LỜI CẢM ƠN
Trước tiờn, tụi xin được gửi lời cảm ơn trõn trọng nhất đến cụ giỏo của tụi:
PGS TS Phạm Thị Thựy, người đú hết lũng quan tõm, tận tỡnh chỉ bảo, hướng
dẫn giỳp tụi học hỏi để hoàn thành tốt cụng việc trong suốt quỏ trỡnh thực tập Tụi xin chõn thành cảm ơn Ban lónh đạo trường Đại học Phương Đụng, Văn
phũng khoa cụng nghệ sinh học & mụi trường và Ban Giỏm đốc Viện Bảo vệthực vật đú tạo mọi điều kiện để tụi hoàn thành tốt khúa luận của mỡnh.
Xin cảm ơn sự giỳp đỡ, động viờn, nhắc nhở của gia đỡnh và bạn bố.
Một lần nữa, tụi xin được bày tỏ lũng biết ơn sõu sắc đến tất cả thầy cụ, bạnbố và gia đỡnh đú giỳp đỡ và ủng hộ tụi để tụi hoàn thành tốt khoỏ luận.
Hà Nội ngày 15 thỏng 5 năm 2010 Sinh viờn
Trang 2MỤC LỤC
Trang
PHẦN I: MỞ ĐẦU…………………………………………………………1
PHẦN II: TỔNG QUAN NGHIấN CỨU……………………………… 3
I Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về nấm Đụng trựng hạ thảo trờn thế giới…………3
II Gớa trị dược liệu của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps………………5
III Cụng dụng của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps…………………….7
IV Nghiờn cứu lõm sàng của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps…… …9
V Cụng nghệ sản xuất nấm Đụng trựng hạ thảo………………………….13
VI Nghiờn cứu nấm Cordyceps ở Việt Nam………………………………14
PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU……………………………………………………………16
I Thời gian và địa điểm nghiờn cứu…………………………………… 16
II Vật liệu nghiờn cứu…………………………………………………… 16
III Nội dung và phương phỏp nghiờn cứu……………………………… 17
1 Nội dung…………………………………………………………… 17
2 Phương phỏp nghiờn cứu…………………………………………… 18
2.1 Nghiờn cứu mụi trường nuụi cấy nấm Cordyceps militarisđể xỏc định mụi trường tối ưu…………………………………………… 18
2.2 Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy đến sự phỏt triểncủa nấm Cordyceps militaris trờn mụi trường tối ưu nhất…………………19
2.3 Xỏc định giỏ trị dược liệu và thành phần húa học của nấm Cordyceps militaris……………………………………………….20
PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIấN CỨU………………………………… 21
Trang 3để xỏc định mụi trường tối ưu cho nấm phỏt triển…………………………22
II So sỏnh khả năng phỏt triển của nấm Cordyceps militaristrờn hai mụi trường PDA và MYPS……………………………………….24
III Mụ tả một số đặc điểm của nấm Cordyceps militaris phỏt triển trờn mụi trường MYPS………………………………………….27
IV Nghiờn cứu sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaristrờn mụi trường MYPS theo thời gian…………………………………… 29
V Nghiờn cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến sự phỏt triểncủa nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris………………………….36
VI Xỏc định giỏ trị dược liệu và thành phần húa họccủa nấm Cordyceps militaris……………………………………………….38
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………40
A Kết luận……………………………………………………………… 40
B Đề nghị……………………………………………………………… 41
Trang 4PHẦN I
MỞ ĐẦU
Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là một loại nấm ký sinh trờn cụn trựng,không chỉ được các nhà khoa học nghiên cứu, mà cịn được cả xó hội quan tõmđến, vỡ nấm là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khoẻ con người, phự hợp vớimọi lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thanh thiếu niờn, cho đến người già.Theo cỏc tài liệu ghi chộp về đụng dược cổ, Đụng trựng hạ thảo là một vị thuốcbồi bổ hết sức quý giỏ, cú tỏc dụng tớch cực với cỏc bệnh như rối loạn tỡnh dục,thận hư, liệt dương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, và cú tỏc dụng tốt đối vớitrẻ em cũi xương chậm lớn Một số nghiờn cứu hiện đại gần đõy đó chỉ ra rằngnấm Đụng trựng hạ thảo cú tỏc dụng làm tăng cường cụng năng của tuyến thượngthận, cải thiện được chức năng thận, nõng cao năng lực miễn dịch, khỏng khuẩn,khỏng virus, chống ung thư và chất phúng xạ [10,11].
Trờn thế giới, nấm Đụng trựng hạ thảo đó được cỏc nhà khoa học nghiờn cứuvà thu được rất nhiều thành tựu cú giỏ trị Với cụng nghệ sinh học tiờn tiến, nhiều
nước đó thành cụng trong việc nuụi cấy chất nền Cordyceps và phỏt triển nềncụng nghiệp sản xuất Cordyceps Cụng ty Biofact life (Malaysia) đó kết hợp
cụng nghệ tiờn tiến của Nhật và cỏc nước khỏc nuụi cấy thành cụng nấm
Cordyceps trờn mụi trường nhõn tạo để tạo ra hai hoạt chất chớnh là Cordycepinvà Adenosine được tạo ra từ hệ sơi nấm Các nớc như Trung Quốc, Hàn Quốc,
Mỹ, Nhật Bản, Malaysia đã sản xuất đợc nấm Đông trùng hạ thảo trên quy môcông nghiệp từ những năm 1995, thế kỷ XX.
Ở Việt Nam việc nghiờn cứu về nấm Đụng trựng hạ thảo mới chỉ bắt đầu,cho nờn cũn gặp nhiều khú khăn, cả về cơ sớ vật chất và kiến thức Cho đến naychưa cú một tổ chức, cơ quan nào ỏp dụng được thành cụng cụng nghệ sinh học
tiờn tiến để nuụi cấy và sản xuất nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps để làm
Trang 5Để gúp phần vào nghiờn cứu mụi trường nuụi cấy thớch hợp nấm Đụng trựnghạ thảo ở Việt Nam, chỳng tụi được giao thực hiện đề tài:
“NGHIấN CỨU MễI TRƯỜNG NUễI CẤY NẤM ĐễNG TRÙNG HẠ THẢO
CORDYCEPS MILITARIS ”
Mục đớch và yờu cầu đặt ra a Mục đớch.
1 Nghiờn cứu mụi trường nuụi nấm Cordyceps militaris để xỏc địnhmụi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris sinh trưởng và phỏt triển tốt.
2 Xỏc định được một số đặc điểm hỡnh thỏi và sự sinh trưởng phỏt
triển của nấm Cordyceps militaris trờn mụi trường thớch hơp.
3 Bước đầu xỏc định giỏ trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris.
b Yờu cầu.
1 Xỏc định được thành phần mụi trường nuụi cấy cho nấm
Cordyceps militaris phát triển tốt.
2 Xỏc định được ảnh hởng của yếu tố nhiệt độ v ẩm độ đến à ẩm độ đến sự sinh
trưởng và phỏt triển của nấm Cordyceps militaris.
