) nấm ĐTHT có hàm lượng 149.4 U/ml, cã t¸c dơng chống lại thấp khớp, phát ban đỏ lupus, viêm tấy da hay cơ, ung thư phóng xạ, có khả chống lại lão hóa làm đẹp da [10, 11] 2.4 Chất Polysaccharide có hàm lượng 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị bệnh tim phổi, viêm phế quản mãn tính tuổi già cải thiện khả giải độc gan Hàm lượng Polysaccharide thiên nhiên 94,6 mg/g, có tác dụng gia tăng hệ miễn dịch, chống ung thư, điều trị bệnh tim phổi, viêm phế quản mãn tính tuổi già cải thiện khả giải độc gan [9, 10] Trần Thùy Hương 506301024 Khóa luận tốt nghiệp Khoa CNSH & MT 2.5 Chất Manitol tìm thấy nhiều thực vật, nấm Đơng trùng hạ thảo có hàm lượng diosmol cao nhất, ngồi cơng dụng làm giảm mỡ máu, đường máu cholesterol Chất Manitol giúp cho mạch máu giãn mỡ, phòng chống bệnh tim mạch hữu hiệu 2.6 Chất Adenosin có vai trị quan trọng q trình chuyển hóa lượng thể Chất giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên tim mạch, cải thiện lực cho bắp, giảm sinh trưởng tế bào thối hóa, tăng lượng oxy máu…Vì việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho thể vô cúng cần thiết, giúp cho người dồi lượng để lao động hiệu III Công dụng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps Các nghiên cứu y học dược học chứng minh nấm Đơng trùng hạ thảo Cordyceps có tác dụng sau: 1- Chống lại tác dụng xấu tân dược thận, thí dụ độc tính Cephalosporin A - Bảo vệ thận trường hợp gặp tổn thưng thiếu máu - Chống lại suy thoái thận, xúc tiến việc tái sinh phục hồi tế bào tiểu quản thận - Làm hạ huyết áp người cao huyết áp - Chống lại tượng thiếu máu tim - Giữ ổn định nhịp đập tim - Tăng cường tính miễn dịch khơng đặc hiệu - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu - Tăng cường lực thực bào tế bào miễn dịch 10 - Tăng cường tác dụng nội tiết tố tuyến thượng thận làm trương nở nhánh khí quản 12 - Làm chậm q trình lão hố thể 13 - Hạn chế bệnh tật tuổi già 14 - Nâng cao lực chống ung thư thể Trần Thùy Hương 506301024