Trang 6PHẦN II
TỔNGQUANNGHIấNCỨU
I Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về nấm Đụng trựng hạ thảo trên thế giới 1.1 Sơ lược lịch sử nghiờn cứu về nấm Đụng trựng hạ thảo
Nấm Đụng trựng hạ thảo được cỏc nhà khoa học Trung Quốc xỏc đinh mớiđầu xuất hiện từ vựng nỳi cao nguyờn Tõy Tạng, loại dược liệu này thực chất là
hiện tượng ấu trựng cỏc loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps
sinensis (Berk.) Sacc ký sinh Năm 1878 cỏc nhà khoa học đó phỏt hiện ra nấm
này ký sinh trờn sõu non (ấu trựng) của một loài cụn trựng thuộc chi Thitarodes.Thường dễ gặp nhất ở sõu non loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes
armoricanus, ngoài ra cũn 46 loài khỏc thuộc chi Thitarodes cũng cú thể bịCordyceps sinensis ký sinh Vào cuối mựa thu cỏc chất trờn da của sõu non họ
ngài đờm (Noctuidae) tương tỏc với cỏc bào tử nấm và tạo ra cỏc sợi nấm, cỏc sợi
nấm đó đõm sõu vào ấu trựng, coi chỳng là chất dinh dưỡng để phỏt triển Đếnđầu mựa hố năm sau, nấm phỏt sinh mạnh và gõy chết sõu, sau đú chỳng hỡnhthành chồi, phỏt triển chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dớnh vào đầu sõu Dođú nhiều người gọi là nấm Đụng trựng hạ thảo bởi vỡ mựa đụng nấm sống trongcơ thể cụn trựng, mựa hố thỡ nấm phỏt triển ra ngoài cơ thể giống như cõy cỏ(hỡnh 1) [8, 9].
Đầu thế kỷ XVIII, những người truyền giỏo Chõu Âu đó đưa Đụng trựng hạthảo đến với nước Phỏp để nghiờn cứu, và họ coi nước Phỏp là nước cú nền y họchiện đại Đến nay rất nhiều nước đó nghiờn cứu, điều tra và thu thập nấm Đụng
trựng hạ thảo Cordyceps militaris ngoài tự nhiờn để làm nguyờn liệu sản xuất ra
Trang 7
Hỡnh 1: Nhộng Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris
( nguồn http://thucphamchucnang.files.won )
1.2 Sự phân bố của nấm Đụng trựng hạ thảo
Theo tài liệu của bỏo điện tử [8, 9] nấm Đụng trựng hạ thảo chủ yếu tỡm thấyđược vào mựa hố, ở vựng nỳi cao trờn 4.000 m như cao nguyờn Tõy Tạng, TứXuyờn, Thanh Hải, Cam Tỳc và Võn Nam, Theo cỏc nhà khoa học thỡ chi nấm
Cordyceps cú tới 400 loài khỏc nhau, tớnh riờng ở Trung Quốc đó tỡm thấy
khoảng 60 loài Đụng trựng hạ thảo Tuy nhiờn cho đến nay người ta mới chỉ
nghiờn cứu được 2 loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris cú giỏ trị
dược liệu tốt với con người.
Vị thuốc này thực chất là hiện tượng ký sinh trờn cơ thể ấu trựng của loài
bướm cú tờn khoa học là Thitarodes thuộc chi Cordyceps, chủ yếu là Thitarodes
baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus Loài nấm này phõn bố rộng ở chõu Á
với trung tõm đa dạng là vựng Đụng Á và Chõu Úc.
1.3 Cơ chế lõy nhiễm của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps vào cơ thể
cụn trựng
Theo Bỏch khoa toàn thư [8] thỡ loài nấm Cordyceps lõy nhiễm vào cơ thể
Trang 8phỏt triển mạnh, chỳng xõm nhiễm vào cỏc mụ của vật chủ, sử dụng hoàn toàncỏc chất dinh dưỡng trong cơ thể sõu Đến một giai đọan nhất định, nấm phỏttriển thành dạng cõy (hỡnh dạng giống thực vật) và phỏt tỏn bào tử.
Nấm Đụng trựng hạ thảo khi cũn sống, người ta cú thể trụng rừ hỡnh con sõu,với đuụi là một cành nhỏ, mọc lỏ Khi sấy khụ, nú cú mựi tanh như cỏ, đốt lờn cúmựi thơm Phần "lỏ" hỡnh dạng giống ngún tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấmmọc dớnh liền vào đầu sõu non mà thành Đầu sõu non giống như con tằm, dàichừng 3-5 cm, đường kớnh khoảng 0,3 - 0,8 cm Bờn ngoài cú màu vàng xẫmhoặc nõu vàng với khoảng 20-30 vằn khớa, vằn khớa ở gần đầu nhỏ hơn Phần đầucú màu nõu đỏ, đuụi giống như đuụi con tằm, cú tất cả 8 cặp chõn, nhưng 4 đụi ởgiữa là rừ nhất Chất đệm nấm hỡnh que cong mọc ra từ mỡnh sõu non, dài hơnsõu non một chỳt Sõu non dễ bẻ góy, ruột bờn trong căng đầy, màu trắng hơivàng; chất đệm nấm khỏ dai và bờn trong ruột hơi rỗng, cú màu trắng ngà [11, 12].
II Giỏ trị dược liệu của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps:
Năm 1993, Đụng trựng hạ thảo đó làm cả thế giới kinh ngạc qua sự kiện thểthao quốc tế Một nữ vận động viờn người Trung Quốc đó liờn tục phỏ kỷ lục thếgiới nội dung chạy cự ly 1000 m, 3000 m và 10000 m Thành cụng của người nữvận động viờn này một phần nhờ vào dựng Đụng trựng hạ thảo trong bữa ăn hàngngày.
Tập đồn Dược phẩm Tasly đó nhõn giống Đụng trựng hạ thảo đầu tiờn ởvựng đầm lầy cao nguyờn cú độ cao trờn 4000 m Nhờ đú, Tasly đó phõn lập vàchiết xuất được hết hoạt động sinh học cú giỏ trị dược liệu của Đụng trựng hạthảo, tạo nờn viờn nang Tasly Hoàng trựng thảo với hàm lượng Polissaccharidcao Hướng đi này đó cho Trung Quốc cú thương hiệu Đụng trựng hạ thảo đóxuất khẩu vi tồn cầu.
Nấm ĐTHT cú cỏc chất dược liệu quý chủ yếu l à ẩm độ đến Cordycepin và Adenosine,ngồi ra cịn nhiều chất khác cũng có tác dụng tốt cho con ngời nh: Protein, Acid
Trang 9Phõn tớch hoỏ học cho thấy trong sinh khối (biomass) của ĐTHT cú 17 acid
amin khỏc nhau, cú D-mannitol, cú lipid, cú nhiều nguyờn tố vi lượng (Al, Si, K,
Na ) Quan trọng hơn là trong sinh khối ĐTHT cú nhiều chất hoạt động sinh họcmà cỏc nhà khoa học đang phỏt hiện dần dần ra nhờ cỏc tiến bộ của ngành hoỏ
học cỏc hợp chất tự nhiờn Trong đú phải kể đến chất Cordiceptic acid,
Cordycepin, Adenosine, Hydroxyethyl-adenosine Đỏng chỳ ý hơn cả là nhúm
hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Ethyl-Adenosine- Analogs) Ngoài ra cũn cú chứanhiều loại Vitamin (trong 100g ĐTHT cú 0,12 g, vitamin B12; 29,19 mg vitamin
A; 116,03 mg, vitamin C, ngoài ra cũn cú vitamin B2 (riboflavin), vitamin E,vitamin K ) [11].
Sau đõy là giỏ trị dược liệu quan trọng của một số chất:
2.1 Chất Cordycepin ( 3- deoxyadenosine ) cú trong nấm ĐTHT với hàm lượng
là 0.006 mg/g, đõy là một dạng analoge của Adenosine, chất này cú tỏc dụngngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn chặn ung thư, ung thư vũm họng, bệnh lao
(tuberculosis bird-type) ở người ….
2.2 Chất acid Cordycepic ( một dạng D-mannitol ) của ĐTHT ở thiờn nhiờn cú
hàm lượng là 30.05 mg/g Chất Acid Cordycepic cú tỏc dụng giảm ho và hen
suyễn, giảm đường huyết và khỏng vi khuẩn.
2.3 Chất SOD, một chất chống oxi húa ( Superoxide Dismutase ) ở nấm ĐTHT
cú hàm lượng là 149.4 U/ml, có tác dụng chống lại thấp khớp, phỏt ban đỏ lupus,viờm tấy da hay cơ, ung thư và phúng xạ, nú cũng cú khả năng chống lại lóo húavà làm đẹp làn da [10, 11].
2.4 Chất Polysaccharide cú hàm lượng là 94,6 mg/g, cú tỏc dụng gia tăng hệ
miễn dịch, chống ung thư, điều trị cỏc bệnh về tim phổi, viờm phế quản món tớnhở tuổi già cũng như cải thiện khả năng giải độc của gan.
Trang 102.5 Chất Manitol cú thể tỡm thấy ở nhiều thực vật, nhưng ở nấm Đụng trựng hạ
thảo cú hàm lượng diosmol là cao nhất, ngoài cụng dụng làm giảm mỡ mỏu,đường mỏu và cholesterol Chất Manitol cũn giỳp cho mạch mỏu gión mỡ, phũng
chống bệnh tim mạch rất hữu hiệu.
2.6 Chất Adenosin cú vai trũ quan trọng trong quỏ trỡnh chuyển húa năng lượng
của cơ thể Chất này giỳp cải thiện tuần hoàn ngoại biờn và tim mạch, cải thiệnnăng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của cỏc tế bào thoỏi húa, tăng lượng oxy
trong mỏu…Vỡ vậy việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ thể là vụ cỳng
cần thiết, giỳp cho con người luụn dồi dào năng lượng để lao động hiệu quả.
III Cụng dụng của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps
Cỏc nghiờn cứu y học và dược học đó chứng minh được nấm Đụng trựng hạ
thảo Cordyceps cú những tỏc dụng sau:
1- Chống lại tỏc dụng xấu của cỏc tõn dược đối với thận, thớ dụ đối với độc
tớnh của Cephalosporin A.
2 - Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thưng do thiếu mỏu.
3 - Chống lại sự suy thoỏi của thận, xỳc tiến việc tỏi sinh và phục hồi cỏc tếbào tiểu quản ở thận.
4 - Làm hạ huyết ỏp ở người cao huyết ỏp.5 - Chống lại hiện tượng thiếu mỏu ở cơ tim.6 - Giữ ổn định nhịp đập của tim.
7 - Tăng cường tớnh miễn dịch khụng đặc hiệu.8 - Điều tiết tớnh miễn dịch đặc hiệu.
9 - Tăng cường năng lực thực bào của cỏc tế bào miễn dịch.
10 - Tăng cường tỏc dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trươngnở cỏc nhỏnh khớ quản.
12 - Làm chậm quỏ trỡnh lóo hoỏ của cơ thể.13 - Hạn chế bệnh tật của tuổi già.
Trang 1115 - Chống lại tỡnh trạng thiếu oxygen của cơ thể.
16 - Tăng cường tỏc dụng lưu thụng mỏu trong cơ thể.
17 - Hạn chế tỏc hại của tia gamma đối với cơ thể.
18 - Tăng cường tỏc dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh.19 - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong mỏu.
20 - Làm giảm cholesterol trong mỏu và chống xơ vữa động mạch.21- Xỳc tiến tỏc dụng của cỏc nội tiết tố (hoocmon).
22 - Tăng cường chức năng tiờu hoỏ và hấp thu cỏc chất dinh dưỡng.23 - Ức chế vi sinh vật cú hại, kể cả vi khuẩn lao.
24 - Khỏng viờm và tiờu viờm.
25 - Cú tỏc dụng cường dương và chống liệt dương.
Với những tỏc dụng trờn thỡ nấm Đụng trựng hạ thảo cũn trực tiếp ảnh hưởngđến một số hệ thống quan trọng trong cơ thể
3.1 Đối với hệ thống miễn dịch:
Những nghiờn cứu thực nghiệm ở Trung Quốc đó chứng minh ĐTHT cúkhả năng làm tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịchthể Cụ thể là nấm cú tỏc dụng nõng cao hoạt tớnh của đại thực bào và cỏc tế bào
nhiễm khuẩn Chỳng điều tiết cỏc phản ứng đỏp của tế bào lympho B, tăng
cường một cỏch cú chọn lọc hoạt tớnh của cỏc tế bào ức chế, làm tăng nồng độcỏc khỏng thể IgG, IgM trong huyết thanh Mặt khỏc, nấm ĐTHT cũn là một vịthuốc ức chế miễn dịch cú tỏc dụng chống lại sự lóo húa của cỏc tế bào.
3.2 Đối với hệ thống tuần hồn tim, nóo:
Nấm ĐTHT cú tỏc dụng làm gión mạch mỏu, làm tăng lưu lượng tuầnhồn nóo và tim, thụng qua cơ chế hưng phấn thực thể M ở cơ trơn thành mạch.Mặt khỏc, nấm ĐTHT cũn cú khả năng điều chỉnh lipit mỏu, làm giảm lượng
cholesterol và lipoprotein, hạn chế quỏ trỡnh tiến triển của tỡnh trạng xơ vữa
Trang 123.3 Đối với hệ hụ hấp:
Nấm ĐTHT cú tỏc dụng bỡnh xuyễn, trừ đờm và phũng chống khớ phếthũng Điều này làm sỏng tỏ quan điểm của cổ nhõn xa xưa cho rằng nấm Đụngtrựng hạ thảo cú khả năng “bảo phế, ớch thận” và “dĩ lao khỏi” [11].
3.4 Đối với hệ thống nội tiết:
Cỏc tỏc giả Chen L.T, Cao H.F & Huang W.F năm 2009 cho biết nấmĐụng trựng hạ thảo cú tỏc dụng làm tăng trọng lượng tuyến vỏ thượng thận và
tăng tổng hợp cỏc hoocmon tuyến này, đồng thời nấm cú tỏc dụng tương tự như
hormon nam tớnh và làm tăng trọng lượng tinh hoàn cũng như cỏc cơ quan sinh
dục phụ trờn động vật thực nghiệm Ngoài ra, ĐTHT cũn cú tỏc dụng chống ungthư, chụng viờm nhiễm, chống quỏ trỡnh lóo hoỏ và trấn tĩnh chống co giật [12].
IV Nghiờn cứu lõm sàng của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps sp
Cỏc nhà y học cổ truyền trong và ngồi nước đó nghiờn cứu sử dụng nấmĐTHT để điều trị thành cụng khỏ chứng bệnh như rối loạn mỏu, viờm phế quảnmón và hen phế quản, viờm thận món tớnh và suy thận, rối loạn nhịp tim, caohuyết ỏp, viờm mũi dị ứng, viờm gan B mạn tớnh, ung thư phổi (cú tỏc dụng hỗtrợ) và thiểu năng sinh dục Viện nghiờn cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc)cũng đó dựng nấm ĐTHT để điều trị cho cỏc bệnh nhõn bị liệt dương, kết quảđạt được khỏ tốt.
Trang 13Cỏc nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc, đó nghiờn cứu dựng nấm ĐTHTđiều trị thành cụng khỏ nhiều bệnh như: Rối loạn lipid mỏu (hiệu quả đạt 76,2%),viờm phế quản mạn tớnh và hen phế quản, viờm thận mạn tớnh và suy thận (đạthiệu quả từ 44,7-70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết ỏp,viờm mũi dị ứng, viờm gan B mạn tớnh (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi (cú tỏcdụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57-64,15%) [11,12,13].
4.1 Cải thiện chức năng gan:
Cỏc nhà khoa học Trung Quốc đó nghiờn cứu thực hiện trờn 70 bệnh nhõnviờm gan B món tớnh và xơ gan, khi sử dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảodược với thành phần chớnh là nấm linh chi, kết quả cho thấy cú 68 % người bệnhcú phản ứng lõm sàng tốt (với nhúm sử dụng ĐTHT) và chỉ cú 57 % phản ứng tốt(với nhúm hổn hợp thảo dược chứa nấm Linh chi) Điều này cho thấy nấm Đụngtrựng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc điều trị bệnh gan hay xơ gan chongười [14]
Thớ nghiệm khỏc cũng được thực hiện trờn 22 bệnh nhõn xơ gan ở liềulượng 6 g/ngày cũng cho kết quả rất khả quan khi thử nghiệm cỏc chức năng gansau thời gian điều trị bằng Đụng trựng hạ thảo [10].
4.2 Giải độc cho thận:
Bỏc sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT cú tỏc dụng làm tăng chức năngthận Rất nhiều cụng trỡnh y học hiện đại xỏc nhõn là nhờ nấm cú khả năng làm
tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết Thực hiện
trờn 51 bệnh nhõn bị hỏng thận món tớnh, theo liệu trỡnh điều trị từ 3-5 g ĐTHT/ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đỏng kể Mặt khỏc chứcnăng của hệ miễn dịch cũng được nõng cao hơn so với nhúm đối chứng Một
nghiờn cứu khỏc trờn 57 bệnh nhõn bị hỏng thận do sử dụng gentamixin , người
Trang 14đụng trựng hạ thảo với lượng 3-5 g/ngày thỡ nhận thấy chức năng thận và hệmiễn dịch được cải thiện Thử nghiệm trờn 69 bệnh nhõn ghộp thận, kết quả là
nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps đó làm giảm độc tớnh của Cyclosporine trờn
thận [9,10].
4.3 Hiệu quả giảm đường huyết:
Nấm ĐTHT cú hiệu quả với hệ thống chuyển húa glucose mỏu Cỏc nhà khoahọc nghiờn cứu ngẫu nhiờn cú đến 95 % bệnh nhõn được cải thiện chỉ số đườnghuyết khi sử dụng 3 g nấm/ ngày Hiệu quả này đạt được là do tỏc dụng của nấmĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và cỏc emzyme chuyển húa
glucose gan, glucokinase và hexokinasse Kết quả này khẳng định rằng việc sử
dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soỏt chỉ số đường huyết mà khụng gõy ra cỏcphản ứng phụ [11]
4.4 Bệnh phổi:
Tỏc dụng điều trị bệnh về đường hụ hấp của nấm ĐTHT đó được Y văn cổghi nhận từ hàng nghỡn năm nay bao gồm cỏc bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn móntớnh ( COPD ) và bệnh viờm phế quản Nghiờn cứu về lõm sàng tại trường Đạihọc Y Bắc Kinh trờn 50 bệnh nhõn hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHTnhận thấy tỡnh trạng bệnh nhõn đó được cải thiện cú khoảng 81,3 % số bệnh nhõnsau khi sử dụng nấm 5 ngày so với nhúm điều trị bằng cỏc thuốc khỏng
histamine thụng thường [13].
4.5 Bệnh tim mạch:
Nấm ĐTHT thường dựng để điều trị rối loạn nhịp tim, ngoài ra nấm cũnđược sử dụng để điều trị bệnh tim, hay hồi phục sau khi đột quỵ Với cỏc bệnhnhõn suy tim món tớnh thỡ việc sử dụng nấm ĐTHT dài ngày và điều trị thụng
thường với cỏc loại thuốc như Dioxin, hydrochlorothiazide, Dopamine, và
Dobutamine sẽ thỳc đẩy việc cải thiện chất lượng cuộc sống núi chung, bao gồm
cả thể chất lẫn tinh thần, sinh lý và chức năng tim mạch.
Trang 154.6 Nõng cao khả năng miễn dịch:
Thớ nghiệm ở 61 bệnh nhõn bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việcdựng nấm Đụng trựng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với lượng
0,6 g/ngày đó làm giảm căn bệnh trờn [9]
4.7 Hỗ trợ điều trị ung thư:
Nhiều nghiờn cứu lõm sàng được tiến hành tại Trung Quốc và Nhật Bản trờnnhững bệnh nhõn bị ung thư cho kết quả khả quan Nghiờn cứu trờn 50 bệnh nhõnung thư phổi đó được uống 6 g nấm ĐTHT/ ngày, cựng với liệu phỏp vật lý trịliệu thỡ khối u đó giảm đi ở 23 bệnh nhõn chiếm 46 % Nghiờn cứu trờn một sốcỏc bệnh nhõn bị cỏc dạng ung thư khỏc nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong 2thỏng với liều lượng là 6 g/ ngày, kết quả cho thấy cú cải thiện về triệu chứngtrờn đa số bệnh nhõn Số lượng tế bào mỏu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm3;ngay cả khi sử dụng liệu phỏp chiếu xạ hay húa chất thỡ cỏc tham số miễn dịch cơthể đó khụng bị thay đổi đỏng kể trong khi kớch thước khối u giảm đi nhiều trờnmột nửa bệnh nhõn Như vậy việc kết hợp sử dụng nấm ĐTHT với cỏc liệu phỏphúa trị cho kết quả khả quan giảm tỏc dụng phụ của cỏc liệu phỏp trờn [11,12].
4.8 Chống rối loạn tỡnh dục:
Trang 164.9 Tăng sức bền, chống mệt mỏi:
Theo bỏo điện tử thỡ khi sử dụng mỗi ngày liều 3 g nấm Đụng trựng hạ thảothỡ kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị cỏc bệnh móntớnh Năm 2004, tại Mỹ cỏc nhà khoa học đó thớ nghiệm cho người 40 - 70 tuổi,nếu dựng nấm Đụng trựng hạ thảo trong 12 tuần thỡ cú sự gia tăng sức bền thểlực Sự gia tăng sức mạnh được thể hiện ở cả hai yếu tố đú là gia tăng
Adenosine Triphophate ( ATP ) và giải phúng năng lượng trong ty lạp thể của tế
bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quỏ trỡnh giải phúngnăng lượng [9].
4.10 Chống lóo húa:
Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide Dismutase ) là chất chống
oxy húa cao, nờn nú cú tỏc dụng làm chậm quỏ trỡnh lóo húa của cơ thể.
V Cụng nghệ sản xuất nấm Đụng trựng hạ thảo và sản phẩm sử dụng:
Hiện nay nấm ĐTHT đó đợc rất nhiều nớc trên thế giới sản xuất thành viờndược liệu thực phẩm chức năng cho người trên quy mô công nghiệp nh TrungQuốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ và Malaysia Nấm ĐTHT được sản xuất trên môitrờng nhân tạo tốt hơn nhiều so với ĐTHT thu đợc ở ngoài tự nhiên Có rất nhiềusản phẩm đợc sản xuất từ nấm ĐTHT và đợc bán khắp mọi nơi trên thế giới.
5.1 Sản phẩm CORDY-CGB:
Dạng đúng gúi: 90 viờn nang/ hộp gồm 500 mg Đụng trựng hạ thảo Tổng
cộng cú 45 gam Đụng trựng hạ thảo / hộp Bột Đụng trựng hạ thảo cú chất lượng
cao với hàm lượng Adenosine > 0.25 %, Mannitol > 7 % và Polysacchyride > 10
% Mỗi ngày sử dụng khoảng 4-6 viờn, trường hợp hỗ trợ điều trị xơ gan, suythận, suy gan hay ung thư thỡ dựng liều lượng gấp 2 lần [11].
Trang 17CODYCAP được sản xuất hoàn toàn từ Cordyceps Cephalosporium Mycelia
nguyờn chất, nguồn nguyờn liệu tốt nhất từ nhà cung cấp nguyờn liệu Đụng trựng
hạ thảo Đặc điểm vượt trội của CODYCAP là hàm lượng rất cao Adenosinetrong thành phần (5,088.90 mcg/g) (Tài liệu nghiờn cứu thực tế bởi BIOFACT
LIFE; Analytica Chimica Acta 567 (2006) 218-228) giỳp cơ thể luụn dồi dào
năng lượng để hoạt động hiệu quả và nhanh chúng xoỏ đi cỏc triệu chứng mệt
mỏi Sản phẩm CODYCAP được chỉ định trong mọi trường hợp, dựng 2
viờn/ngày/2 lần [10, 11]
VI Nghiờn cứu nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam
Hiện nay ở nước ta nghiờn cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới
đạt được một số kết quả Việc nghiờn cứu mới chỉ mang tớnh chất điều tra, phỏthiện và thu thập chỳng trong điều kiện Việt Nam.
Năm 2009, Viện Khoa Học Lõm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học Lõm
Nghiệp đó tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo
tồn Tõy Yờn Tử - Sơn Động - Bắc Giang Tỏc giả Phạm Quang Thu đó thụng bỏophỏt hiện được loài nấm Đụng trựng hạ thảo và được giỏm định là loài
Cordyceps nutans Đõy là loài nấm đầu tiờn được mụ tả và ghi nhận cú phõn bố
tại Việt Nam [1].
Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phỳc Phạm Quang Thu đó phỏt hiện nấm
ĐTHT Cordyceps Gunnii [2].
Tại vườn Quốc gia Hồng Liờn, tỉnh Lào Cai đó phỏt hiện nấm ĐTHT
Cordyceps militari (Nấm nhộng trùng thảo) [3].
Năm 2009, Phạm Thị Thựy đó thu thập ở vườn Quốc gia Cỳc Phương, tỉnh
Ninh Bỡnh nguồn nấm Cordyceps [6].
Về nấm Nhộng trựng thảo Cordyceps militaris lần đầu tiờn được phỏt hiện và
mụ tả ở Việt Nam [1,2] Loài nấm này phõn bố ở rừng tự nhiờn cú độ cao từ1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển Ký chủ của loài này là nhộng thuộc
Trang 18nhỏ, phần đầu( phần sinh sản) phỡnh to cú chiều rộng đến 0,6 cm Màu sắc củaphần cuống nấm và phần sinh sản khỏc nhau, phần cuống nấm nhẵn cú màu dacam nhạt, phần sinh sản cú màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ Thể quả dạngchai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sõu một phần vào mụ của nấm ở phần sinhsản Tỳi bào tử cú kớch thước 300 – 510 à x 3,5 – 5à, phần mũ gắn trờn tỳi thểquả cú kớch thước 3,5 – 5 à [3]
Một số khu vực khỏc cũng đang được triển khai tỡm kiếm và nghiờn cứu
nấm Cordyceps, thường thỡ Cordyceps ở Việt Nam phõn bố ở những khu rừng
nhiệt đới thường xanh, cú độ cao từ 800 m đến 2000 m.
Trong chương trỡnh nghiờn cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc
cấp nhà nước về nghiờn cứu nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militarris
PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đó chủ trỡ đề tài phỏt triển nấmĐụng trựng hạ thảo làm nguyờn liệu thực phẩm chức năng cho người Kết quả đónghiờn cứu và xỏc định được 3 loài nấm Đụng trựng hạ thảo đú là:
- Cordyceps nutans ở Cỳc Phương, Ninh Bỡnh và Tam Đảo, Vĩnh Phỳc.- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh.
- Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang.
Tỏc giả cũng đó xỏc định được một số giỏ trị dược liệu của nấm Đụng trựng
hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và
một số nguyờn tố vi lượng Trờn đõy là một số kết quả bước đầu về việc nghiờn
cứu nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam Vỡ vậy việc nghiờn cứunấm này cần thiết được tiếp tục để đi sõu và phỏt triển những nấm Cordyceps để
làm nguyờn liệu thực phẩm chức năng cho người [5].
Như võy nghiờn cứu nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt
Trang 19PHẦN III
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIấN CỨU
I Thời gian và địa điểm nghiờn cứu1 Địa điểm:
Phũng thớ nghiệm Vi sinh vật - Viện Bảo vệ thực vật - Đụng Ngạc - Từ Liờm- Hà Nội
2 Thời gian nghiờn cứu.
Đề tài được thực hiện từ thỏng 1/2010 đến hết thỏng 5/2010
II Vật liệu nghiờn cứu1 Đối tượng nghiờn cứu.
Chủng nấm Cordyceps militaris do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ - Viện Bảo vệ
thực vật cung cấp.
2 Vật liệu nghiờn cứu.
a Một số hoỏ chất: + Agar + Pepton + Maltoza + Cao nấm men b Muối khoỏng: + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + Chất bỏm dớnh, Tween 80 (Mỹ), Agral (Nhật)
Trang 20III Nội dung và phương phỏp nghiờn cứu
1 Nội dung:
1.1 Nghiờn cứu một số mụi trường nuụi cấy nấm Cordyceps militaris để xỏcđịnh mụi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phỏt triển.
1.2 Nghiờn cứu ảnh hởng của thời gian đến sự phỏt triển của nấm Cordyceps
militaris.
1.3 Xỏc định giỏ trị dược liệu, thành phần hoỏ học của nấm Cordyceps militaris
2 Phương phỏp nghiờn cứu.
2.1 Nghiờn cứu mụi trường nuụi cấy nấm Cordyceps militaris để xỏc đinh
mụi trường tối ưu
a Một số mụi trường sử dụng:
+ Mụi trường Czapek – Dox:
- Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - NaNO3: 2 g - K2HPO4: 1 g - MgSO4.7H2O: 0.5 g - KCl: 0.5 g - H2O: 1000 ml
+ Mụi trường PDA:
- Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g
- Khoai Tõy: 300 g - H2O: 1000 ml
+ Mụi trường MYPS:
Trang 21- Cao nấm men: 4 g - H2O: 1000 ml b Phương phỏp tiến hành:
Thớ nghiệm 1: Tiến hành nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trờn 3 mụi
trường Czapek-Dox, PDA, MYPS trong thỏng 2 để xỏc định mụi trường tối ưu Bước 1: Cõn số lượng từng thành phần của 3 mụi trường
Bớc 2: Nấu từng loại môi trờng cho tancỏc thành phần nguyờn liệu, đo độ pH= 6
Bớc 3: Đổ 1/2 phần môi trờng vào ống nghiệm( 1/4 đến 1/3 ống ) và để nguội,rồi gúi lại Phần mụi trường cũn lại đổ vào bỡnh tam giỏc, mang tất cả đi khửtrựng trong thời gian 60 phỳt, 1210C (với ỏp suất 1at)
Bước 4: - Cho ra và nghiêng môi trờng ở ống nghiệm trong buồng cấy
- Rút mụi trưũng trong bỡnh tam giỏc ra đĩa petri trong buồng cấy, đểnguội.
- Sau đú để nguội và khử trựng buồng cấy bằng tia UV ( 30 phỳt đến60 phỳt ).
Bớc 5: Tiến hành cấy chấm điểm trờn đĩa petri và cấy rích rắc trờn từng ốngnghiệm.
Bớc 6: Gúi ống nghiệm và đĩa petri cấy nấm, nuôi trong tủ định ụn, theo dõihàng ngày sự phỏt triển của nấm.
Thớ nghiệm 2: Tiến hành nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trờn 2 mụi
trường PDA và MYPS trong thỏng 3 Phương phỏp như thớ nghiệm 1
Thớ nghiệm 3: Tiến hành nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trờn 2 mụi
trường PDA và MYPS trong thỏng 4 – 5 Phương phỏp như thớ nghiệm 1
c Theo dừi sự phỏt triển của nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris về
Trang 22+ Chỉ tiờu theo dừi hàng ngày:
- Quan sỏt hỡnh thỏi nấm bằng mắt thường: Quan sỏt màu sắc sự phỏt triểncủa sợi nấm cả mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc để xỏc định sắc tố Mụ tả quỏtrỡnh phỏt triển nấm.
- Theo dừi và ghi chộp nhiệt độ và ẩm độ trong phũng nuụi cấy.
- Đo đưũng kớnh khuẩn lạc: Kể từ khi nấm hỡnh thành khuẩn lạc sau
5,10,15,,20,25 ngày (dựng thước đo cm kẻ rừ) để đo đường kớnh, đo cả mặt trướcvà mặt sau của đĩa theo hai đường vuụng gúc, sau đú tớnh trị số trung bỡnh theocụng thức:
D1 + D2 D = 2
Trong đú: D: đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc
D1, D2: đường kớnh khuẩn lạc của hai đường vuụng gúc - Chụp ảnh sự phỏt triển của nấm theo thời gian phỏt triển
2.2 Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy đến sự phỏt triển của
nấm Cordyceps militaris trờn mụi trường tối ưu nhất
- Nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trờn mụi trường tối ưu nhất trong ba
khoảng thời gian khỏc nhau (thỏng 2, 3, 4)
- Theo dừi hàng ngày và đo đường kớnh khuẩn trung bỡnh của khuẩn lạcnấm ở cỏc khoảng thời gian trờn, nhận xột và mụ tả sự phỏt triển.
- Sau ba đợt thớ nghiệm so sỏnh đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấmvà rỳt ra kết luận trong khoảng thời gian, nhiệt độ, ẩm độ nào nấm phỏt triểnmạnh nhất.
Trang 232.3 Xỏc định giỏ trị dược liệu và thành phần hoỏ học của nấm Đụng trựnghạ thảo Cordyceps militaris
a Phương phỏp tiến hành:
- Nguồn nấm Cordyceps militaris làm khụ trong khụng khớ ở 400C và dựngmỏy nghiền thành bột
- Lấy 0,1 g bột trờn chiết 3 lần với nước sụi (3 x 10 ml) Lọc qua phễu vàlàm khụ lạnh để thu chất chiết suất
- Sau khi làm khụ lạnh, phần cũn lại được hoàn nguyờn trong 10 mlmethanol và lọc qua màng 0,22 àm Trước khi phõn tớch tiếp HPLC, cỏc mẫuđược hoà tan trong 10 ml cỏc dung dịch thớch hợp
- HPLC: Thể tớch mẫu 5 àl; dung dịch rửa giải methanol: 20 mMphosphoric acid = tỷ lệ 15 : 85 trong 20 phỳt, phỏt hiện tại bước súng 260 nm b Định lượng chuẩn:
Xỏc định Cordycepin hoặc Cordycepic Acid hoặc đường cụ thể bằng
hợp chất N6 -(2- hydroxyethyl) – Adenosine, đõy là chất chỉ thị để phỏt hiện
trong cỏc mẫu Cordyceps và khụng được tỡm thấy trong cỏc sinh vật Hợp chấtnày và chất Adenosine và 3’ deoxyadenosine ( Cordycepin ) được sử dụng làmchất chỉ thị chất lượng để so sỏnh cỏc chủng khỏc nhau của nấm Cordyceps
c Xỏc định một số vitamin và nguyờn tố vi lượng theo phương phỏp chungcủa phõn tớch húa học
Phần xỏc định giỏ trị dược liệu do Cụng ty cổ phần dược liệu Trung ương IIthực hiện
Trang 24PHẦN IV
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
Như chỳng ta biết, để nghiờn cứu được mụi trường nuụi cấy tối ưu nhất chocỏc loài nấm phỏt triển thỡ yếu tố quan trọng nhất quyết định là chủng giống.Trờn cơ sở cú chủng giống do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chỳng tụi đónuụi cấy và đỏnh giỏ được khả năng phỏt triển của nấm Đụng trựng hạ thảo
Cordyceps militaris trờn ba mụi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS Từ đú xỏc
định được mụi trường tối ưu nhất cho nấm Cordyceps militaris phỏt triển
I Nghiờn cứu mụi trường nuụi cấy nấm Cordyceps militaris để xỏc định mụi
trường tối ưu
Mụi trường nuụi cấy là yếu tố cú tớnh chất quyết định đến sự phỏt triển và
hỡnh thành bào tử nấm Mụi trường thớch hợp nhất là mụi trường ở đú nấm phỏttriển mạnh, thể hiện ở đường kớnh khuẩn lạc lớn nhất và tạo ra số lượng bào tửnhiều nhất
Để xỏc định mụi trường tối ưu cho sự phỏt triển của nấm Cordyceps militais,
như phần vật liệu và phương phỏp đó trỡnh bày, chỳng tụi tiến hành nuụi cấy nấmtrờn ba loại mụi trường: Czapek-Dox, PDA và MYPS Kết quả nghiờn cứu củachỳng tụi được trỡnh bày ở bảng 1
Bảng 1: Ảnh hưởng của cỏc mụi trường nuụi cấyđến sự phỏt triển của nấm Cordyceps militaris
Trang 25Qua kết quả ở bảng 1 cho thấy: trong ba mụi trường nghiờn cứu trờn thỡ nấm
Cordyceps militaris phỏt triển cú khỏc nhau trờn từng mụi trường So sỏnh sự
phỏt triển của nấm trờn cỏc mụi trường nuụi cấy chỳng tụi nhận thấy:
- Trờn mụi trường Czapek-Dox, nấm Cordyceps militaris phỏt triển yếu, gần
như là khụng phỏt triển Sau 5 ngày nuụi cấy 10 đĩa thạch của mụi trường này thỡnấm mới bắt đầu mọc ở 1 đĩa và chỉ cú 1 chấm trắng nhỏ Theo thời gian nuụicấy, sau 10 ngày nấm khụng phỏt triển, đến ngày 25 nấm cũng khụng phỏt triển.Như vậy mụi trường Czapek-Dox là khụng thớch hợp để nuụi cấy nấm
Cordyceps militaris
- Trờn mụi trường PDA, chỉ sau 3 ngày nuụi cấy, nấm Cordyceps militaris
đó bắt đầu hỡnh thành khuẩn lạc, kớch thước khuẩn lạc tăng dần theo thời gian.Quan sỏt thấy bề mặt khuẩn lạc phồng xốp, nấm chưa ăn sõu vào mụi trường, mặtsau khuẩn lạc phẳng, cú màu trắng Sau 10 ngày nuụi cấy thỡ đường kớnh khuẩnlạc phỏt triển nhanh đến ngày thứ 25, bề mặt khuẩn lạc lừm xuống, mặt saukhuẩn lạc mụi trường cú sắc tố màu vàng trắng ngà với nhiều mỳi khớa.
- Trờn mụi trường MYPS thỡ nấm Cordyceps militaris phỏt triển mạnh nhất,
theo chỳng tụi mụi trường này cú đủ thành phần dinh dưỡng giống như trongnhộng và sõu sống trong đất Qua quan sỏt thấy bề mặt thạch ở mặt trước của đĩapetri, chỳng tụi thấy sợi nấm ban đầu màu trắng xỏm, sau đú chuyển sang màutrắng xỏm vàng, sợi bụng xốp, hơi ngắn, mọc chằng chịt và bỏm chặt vào mặtthạch Quan sỏt mặt sau thấy sắc tố của nấm cú màu vàng sỏng, cú mỳi khớa màuvàng đậm
Để dễ dàng quan sỏt, trong quỏ trỡnh thớ nghiệm, chỳng tụi đó chụp được
hỡnh ảnh về sự phỏt triển trờn ba mụi trường của nấm Cordyceps militaris, kết
Trang 26Hỡnh 2a: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaristrờn ba loại mụi trường sau 20 ngày nuụi cấy
Trang 27Qua bảng 1 và hỡnh 2a, 2b chỳng tụi khẳng định mụi trường MYPS là mụi
trường cho nấm Cordyceps militaris phỏt triển tốt nhất, thứ 2 là mụi trường PDA,
nấm khụng phỏt triển trờn mụi trường Czapek-Dox
II So sỏnh khả năng phỏt triển của nấm Cordyceps militaris trờn hai mụi
trường PDA và MYPS
Qua thớ nghiệm 1, chỳng tụi rỳt ra được kết luận mụi trường MYPS là mụi
trường tốt nhất cho nấm Cordyceps militaris phỏt triển Nhưng vỡ chưa cú số liệu
cụ thể, nờn chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm 2 là so sỏnh khả năng phỏt triển của
nấm Cordyceps militaris trờn hai mụi trường PDA và MYPS để đưa ra kết quảchớnh xỏc về mụi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phỏt triển Kết quả
nghiờn cứu thu được trỡnh bày ở bảng 2
Bảng 2: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycep militaris
nuụi cấy trờn hai mụi trường PDA, MYPS
Mụitrường
nuụicấy
Đường kớnh KL nấm (mm) qua cỏc ngày nuụi cấyNhiệtđộtrungbỡnh(0C)Ẩm độtrungbỡnh(%)5 10 15 20 25PDA 10,5 17,0 23,0 28,5 33,524,7 84,2MYPS 13,5 22,0 30,5 36,0 42,0
Kết quả ở bảng 2 chỳng tụi nhận thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bỡnh là24,70C và độ ẩm trung bỡnh là 84,2% thỡ nấm Cordyceps militaris phỏt triển như
sau:
- Trờn mụi trường PDA:
+ Sau 5 ngày nuụi cấy, khuẩn lạc cú đường kớnh trung bỡnh là 10,5 mm.
Trang 28+ Sau 25 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc đạt 33,5 mm + Ngày thứ 26 khuẩn lạc nấmbắt đầu phỏt triển chậm và gần như khụng phỏttriển nữa
- Trờn mụi trường MYPS nấm Cordyceps militaris phỏt triển nhanh hơn hẳn so
trờn mụi trường PDA Khuẩn lạc nấm phỏt triển mạnh trong 25 ngày đầu tiờn Cứsau 5 ngày nuụi cấy đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm ở mụi trườngMYPS tăng lờn trung bỡnh từ 3-5 mm so với mụi trường PDA, cụ thể:
+ Sau 5 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 13,5 mm + Sau 10 ngày nuụi cấy, đường kỡnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 22 mm + Sau 15 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 30,5 mm + Sau 20 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 36 mm + Sau 25 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 42 mm + Sau 26 ngày thỡ khuẩn lạc nấm phỏt triển chậm dần
Như vậy qua số liệu cụ thể cho thấy nấm Cordyceps militaris phỏt triển trờn
mụi trường MYPS là mạnh nhất Vỡ thế chỳng tụi đi sõu vào nghiờn cứu mụitrường này.
Trang 29
Hỡnh 2: Sự phỏt triển của nấm Cordyceps militaris
trờn hai mụi trường PDA và MYPS sau 20 ngày nuụi cấy
05101520253035404550510152025PDAMYPS
Hỡnh 3: Sự phỏt triển của nấm Cordyceps militaris trờn hai mụi trường PDA và MYPS
Trang 30III Mụ tả một số đặc điểm của nấm Cordyceps militaris phỏt triển trờn mụi
trường MYPS
Sau khi đó lựa chọn được mụi trường tối ưu nhất cho sự phỏt triển và hỡnh
thành bào tử nấm Cordycpes militaris đú là mụi trường MYPS Dựa trờn chủng
nấm do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chỳng tụi đó sử dụng mụi trường này
để nuụi cấy nấm Cordyceps militaris
Bằng phương phỏp quan sỏt bằng mắt thường về sự phỏt triển của nấm,chỳng tụi nhận thấy lỳc đầu sợi nấm cú màu trắng, xốp, sau chuyển sang màutrắng ngà, rồi vàng, nấm ăn sõu vào mụi trường, mặt sau khuẩn lạc nấm cú nhữngkhớa màu vàng tạo thành nhiều mỳi Kết quả quan sỏt về hỡnh thỏi nấm Đụng
trựng hạ thảo Cordyceps militaris chỳng tụi trỡnh bày lờn bảng 3.
Bảng 3: Mụ tả một số đặc điểm hỡnh thỏi của nấm Cordycpes militarisphỏt triển trờn mụi trường MYPS đến 25 ngày nuụi cấy
Tốc độ phỏt triển củakhuẩn lạcQuan sỏt màu sắc bề mặtkhuẩn lạcQuan sỏt sắc tố củakhuẩn lạc
Sau 2 ngày ở điều kiệnnhiệt độ 24,50C, độ ẩm82% thấy khuẩn lạc bắtđầu hỡnh thành và chỳngphỏt triển mạnh từ ngàythứ 5 đến ngày thứ 25.- Khuẩn lạc cú hỡnh trũn.- Lỳc đầu khuẩn lạc cú màu trắng xỏm, đến ngày thứ 7 khuẩn lạc chuyến sang màu trắng ngà và sau 10 ngày thỡ khuẩn lạc cú màu trắng hồng.
- Sợi nấm bụng xốp, hơi ngắn, tỏa trũn, phỏt triển chằng chịt trờn đĩa thạch vàmọc nhụ lờn, bỏm chặt vào mặt thạch (hỡnh 5a).
Do sợi nấm ăn sõu vàomụi trường nờn mặt sautạo thành cỏc khớa, chiara thành nhiều mỳi Lỳcđầu cú sắc tố màu vàng,sau biến thành màu vàngđậm và cuối cựng chuyểnthành màu vàng nõu, lừm
ở tõm đĩa (hỡnh 5b).
Chỳng tụi cũng chụp hỡnh ảnh nấm Cordyceps militaris phỏt triển trờn mụi
Trang 31Hỡnh 5a: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaristrờn mụi trường MYPS (mặt trước)
trờn mụi trường MYPS (mặt trước)
Hỡnh 5b: Sắc tố của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris
IV Nghiờn cứu sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trờn
Trang 32Qua hai thớ nghiệm trờn đó xỏc định được mụi trường MYPS là tối ưu nhất
cho nấm Cordycep militaris phỏt triển Chỳng tụi tiến hành đi sõu vào nghiờn cứu
nuụi cấy nấm trờn mụi trường này Kết quả thớ nghiệm về sự phỏt triển của nấmtrong thỏng 2 được trỡnh bày ở bảng 3.
Bảng 4: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trờnmụi trường MYPS ( Thớ nghiệm thỏng 2)
Lầnnhắc
lại
Sự phỏt triển của KL nấm (mm) sau thời giannuụi cấyNhiệtđộtrungbỡnh(0C)Ẩm độtrungbỡnh(%)5 10 15 20 251 11,0 20,0 29,0 33,5 37,023,1 852 10,5 19,5 27,5 31,0 33,53 11,0 15,0 30,5 34,5 37,5TB10,818,229,033,036,0
Kết quả ở bảng 4 cho thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bỡnh 23,10C và độ ẩm
trung bỡnh 85% trờn mụi trường MYPS nấm Cordyceps militaris phỏt triển cho
kết quả cụ thể như sau:
- Sau 5 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là10,8 mm.
- Sau 10 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là18,2 mm.
- Sau 15 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là29 mm.
- Sau 20 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là33 mm.
Trang 33- Từ ngày thứ 26 khuẩn lạc nấm phỏt triển chậm và gần như khụng phỏt triển.
Duới đõy là hỡnh ảnh nấm Cordyceps militaris đang phỏt triển trờn mụi trường
MYPS trong thỏng 2 (hỡnh 6)
Hỡnh6: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trờn
mụi trường MYPS sau 8 ngày nuụi cấy trong điều kiện T0= 23,10C, H%=85%
Thớ nghiệm nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trong điều kiện thỏng 3, kết
quả thu được ở bảng 5
Bảng 5: Sự phỏt triển của khuản lạc nấm Cordyceps militaris trờnmụi trường MYPS ( Thớ nghiệm thỏng 3)
Sự phỏt triển của KL nấm (mm) sau thời gian
Nhiệtđộ
Trang 34Lầnnhắclạinuụi cấytrungbỡnh(0C)bỡnh(%)5 10 15 20 251 12,0 21,0 30,5 35,5 40,024,1 84,52 11,5 20,0 27,0 39,0 43,03 9,0 20,0 26,0 40,0 45,0TB11,020,329,038,043,0
Thớ nghiờm nuụi cấy nấm tiến hành trong thỏng 3 với điều kiện nhiệt độ trungbỡnh 24,10C và độ ẩm trung bỡnh 84,5 %cho thấy nấm Cordyceps militaris phỏt
triển trờn mụi trường MYPS mạnh hơn Cụ th ể:
- Sau 5 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là11 mm
- Sau 10 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là20,3 mm
- Sau 15 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là29 mm
- Sau 20 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là38 mm
- Sau 25 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt được là43 mm
Dưới đõy là hỡnh ảnh chỳng tụi chụp được khi nấm phỏt triển trờn mụi trườngMYPS trong điều kiện thỏng 3 (hỡnh 7)
Trang 35
Hỡnh 7 b: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaristrờn mụi trường MYPS sau 10 ngày nuụi cấy
Qua hỡnh ảnh chỳng tụi thấy nấm Cordyceps militaris đó phỏt triển tốt trong
điều kiờn nhiệt độ 24,10C , ảm độ 84,5%
Thớ nghiệm nuụi cấy nấm Cordyceps militaris trong điều kiện thỏng 4, kết quả
Trang 36Bảng 6: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trờnmụi trường MYPS ( Thớ nghiệm thỏng 4)
Lầnnhắc
lại
Sự phỏt triển của KL nấm (mm) sau thời giannuụi cấyNhiệtđộtrungbỡnh(0C)Âm độtrungbỡnh(%)5 10 15 20 25 1 15,0 26,0 36,0 46,0 46,026,2 832 12,0 23,0 33,0 41,0 42,03 10,5 25,0 34,0 43,0 45,0TB12,524,734,343,345,0
Bảng số liệu trờn cho thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bỡnh 26,20C và độ ẩm
trung bỡnh là 83% thỡ nấm Cordyceps militaris phỏt triển tốt nhất Kết quả cụ thể
đạt cao nhất:
- Sau 5 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 12,5 mm - Sau 10 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 24,7 mm - Sau 15 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 34,3 mm - Sau 20 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 43,3 mm - Sau 25 ngày nuụi cấy, đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm đạt 45 mm Kết quả dừng lại sau 25 ngày nuụi cấy nấm, vỡ ngày thứ 26 khúm nấm phỏttriển rất chậm.
Trang 37
Hỡnh 8a: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trờnmụi trường MYPS sau 10 ngày trong thỏng 4
Trang 38Hỡnh 8b: Sự phỏt triển của khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris trờnmụi trường MYPS sau 10 ngày trong thỏng 4
Rừ ràng là yếu tố nhiệt độ và ẩm độ cú ảnh hưởng rừ rệt đến sự phỏt triển của
nấm Cordyceps militaris
Trang 39Như trờn đó trỡnh bày, nhiệt độ và ẩm độ cú ảnh hưởng lớn đến sự phỏt triển
của đường kớnh khuẩn lạc nấm Cordycpes militaris Vỡ thế qua cỏc thớ nghiệm
trờn, chỳng tụi tổng hợp kết quả ghi được ở bảng 7
Bảng 7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến sự phỏt triểncủa nấm Cordyceps militaris nuụi cấy trờn mụi trường MYPS
Đợt TN
Đường kớnh KL nấm (mm) sau cỏc ngày nuụicấyNhiệtđộtrungbỡnh(0C)Ẩm độtrungbỡnh( % )5 10 15 20 25 1 10,8 18,2 29,0 33,0 36,0 23,1 85,02 11,0 20,0 29,0 38,0 43,0 24,1 84,53 12,5 24,7 34,3 43,3 45,0 26,2 83,0
Kết quả ở bảng 7, chỳng tụi rỳt ra được một số nhận xột sau:
- Nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris phỏt triển tốt trờn mụi trường
MYPS, trong điều kiện nhiệt độ trung bỡnh 26,2 0C và độ ẩm trung bỡnh 83 %,kết quả đạt được sau 25 ngày nuụi cấy đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấmđạt được là 45 mm.
- Nấm phỏt triển trong điều kiện nhiệt độ trung bỡnh 24,1 0C và độ ẩm trungbỡnh 84,5 % nhanh thứ 2, kết quả sau 25 ngày nuụi cấy đường kớnh trung bỡnhcủa khuẩn lạc nấm đạt được 43 mm
- Nấm phỏt triển chậm nhất ở thỏng 2 trong điều kiện thời tiết mỏt mẻ hơn,nhiệt độ trung bỡnh 23,1 0C và độ ẩm trung bỡnh 85 % thỡ sau 25 ngày nuụi cấy,đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc nấm chỉ đạt được 36 mm.
Kết quả trờn đó khẳng định nhiệt độ thớch hợp cho nấm Cordyceps militaris
phỏt triển tốt là trong điều kiện nhiệt độ 26,20C và ẩm độ 83%.
Trang 40Đường kớnh trung bỡnh của khuẩn lạc (mm)05101520253035404550510152025Đợt 1Đợt 2Đợt 3
Hỡnh 9: Thời gian nuụi cấy ảnh hưởng đến sự phỏt triểncủa nấm Đụng trựng hạ thảo Cordyceps militaris Ghi chỳ: - Đợt 1: T0 = 23,10C; H% = 85%
- Đợt 2: T0 = 24,10C; H% = 84,5%
- Đợt 3: T0C = 26,20C; H% = 83%